广东湛江地区真菌性角膜炎病原菌的分离鉴定和分析
摘要:目的 了解广东湛江地区引起真菌性角膜炎的病原真菌的分布情况。 方法 对70例疑患真菌性角膜炎的患者，取病变角膜上皮组织，分别进行真菌直接涂片镜检和真菌培养，并对检查阳性者进行菌种鉴定。 结果 70例病眼患者均检出真菌，涂片镜检真菌阳性67份，阳性率为95.7%，真菌培养阳性65份，阳性率92.9%，总一致性为89.6%。检出菌种分属14个属26个种，其中镰刀菌属22株(33.8%)，弯孢霉属20株(30.8%)、曲霉属4株(6.2%)，球孢子菌属4株(6.2%)，其他菌属15株(23.1%)。 结论 北热带的广东湛江地区真菌性角膜炎主要致病菌属为镰刀菌属和弯孢霉属，主要菌种以新月弯孢霉最多见。
关键词:角膜炎;真菌;分离;鉴定
Isolation and analysis of fungi of mycotic keratitis in Zhanjiang area，Guangdong Province.
LI Ding，HUANG Wen-ming，SHI Jian-qiang，et al.
(Department of Dermatosis of Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang524001，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To understand the distribution fungi responsible for mycotic keratitis in Zhanjiang area，Guangdong Province. Methods The epithelial tissue specimens from70mycotic keratitis patients were taken，cultured and detected under light microscope for identification of fungus species. Results Fungi were detected from70patients and67were detected by light microscope with a positive rate of95.7%and65were positive by culture with a positive rate of92.9%.Totally26species of Fungi belonging to14genera were detected from70patients，including22strains belong to Fusarium(33.8%)，20strains belong to Curvularia(30.8%)，4strains belong to Aspergillus(6.2)，4strains belong to Coccidiodes(6.2%)and15strains belong to other genera(23.1%). Conclusion Fusarium and Curvularia are the main pathogenic fungi causing mycotic keratitis in Zhanjiang area，the main strain is C.lunata.
Key words:Keratitis;Fungus;Isolation;Identification
真菌性角膜炎是严重的致盲性眼病之一，其患病率在我国呈逐年迅速上升趋势。自2003年10月～2004年12月，我们对湛江地区70例拟诊真菌性角膜炎患者病眼组织做了较完整的真菌镜检、培养和菌种鉴定研究，现对其结果作一分析。
1 材料与方法
1.1 病例资料 70例拟诊真菌性角膜炎患者均来自湛江地区，均为单眼患病，左右眼各35例，其中男性50例，女性20例，年龄14～85岁，平均年龄49.1岁，其中20～50岁41例。病程3d～2月，平均15.2d。职业:农民62例，工人7例，学生1例。较肯定有异物伤眼史45例，无明显异物史25例。异物中谷粒或谷尘19例、泥土4例、木屑4例、甘蔗叶2例、焊屑2例，13例可疑尘埃。
1.2 标本采集 用1%的卡因做病眼角膜表面麻醉2min后，用无菌手术刀刮取角膜溃疡组织，置于含少量无菌生理盐水的无菌离心管中送检。
1.3 真菌涂片 用无菌白金耳挑取适量送检的角膜组织于载玻片上，加1滴10%KOH液，盖上盖玻片，显微镜下查找真菌。
1.4 真菌培养 将余下的角膜组织标本直接接种于2支沙保氏(SDA)琼脂斜面培养基上，置于27℃温箱孵育2周，观察有否真菌生长。
1.5 菌种鉴定 凡2支SDA琼脂斜面上均有真菌生长，并且菌落形态一致者，取其真菌菌落同时接种马玲薯葡萄糖琼脂和SDA琼脂做小培养，置于27℃温箱中，培养48～72h后，每天镜下观察真菌菌丝和分生孢子生长情况，依据菌丝、分生孢子的形态和结构特点，与文献中标准菌株的形态对照 [1，2] ，进行菌种鉴定。
2 结果
70份标本中均检出真菌，其中真菌涂片镜检阳性67份，阴性3份，真菌培养阳性65份，阴性5份。培养阴性的5份标本，其真菌涂片均阳性，3份涂片阴性标本，真菌培养均为阳性。65份真菌培养阳性标本中检出菌种分属14个属26个种，其中阳性分离率最高的为镰刀菌属22例，分属10个种，其中茄病镰刀菌最多(8株);其次为弯孢霉属，占20例，均为新月弯孢霉。详细结果见表1。主要分离菌株的形态特点是:茄病镰刀菌，大分生孢子近镰刀形，壁厚，2～5隔，3隔居多，顶端细胞短，窄细或钝圆，呈喙状(图1);新月弯孢霉分生孢子孔生，弯曲如小船状，具3个分隔，中间细胞显著增大，壁厚，呈褐色(图2);烟曲霉以烧瓶形顶囊，单层小梗及直柱状孢子头为特征(图3);粗球孢子菌菌丝分枝分隔，长方形的节孢子和孢间连体为特征(图4)。
图1 茄病镰刀菌F.solani(40x10)(略)
图2 新月弯孢菌C.lunata(40x10)(略)
图3 烟曲霉A.fumigatus(40x10)(略)
图4 粗球孢子菌C.immitis(400x)(略)
表1 65例真菌性角膜炎病原性真菌的分离鉴定结果(略)
3 讨论
3.1 发病特点 本组病例中，患者主要为农民，占88.6%(62/70)，发病年龄以青壮年(20～50岁)居多(58.6%)，男性占优(71.4%)，发病有明显的季节性，以每年1～3月份和10～12月份最多见，为本地区春耕和秋收季节。大多数患者(64.3%)有异物伤眼史，异物以谷粒或谷尘最多见(27.1%)，其次为尘埃(18.6%)、泥土、木屑、植物等因素。患者多为在生产劳动中、或日常生活中因异物伤眼而发病，尤其近年来，本地区农村都采用机械脱谷粒，谷粒伤眼而引起角膜炎者明显增多。所以，改善生产、生活条件，在劳动作业中，采取积极的防护措施(如戴眼镜)是降低本病发病率的关键。从检出的菌种中可看出，引起本病的真菌较广泛，为条件致病菌，广泛存在于自然界的土壤和空气中。本地区属北热带亚湿润气候，常年平均温度较高(22.5℃～24℃)，湿度较大(年平均相对湿度82%)，有利于真菌的生长，亦可能是本地区真菌性角膜炎发病率较高的原因之一。
3.2 早期诊断 真菌性角膜炎临床表现较复杂，缺乏特征性，单靠临床诊断很困难。对患角膜炎或角膜溃疡患者，尤其有眼部外伤或异物伤眼史者，应首先做真菌直接镜检，以初步明确诊断。但因角膜组织涂片直接镜检所见的真菌多为分支分隔粗大菌丝，一般无特征性，对鉴定菌种帮助不大。而小培养方法可动态观察到菌丝和分生孢子的形态和结构特点，对菌种的鉴定和明确诊断具有重要的意义。本组病例，角膜组织真菌直接镜检阳性率达95.7%，真菌培养阳性率为92.9%，结果总的一致性为89.6%。可见，角膜组织涂片直接镜检查找真菌，具有简单、快捷、价廉、可靠的优点。我们的经验认为，影响真菌检出结果的最主要因素是取材，应尽量取角膜深层上皮及溃疡边缘组织。有条件的单位，应做真菌培养，明确致病菌种。
3.3 致病菌种分布特点 本地区65例真菌性角膜病中检出的病原真菌有14个属26个种。主要致病菌属依次为镰刀菌属(33.8%)(22/65)，弯孢霉属(30.8%)(20/65)，曲霉属(6.2%)(4/65)和球孢子菌属(6.2%)(4/65)。镰刀菌属中，以茄病镰刀菌最多见(8株)。弯孢霉属仅见新月弯孢霉。国内文献报道 [3，4]，石家庄市区、郑州地区真菌性角膜病的致病菌属前3位相同，依次为镰刀菌属(33.3%和65.1%)，曲霉属(21.1%和20.5%)和青霉属(11.6%和3.6%)。广州市区1975年1月～1986年12月调查结果，角膜病主要致病菌属为曲霉属(48.5%)、镰刀菌属(27.7%)和青霉属(14.2%)。而1987年7月～1997年6月，则菌种变迁为镰刀菌属(39.2%)，曲霉属(30.7%)和弯孢霉属(13.1%)。上海市的真菌性角膜病致病菌属则主 要为曲霉属(60.3%)和镰刀属(21.1%) [5] 。而在美国真菌性角膜炎南部以镰刀菌最常见，北方则以念珠菌为主 [6] 。在印度 [7] 和英国 [8] 以曲霉属为主要致病菌。由此可见，引起真菌性角膜病的主要致病真菌存在明显的地域性差异，这可能与地理位置、气候条件、经济水平和生产环境等因素有关。
在地理位置上，湛江地区与广州较接近，但所见的曲霉菌属较广州市区少见，而弯孢霉属较多见。单一菌种中，本地区以新月弯孢霉最多见(30.8%)，其次为茄病镰刀菌(12.3%)，与其他地区差别较大。另外，本地区真菌性角膜病中还检出粗球孢子菌、丛生菌、顶套菌、分枝着色霉菌、冠虫霉、面包串珠霉、树状指孢霉、峡串孢霉属等少见菌属(种)，国内其他地区未见报道，提示该地区引起的真菌性角膜病的菌种可能更为丰富，有待更进一步的研究。
参考文献:
[1]孙鹤龄主编.医学真菌鉴定初稿[M].第1版.北京:科学出版社，1987，7.
[2]叶世泰，乔秉善，路英杰编著.中国致敏空气真菌学[M].第1版.北京:人民卫生出版社，1992，1.
[3]王丽娅，张月琴，王印其，等.中国三地区真菌性角膜病致病菌种的调查[J].中华眼科杂志，2000，36(2):138～140.
[4]卢嘉彪，陈家祺，王丽娅.广州地区真菌性角膜病的病原体及其发病情况的变迁[J].眼科研究，1998，16(4):289～291.
[5]范德彰，蔡松年.真菌性角膜溃疡318例临床分析[J].中华眼科杂志，1981，17(6):321～326.
[6]O'Day DM.Selection of appropriate antifungal therapy[J].Cornea，1987，6:238～245.
[7]Koul RL，Pratap VB.Keratomycosis in Lucknow[J].Br J Ophthalmol，1975，59:47～51.
[8]Jones BR.Principles in the management of ocular mycosis[J].Am J Oph-thalmol，1975，79:719～751, http://www.100md.com(李定，黄文明，史建强，吴国凤，李瑞庄，严灿荣)
关键词:角膜炎;真菌;分离;鉴定
Isolation and analysis of fungi of mycotic keratitis in Zhanjiang area，Guangdong Province.
LI Ding，HUANG Wen-ming，SHI Jian-qiang，et al.
(Department of Dermatosis of Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang524001，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To understand the distribution fungi responsible for mycotic keratitis in Zhanjiang area，Guangdong Province. Methods The epithelial tissue specimens from70mycotic keratitis patients were taken，cultured and detected under light microscope for identification of fungus species. Results Fungi were detected from70patients and67were detected by light microscope with a positive rate of95.7%and65were positive by culture with a positive rate of92.9%.Totally26species of Fungi belonging to14genera were detected from70patients，including22strains belong to Fusarium(33.8%)，20strains belong to Curvularia(30.8%)，4strains belong to Aspergillus(6.2)，4strains belong to Coccidiodes(6.2%)and15strains belong to other genera(23.1%). Conclusion Fusarium and Curvularia are the main pathogenic fungi causing mycotic keratitis in Zhanjiang area，the main strain is C.lunata.
Key words:Keratitis;Fungus;Isolation;Identification
真菌性角膜炎是严重的致盲性眼病之一，其患病率在我国呈逐年迅速上升趋势。自2003年10月～2004年12月，我们对湛江地区70例拟诊真菌性角膜炎患者病眼组织做了较完整的真菌镜检、培养和菌种鉴定研究，现对其结果作一分析。
1 材料与方法
1.1 病例资料 70例拟诊真菌性角膜炎患者均来自湛江地区，均为单眼患病，左右眼各35例，其中男性50例，女性20例，年龄14～85岁，平均年龄49.1岁，其中20～50岁41例。病程3d～2月，平均15.2d。职业:农民62例，工人7例，学生1例。较肯定有异物伤眼史45例，无明显异物史25例。异物中谷粒或谷尘19例、泥土4例、木屑4例、甘蔗叶2例、焊屑2例，13例可疑尘埃。
1.2 标本采集 用1%的卡因做病眼角膜表面麻醉2min后，用无菌手术刀刮取角膜溃疡组织，置于含少量无菌生理盐水的无菌离心管中送检。
1.3 真菌涂片 用无菌白金耳挑取适量送检的角膜组织于载玻片上，加1滴10%KOH液，盖上盖玻片，显微镜下查找真菌。
1.4 真菌培养 将余下的角膜组织标本直接接种于2支沙保氏(SDA)琼脂斜面培养基上，置于27℃温箱孵育2周，观察有否真菌生长。
1.5 菌种鉴定 凡2支SDA琼脂斜面上均有真菌生长，并且菌落形态一致者，取其真菌菌落同时接种马玲薯葡萄糖琼脂和SDA琼脂做小培养，置于27℃温箱中，培养48～72h后，每天镜下观察真菌菌丝和分生孢子生长情况，依据菌丝、分生孢子的形态和结构特点，与文献中标准菌株的形态对照 [1，2] ，进行菌种鉴定。
2 结果
70份标本中均检出真菌，其中真菌涂片镜检阳性67份，阴性3份，真菌培养阳性65份，阴性5份。培养阴性的5份标本，其真菌涂片均阳性，3份涂片阴性标本，真菌培养均为阳性。65份真菌培养阳性标本中检出菌种分属14个属26个种，其中阳性分离率最高的为镰刀菌属22例，分属10个种，其中茄病镰刀菌最多(8株);其次为弯孢霉属，占20例，均为新月弯孢霉。详细结果见表1。主要分离菌株的形态特点是:茄病镰刀菌，大分生孢子近镰刀形，壁厚，2～5隔，3隔居多，顶端细胞短，窄细或钝圆，呈喙状(图1);新月弯孢霉分生孢子孔生，弯曲如小船状，具3个分隔，中间细胞显著增大，壁厚，呈褐色(图2);烟曲霉以烧瓶形顶囊，单层小梗及直柱状孢子头为特征(图3);粗球孢子菌菌丝分枝分隔，长方形的节孢子和孢间连体为特征(图4)。
图1 茄病镰刀菌F.solani(40x10)(略)
图2 新月弯孢菌C.lunata(40x10)(略)
图3 烟曲霉A.fumigatus(40x10)(略)
图4 粗球孢子菌C.immitis(400x)(略)
表1 65例真菌性角膜炎病原性真菌的分离鉴定结果(略)
3 讨论
3.1 发病特点 本组病例中，患者主要为农民，占88.6%(62/70)，发病年龄以青壮年(20～50岁)居多(58.6%)，男性占优(71.4%)，发病有明显的季节性，以每年1～3月份和10～12月份最多见，为本地区春耕和秋收季节。大多数患者(64.3%)有异物伤眼史，异物以谷粒或谷尘最多见(27.1%)，其次为尘埃(18.6%)、泥土、木屑、植物等因素。患者多为在生产劳动中、或日常生活中因异物伤眼而发病，尤其近年来，本地区农村都采用机械脱谷粒，谷粒伤眼而引起角膜炎者明显增多。所以，改善生产、生活条件，在劳动作业中，采取积极的防护措施(如戴眼镜)是降低本病发病率的关键。从检出的菌种中可看出，引起本病的真菌较广泛，为条件致病菌，广泛存在于自然界的土壤和空气中。本地区属北热带亚湿润气候，常年平均温度较高(22.5℃～24℃)，湿度较大(年平均相对湿度82%)，有利于真菌的生长，亦可能是本地区真菌性角膜炎发病率较高的原因之一。
3.2 早期诊断 真菌性角膜炎临床表现较复杂，缺乏特征性，单靠临床诊断很困难。对患角膜炎或角膜溃疡患者，尤其有眼部外伤或异物伤眼史者，应首先做真菌直接镜检，以初步明确诊断。但因角膜组织涂片直接镜检所见的真菌多为分支分隔粗大菌丝，一般无特征性，对鉴定菌种帮助不大。而小培养方法可动态观察到菌丝和分生孢子的形态和结构特点，对菌种的鉴定和明确诊断具有重要的意义。本组病例，角膜组织真菌直接镜检阳性率达95.7%，真菌培养阳性率为92.9%，结果总的一致性为89.6%。可见，角膜组织涂片直接镜检查找真菌，具有简单、快捷、价廉、可靠的优点。我们的经验认为，影响真菌检出结果的最主要因素是取材，应尽量取角膜深层上皮及溃疡边缘组织。有条件的单位，应做真菌培养，明确致病菌种。
3.3 致病菌种分布特点 本地区65例真菌性角膜病中检出的病原真菌有14个属26个种。主要致病菌属依次为镰刀菌属(33.8%)(22/65)，弯孢霉属(30.8%)(20/65)，曲霉属(6.2%)(4/65)和球孢子菌属(6.2%)(4/65)。镰刀菌属中，以茄病镰刀菌最多见(8株)。弯孢霉属仅见新月弯孢霉。国内文献报道 [3，4]，石家庄市区、郑州地区真菌性角膜病的致病菌属前3位相同，依次为镰刀菌属(33.3%和65.1%)，曲霉属(21.1%和20.5%)和青霉属(11.6%和3.6%)。广州市区1975年1月～1986年12月调查结果，角膜病主要致病菌属为曲霉属(48.5%)、镰刀菌属(27.7%)和青霉属(14.2%)。而1987年7月～1997年6月，则菌种变迁为镰刀菌属(39.2%)，曲霉属(30.7%)和弯孢霉属(13.1%)。上海市的真菌性角膜病致病菌属则主 要为曲霉属(60.3%)和镰刀属(21.1%) [5] 。而在美国真菌性角膜炎南部以镰刀菌最常见，北方则以念珠菌为主 [6] 。在印度 [7] 和英国 [8] 以曲霉属为主要致病菌。由此可见，引起真菌性角膜病的主要致病真菌存在明显的地域性差异，这可能与地理位置、气候条件、经济水平和生产环境等因素有关。
在地理位置上，湛江地区与广州较接近，但所见的曲霉菌属较广州市区少见，而弯孢霉属较多见。单一菌种中，本地区以新月弯孢霉最多见(30.8%)，其次为茄病镰刀菌(12.3%)，与其他地区差别较大。另外，本地区真菌性角膜病中还检出粗球孢子菌、丛生菌、顶套菌、分枝着色霉菌、冠虫霉、面包串珠霉、树状指孢霉、峡串孢霉属等少见菌属(种)，国内其他地区未见报道，提示该地区引起的真菌性角膜病的菌种可能更为丰富，有待更进一步的研究。
参考文献:
[1]孙鹤龄主编.医学真菌鉴定初稿[M].第1版.北京:科学出版社，1987，7.
[2]叶世泰，乔秉善，路英杰编著.中国致敏空气真菌学[M].第1版.北京:人民卫生出版社，1992，1.
[3]王丽娅，张月琴，王印其，等.中国三地区真菌性角膜病致病菌种的调查[J].中华眼科杂志，2000，36(2):138～140.
[4]卢嘉彪，陈家祺，王丽娅.广州地区真菌性角膜病的病原体及其发病情况的变迁[J].眼科研究，1998，16(4):289～291.
[5]范德彰，蔡松年.真菌性角膜溃疡318例临床分析[J].中华眼科杂志，1981，17(6):321～326.
[6]O'Day DM.Selection of appropriate antifungal therapy[J].Cornea，1987，6:238～245.
[7]Koul RL，Pratap VB.Keratomycosis in Lucknow[J].Br J Ophthalmol，1975，59:47～51.
[8]Jones BR.Principles in the management of ocular mycosis[J].Am J Oph-thalmol，1975，79:719～751, http://www.100md.com(李定，黄文明，史建强，吴国凤，李瑞庄，严灿荣)