结核分枝杆菌Mtb8.4DNA疫苗构建及免疫保护研究
摘要:目的 评价构建结核菌DNA疫苗pVS84免疫小鼠体外产生细胞因子的能力和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的效果。 方法 利用基因技术将结核菌Mtb8.4插入pVAXl载体，构建表达结核菌Mtb8.4蛋白(分泌型)的DNA疫苗pVS84。将雌性C57BL/6小鼠分成5组，每组20只，分别用pVS84、pVAXl、plL2S和PBS分别各免疫3次，每次均间隔2周，以等剂量加强免疫2次。另一组用BCG(10 5 CFU)皮内注射免疫1次。每组10只鼠在最后一次加强免疫后，无菌取脾培养，检测上清细胞因子。另10只鼠则用结核菌H37Rv经静脉攻击，2周后取脾、肝和肺培养结核菌并进行菌落计数。 结果 pVS84免疫组鼠脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mlFN-Y平均含量分别为(290.0±112.9)pg/ml和(501.7±79.4)pg/ml，显著高于3个阴性对照组(P<0.001)，与BCG免疫组无显著性差异(P>0.05)。5个组的平均mIL-6和mIL-10无显著性差异。pVS84免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌载量分别为(39176.9±3702.6)、(18780.1±2535.8)和(24410.3±1846.8)CFU/g，分别低于pVAXl、plL2S和PBS三个阴性对照组的相应器官的结核菌载量(P<0.001)，仅脾结核菌载量显著高于BCG免疫对照组。 结论 构建的DNA疫苗pVS84能够刺激机体产生抗结核菌所需的Thl型免疫应答，免疫鼠抵抗H37Rv攻击的能力与BCG接近。
关键词:结核分枝杆菌;DNA疫苗;分泌蛋白;细胞免疫;免疫保护
Construction and protective efficacy of the TB DNA vaccine expressing Mycobacterium tuberculosis secretory Mtb8.4protein.
ZHU Zhong-yuan，LIU Jian-bing，WANG Hai-bo，et al.
(Affiliated Xinhua Hospital of Hainan Medical College，Haikou570311，Hainan，P.R.China)
Abstract:Objective To evaluate the capacity in production of cytokines in vitro and the protective efficacy of the mice immu-nized with the TB DNA vaccine pVS84we constructed. Methods Plasmid pVS84expressing secretory protein of Mycobacterium tuberculosisMtb8.4was constructed by inserting mtb8.4into the vector pVAX1.20female C57BL/6inbred mice in5groups immu-nized with the100ug pVS84，pIL2S，pVAX1，PBS and BCG(105CFU)for3times with2weeks intervals except BCG(only one vac-cinization without boost).Sera and supernatants of10mice in each group were determined for hIL-2，mIL-2，mIFN-γ，mIL-6and mIL-10by sandwich ELISA.The other10mice in each group were challenged with10 6 CFUs MtuberculosisH37Rv and killed for culturing H37Rv from the spleens，lungs and livers. Results The average concentrations of mIL-2and mIFN-γin the supe-matants from pVS84immunized mice were290.0+112.9pg/mL and501.7+79.4pg/mL respectively，significantly higher than those from the pVAX1，pIL2S，and PBS injected controls(P<0.001).No significantly difference has been observed for the miL-6and miL-10concentrations from the mice in all5groups.The average Mtuberculosis loads in the spleens，livers and lungs in the pVS84immunized group were39176.9±3702.6CFU/g，18780.1±2535.8CFU/g and24410.3±1846.8CFU/g respectively.The average bacterial loads of the3organs in the pVS84immunized group were significantly lower than those of their counterparts in pVAX1，pIL2S and PBS injected groups，but bacterial load in the spleens was significantly higher than that of their counterparts in the BCG immunized controls. Conclusion TB DNA vaccine pVS84we constructed can induce Thl immune response which is neces-sary for prevention against TB，and it can evoke protective immunity to H37Rv challenge in the immunized mice equal to BCG immu-nization.
Key words:Mycobacterium tuberculosis;TB DNA vaccine;CMI;Protective efficacy
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，结核菌)是引起结核病(TB)的病原体，在全球范围内，TB每年引起的病死病例为200万，每年新出现的结核病例高达800万 [1] 。AIDS在世界范围内的蔓延和耐药性结核病例和多耐药结核病例的增加，使有效控制TB的工作更加困难。卡介苗(BCG)在预防儿童结核病成效已得到肯定，但预防成人TB则效果不稳定。经严格设计控制的调查结果表明，BCG的保护率在0～80%之间 [2] 。为此寻求优效的新型疫苗乃当务之急。不少学者尝试亚单位疫苗和DNA疫苗在结核病的预防工作中发挥更加有效的作用。从目前的结果看，效果仍然欠缺 [3] 。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白Mtb8.4的基因连接、插入美国FDA推荐可用于人体的表达载体pVAXl中，构建表达结核菌保护抗原Mtb8.4的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系C57BL/6小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌H37Rv攻击的能力显著增强，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 结核菌H37Rv标准株(ATCC27294) 由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。细菌的增殖在改良罗氏(Lowenstein-Jensen Medium，L-J)培养基进行。
1.1.2 pVAXl真核表达载体 美国Invitrogen公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料(WWW.invitro-gen.com)。
1.1.3 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α及JM109株 本院检验科保存菌株。
1.1.4 Ex TaqDNA酶，LA TaqDNA多聚酶，10×PCR缓冲液，dNTPs，限制内切酶KpnⅠ，HindⅢ，BamHⅠ和NheⅠ等购自大连宝生物公司。
1.1.5 PCR试剂等 PCR产物回收试剂盒，DNA连接试剂盒，DNA Marker等购自大连宝生物公司。
1.1.6 BCG 上海生物制品研究所生产。
1.1.7 C57BL/6小鼠 购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时6～8周龄，初次免疫时8-10周龄。动物在实验期间，饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的C57BL/6小鼠的核心种群来源于Charles River Laboratories(Wilmington，Mass，USA)。
1.1.8 hlL-2、鼠白细胞介素-2(murine interleukin-2，mIL-2)、鼠白细胞介素-6(mIL-6)、鼠白细胞介素-10(mIL-10)和鼠干扰素γ(murine Interferonγ，mlFN-γ)定量测定试剂盒由法国Diaclone Research公司产品。
1.1.9 胎牛血清(CSF) 购自暨南大学生物技术研究所，为进口分装产品。
1.1.10 RPMI1640培养基 Gibco公司产品。临用前，10ml CSF与90ml RPMI培养液混合即可。
1.1.11 免疫读数仪 芬兰Labsystem公司生产的Wellscan MKⅡ型。
1.2 方法
1.2.1 结核菌基因组DNA的提取 用接种环从L-J斜面上刮取少许H37Rv菌落，放入尖底塑料离心管管 底，加入溶菌酶和蛋白酶K裂解菌体后，苯酚氯仿纯化，无水乙醇沉淀DNA后，加入100μl TE缓冲液溶解备用 [4] 。
1.2.2 表达载体的构建过程:见图1。
1)合成引物:hIL-2信号序列DNA片段的制作:hIL2sig-P1:5'-CCG CAT GCT AGC ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT TGC ATT GCA CTA TGT CTT GCA CTT GTC ACA AAC AGT GCA AAG CTT CAG-3'。hIL2sig-P2:3'-GGC GTA CGA TCG TAC ATG TCC TAC GTT GAG GAC AGA ACG TAA CGT GAT TCA GAA CGT GAA CAG TGT TTG TCA CGT TTC GAA GTC-5'。以上两条单链核酸分别为hIL-2信号序列互补的正链和负链，见hIL-2基因:Genbank accession nmber:NM-000586。信号序列(Signal-peptide:295～354位碱基序列，60bp，20aa);成熟肽链(Mat-peptide:355-753位寡核苷酸链，399bp，133aa) [6，7] 。下划线部分分别为NheⅠ和HindⅢ酶切位点。
2)根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链叫A片段。
3)上述合成的片断经NheⅠ和HindⅢ双切酶，产物通过PCR Fragment Recovery Kit回收，命名为hIL-2s。
4)将pVAX1质粒DNA经NheⅠ和HindⅢ双酶切，并回收目的片段。
5)设计合成扩增Mtb8.4基因引物:Mtb8.4-P1:5'-A TAT AAG CTT GCC GCC GCC ATG AGG CTG TCG TTG ACC GCA-3'(40mer)。下划线部分为HindⅢ酶切位点。斜体部分GCC GCC GCC为Kozak序列，该序列位于启始密码子前有利于抗原的高效表达。含有起始密码子ATG。Mtb8.4-P2:5'-GCG GGT ACC CTAGAA TTC ATA GTT GTT GCA GGA GCC GGC-3'(39mer)。下划线部分为KpnⅠ酶切位点。双下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。斜体部分为终止密码子。Mtb8.4-P1和Mtb8.4-P2的位置分别是969～989位和1279～1299位碱基序列，见H37RV RV1174C Gen-bank Accession number:CAA15851 [8，9] 。扩增产物为结核菌Mtb8.4的基因成熟蛋白编码区。
6)用Mtb8.4-P1和P2扩增结核菌Mtb8.4，用EcoRⅠ/ApaⅠ分别进行酶切，酶切产物使用PCR Fragment Recovery Kit切胶回收即TB-V6-1。
7)使用DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将hlL-2s连接到pVAX1载体，hlL-2s和TB-V6-1连接后再插入pVAX1载体，分别热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板过夜培养菌体。
8)挑选菌落，提取质粒，将插入Mtb8.4的质粒被命名为pVS84。将仅插入hlL-2信号肽的质粒命名为plL2S。
9)质粒pVS84用NheⅠ/BamHⅠ酶切检测。
10)用引物T7Promoter/pcDNA R对质粒pVS84和plL2S进行DNA测序。
图1 pVS84疫苗基因的位置、构建及酶切示意图(略)
Fig1 Target gene position，construction procedure and endonuclease sites of pVS84.
1.2.3 质粒DNA的提取及纯化 见文献 [5] 。
1.2.4 C57BL/6的分组及免疫程序 共分pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS及BCG对照组，共5组，每组20只，其中10只小鼠用于脾淋巴细胞体外产生细胞因子试验，余下10只用于观察疫苗免疫小鼠抵抗H37Rv攻击试验。免疫方法为将各种质粒浓缩制剂用pH7.2的无热源0.1MPBS稀释至1000μg/ml，每只小鼠取0.1ml分四点注射入腿部肌肉内，pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS对照组，分别在0、15和30d分别免疫或者注射一次，共3次。BCG皮内注射免疫，每只小鼠10 5 个CFU。只免疫一次。
1.2.5 小鼠脾淋巴细胞培养及上清收集 免疫组小鼠和各对照组小鼠经挑除眼球收集血清后断颈处死，用75%酒精消毒皮毛，无菌操作取脾称重，去筋膜，研磨成匀浆，加适量不完全RPMl1640，纱网过滤，计数淋巴细胞数目，用RPMl1640完全培养基配制成10 6 /ml，接种于24孔培养板，5%CO 2 环境37℃培养72h，收集培养液，离心取上清-20℃保存待检。
1.2.6 细胞因子的定量测定 以mIL-10定量检测为例。1)将小鼠血清、标准品(mlL-10:1000pg/ml倍比稀释至31.25pg/ml)、标准品稀释液(作空白对照用)和质控品复溶液各100μl加入微孔内，均作复孔。2)将生物素标记的抗mIL-10抗体用生物素化抗体稀释液1:27.5稀释，每孔加50μl，微型混合器混匀。3) 置37℃恒温箱1h后，甩干液体，每孔加300μl洗涤液洗1min，共洗涤3次。4)将工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl加入各孔(含空白孔)，37℃放置30min。5)同前洗涤后，每孔加入100μl TMB底物避光反应15min。6)各孔加入100μl2M硫酸终止反应，用酶免疫读数仪测OD450。7)标准曲线完成后，将各标本复孔OD的均数代入方程求得mIL-10的含量。
1.2.7 H37Rv感染C57BL/6小鼠 将结核菌H37Rv株接种于L-J斜面37℃培养20d，挑取菌落，加少许生理盐水，用组织研磨器制成悬液，与麦氏比浊管进行比色，配制成2mg/ml，(相当于2×10 7 CFU/ml)，冻存于-20℃。取0.1ml接种L-J斜面，共接种3管，培养20～30d，计数CFU。根据CFU计数结果，用无热源、无菌生理盐水将H37Rv菌配制成10 7 CFU/ml，每只小鼠尾静脉注射0.1ml(10 6 个结核菌)感染小鼠。
1.2.8 感染鼠的组织器官的结核菌培养及计数 小鼠感染结核菌后喂养15d后杀鼠，取肝、肺和脾无菌取出、称重、制备成匀浆，取0.1ml接种于L-J培养基斜面，每只鼠的每个器官接种个接种3管，37℃培养20～30d后，观察并计数L-J斜面培养基上的结核菌菌落数。计算公式如下。
S(CFU)=C×(0+V)/O×10
C:3个L-J培养管出现的菌落数的均数;
10:接种量为0.1ml，相当于1/10g，为常数。乘以10为每g器官里的结核菌数;O:为器官的重量(g);
V:为加入生理盐水的体积，1ml=lg;
S:为每只鼠的结核菌个数，单位为CFU/g
1.2.9 统计学处理 pVS84疫苗免疫组与各对照组的细胞因子和脏器结核菌落数比较采用单向方差分析。两两之间的均数比较采用q检验。分析工具为SPSS10.0系统。
2 结果
2.1 表达结核菌Mtb8.4蛋白表达载体的构建及鉴定 从结核菌基因组DNA中扩增Mtb8.4DNA大小，连接后形成的表达质粒的大小及与各种酶切反应的大小相符。在DNA序列中，由于连接的需要，插入了酶切位置，序列为AAG CTT(HindⅢ)，其表达蛋白则增加了Lys-Leu2个aa，与设计相符合。其余部分基因测序的结果表明与已公布的序列完全一致 [8，9] 。见图2。
2.2 结核菌DNA疫苗的含量及纯度 提取的pVS84疫苗、pVAXl和plL2S用紫外分光光度计测得的OD 260 /OD 280 的比值为1.726、1.842和1.754，表明纯度达到要求。3种质粒的浓度分别为1324.4、1234.3和1356μg/ml，免疫时均稀释至1000μg/ml使用。
2.3 免疫组及对照组小鼠的培养上清的细胞因子含量对比 pVS84免疫组的C57BL/6小鼠血清平均hlL-2与BCG免疫对照组、plL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均hlL-2含量无显著性差异。其脾淋巴细胞培养上清mIL-2和mlFN-γ的平均含量与BCG阳性对照组的平均浓度无显著性差异，且显著高于pIL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均浓度(P<0.001)。培养上清中的mIL-6和mIl-10的平均浓度在5个组中间无显著性差异。见表1。
2.4 免疫组和对照组小鼠的脾、肝和肺的结核菌落数对比 pVS84免疫C57BL/6小鼠的脾、肝和肺组织培养的菌落均数均显著高于阴性或者空白对照组的结核菌载量(Bacterial load)，而除免疫组脾脏结核菌显著高于BCG免疫组的相应器官的细菌载量(P<0.001)外，pVS84免疫组的肝和肺的结核菌载量与BCG免疫组之间无显著性差异(P>0.05)。见表2。
图2 插入的基因，质粒及质粒的酶切产物电泳图(略)
M，DNAmarker;1.hIL-2信号序列基因片段，约80bp;2.Mtb8.4基因PCR产物，330bp;3.Mtb8.4基因PCR产物酶切回收片段330bp;4.pVS84质粒，3410bp;5.pVS84质粒NheⅠ/KpnⅠ双酶切片段约3000bp和410bp。
Fig2 Electrophoresis of product of inserted gene，plasmid and en-zyme-digested plasmid
M，DNA marker;1.hIL-2signal peptide gene fragment，80bp.2.PCR product of mtb8.4，330bp;3.MTB mtb8.4fragment after HindⅢ/KpnⅠdigestions;4.Expressing vector of pVS84，3400bp;5.pVS84fragment after KpnⅠ/NheⅠdigestions，3000and410bp respectively.
表1 结核菌DNA疫苗免疫后脾细胞培养上清细胞因子含量对比(略)
Table1 The concentrations of CKS in the sera or culture supernatants of the splenocytes of TB DNA vaccine immunized mice and the controls
※与pVS84及BCG免疫组比较，差异均有非常显著性(P<0.001)。其余两组间比较，差异均无显著性。
表2 结核DNA疫苗及对照组免疫小鼠的内脏组织培养的结核菌落数比较(略)
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in the spleen，liver and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control groups
结果采用M±SD表示。单位为CFU/g。
*表示与pVS84比较，细菌载量低于阴性对照组差异有显著性;**表示BCG免疫组细菌载量既低于阴性对照组又低于pVS84免疫组差异有显著性。
表3 结核DNA疫苗及对照免疫小鼠的内脏培养结核菌落数对数值比较(略)
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in log units in the spleens，livers and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control mice
从表3中可以看出，结核DNA疫苗pVS84免疫的C57BL/6小鼠的脾、肝和肺淋巴细胞载量的对数值比阴性对照组(plL2S、pVAX1和PBS)分别下降0.2，0.5和0.4个对数单位(log10)。而BCG免疫对照组的相应器官的结核菌载量分别下降0.8，0.6和0.7个log10对数单位。两组下降的幅度非常接近。
各组动物的脾、肝和肺的结核菌生长情况从小鼠脾脏分离的结核菌落显示发现，仅表达hIL-2信号肽的载体(pIL2S)(B)、pVAX1(C)和PBS(D)注射C57BL/6小鼠后，H37Rv攻击后15d脾脏悬液培养H37Rv结果，可见L-J斜面上菌落密布。pVS84(A)和BCG(E)免疫后，脾淋巴细胞培养，斜面上菌落明显减少。
3 讨论
由于BCG预防TB效果的不确定性，世界各国一直未放弃对新型结核疫苗进行的研发。从目前的发展的近况看，主要存在以下三个技术路线。一是减毒活分枝杆菌疫苗。基因操作技术的发展激起了一系列增强现正使用的BCG效用的尝试。使生物合成通路相关的基因灭活产生的营养缺陷型突变株比BCG安全，而且不受干扰 [10，11] 。BCG的免疫性可以通过导入编码哺乳动物的细胞因子如INF-γ或细胞因子的拮抗剂 [12，13] 。减毒活分枝杆菌疫苗的缺陷是加速疫苗的清除，对免疫回忆反应造成重大伤害。保护性抗原的加强表达是加强BCG免疫原性的另一种方法。携带多拷贝表达分泌性抗原Ag85B的BCG株在豚鼠模型中显示有保护作用增强 [14] 。70kDa热休克蛋白(heatshock protein)转入BCG后具有近似的效果 [15] ;二是结核菌减毒株的疫苗作用研究。减毒结核菌株的免疫效果优于BCG。改变结核菌的表面性质，破坏调控基因和营养缺陷变异株实验的结果更令人鼓舞 [16] 。挑选可干扰感染不同阶段的突变株，可以使免疫原性最优，诱导免疫记忆而且可消除不良后果。可以乐观地估计，达到上述效果，且比自然感染更好免疫原性的菌株是完全可能的。利用减毒活结核菌作为疫苗最大的隐忧是造成免疫缺陷病人结核菌感染;三是亚单位疫苗研究。核酸疫苗(nucleic acid vaccine)包括DNA疫苗(DNA vaccine)和RNA疫苗(RNA vaccine)，由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和载体组成，将其直接导入机体细胞后，并不与宿主染色体整合，而是通过宿主细胞转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗(genetic vaccine)、基因免疫(genetic immuniza-tion)或核酸免疫(nucleic acid immunization)，但目前研究最多的是DNA疫苗，由于其不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗(naked DNA vaccine) [17] 。这是近年来自基因治疗研究中所衍生而发展的一项新技术、新领域，1995年4月美国纽约科学院称核酸疫苗是疫苗学的新纪元。1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一。
Coler等 [8] 研究抗原能否刺激健康献血者的外周血淋巴细胞增殖及产生IFN-γ，并进而研究其在动物模型中产生保护性免疫时发现Mtb8.4为T细胞识别抗原。Mtb8.4基因由330个核苷酸组成(编号Rv1174c;CAA15851)，编码110个氨基酸(aa)的肽链，信号肽为28个aa(969-1025)。预测其成熟即无信号肽的分子量为8.4kDa，故编号为Mtb8.4。表达该抗原的DNA疫苗或其重组蛋白联合佐剂均能刺激产生强烈的CD 4+ T细胞和CD 8+ CTL应答，并能保护结核菌有毒株的攻击。他们以前的研究报告显示表达分支杆菌的MPT-63，MPT-83或ESAT-6的疫苗与对照组比较，肺组织的CFU的对数值只降低0.41-0.61。编码Mtb8.4抗原的DNA疫苗具有与多个DNA疫苗联合免疫的保护水平。重组Mtb8.4蛋白和Mtb8.4的DNA疫苗均可使肺组织结核菌CFU的对数值降低1 -1.2，与BCG免疫下降的程度相当。也证实表达Mtb8.4的质粒只诱导Thl型应答而不诱导体液免疫应答 [9]。说明Mtb8.4抗原是良好的保护性抗原。因此选择该抗原作为我们疫苗的主要抗原。
由于已报道的结核DNA疫苗效果不理想，主要表现在免疫保护效果达不到BCG免疫的效果，因此，设计制备了表达结核菌蛋白Mtb8.4分泌蛋白的DNA疫苗pVS84。构建的DNA疫苗pVS84及表达hIL-2信号肽的质粒pIL2S经过菌斑筛选，抗生素抗性筛选、限制性内切酶鉴定及基因测序证明，构建的DNA疫苗及pIL2S质粒的基因序列与文献报道的一致 [6～9] ，符合设计要求(图1和2)。pVS84免疫小鼠后，其脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-2、mIFN-γ分别为379.6±58.2pg/ml和529.7±63.7pg/ml，显著高于pVAX1、pIL2S和PBS对照组(P<0.001)，与BCG免疫对照组差异均无显著性。实验组和对照组脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-6和mIL-10浓度，每组之间均差异无显著性(P>0.05，见表1)。表明构建DNA疫苗pVS84可刺激机体产生Thl型免疫应答。
pVS84免疫C57BL/6小鼠组的脾、肝及肺的平均结核菌载量分别为(39176.9±3702.6)CFU/g、(18780.1±2535.8)CFU/g和(24410.3土1846.8)CFU/g，分别低于pYAX1、pIL2S和PBS等阴性对照组的相应器官的结核菌载量，差异具有显著性(P<0.001，见表2)。与BCG免疫小鼠的结核菌载量比较，3种免疫器官的平均细菌载量差异仍具有显著性。揭示本研究中构建的DNA疫苗pVS84免疫的小鼠具有抵抗标准结核菌株H37Rv经静脉攻击的能力，免疫保护作用显著。
本研究的结果表明，pVS84具有刺激机体产生的抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答的能力。小鼠经该疫苗免瘴后，抵抗结核菌H37Rv攻击的能力比对照组显著增强。此疫苗的免疫保护效果与BCG比较尚有差距，多个DNA疫苗或者与表达细胞因子联合免疫的效果如何值得深入研究。
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关键词:结核分枝杆菌;DNA疫苗;分泌蛋白;细胞免疫;免疫保护
Construction and protective efficacy of the TB DNA vaccine expressing Mycobacterium tuberculosis secretory Mtb8.4protein.
ZHU Zhong-yuan，LIU Jian-bing，WANG Hai-bo，et al.
(Affiliated Xinhua Hospital of Hainan Medical College，Haikou570311，Hainan，P.R.China)
Abstract:Objective To evaluate the capacity in production of cytokines in vitro and the protective efficacy of the mice immu-nized with the TB DNA vaccine pVS84we constructed. Methods Plasmid pVS84expressing secretory protein of Mycobacterium tuberculosisMtb8.4was constructed by inserting mtb8.4into the vector pVAX1.20female C57BL/6inbred mice in5groups immu-nized with the100ug pVS84，pIL2S，pVAX1，PBS and BCG(105CFU)for3times with2weeks intervals except BCG(only one vac-cinization without boost).Sera and supernatants of10mice in each group were determined for hIL-2，mIL-2，mIFN-γ，mIL-6and mIL-10by sandwich ELISA.The other10mice in each group were challenged with10 6 CFUs MtuberculosisH37Rv and killed for culturing H37Rv from the spleens，lungs and livers. Results The average concentrations of mIL-2and mIFN-γin the supe-matants from pVS84immunized mice were290.0+112.9pg/mL and501.7+79.4pg/mL respectively，significantly higher than those from the pVAX1，pIL2S，and PBS injected controls(P<0.001).No significantly difference has been observed for the miL-6and miL-10concentrations from the mice in all5groups.The average Mtuberculosis loads in the spleens，livers and lungs in the pVS84immunized group were39176.9±3702.6CFU/g，18780.1±2535.8CFU/g and24410.3±1846.8CFU/g respectively.The average bacterial loads of the3organs in the pVS84immunized group were significantly lower than those of their counterparts in pVAX1，pIL2S and PBS injected groups，but bacterial load in the spleens was significantly higher than that of their counterparts in the BCG immunized controls. Conclusion TB DNA vaccine pVS84we constructed can induce Thl immune response which is neces-sary for prevention against TB，and it can evoke protective immunity to H37Rv challenge in the immunized mice equal to BCG immu-nization.
Key words:Mycobacterium tuberculosis;TB DNA vaccine;CMI;Protective efficacy
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，结核菌)是引起结核病(TB)的病原体，在全球范围内，TB每年引起的病死病例为200万，每年新出现的结核病例高达800万 [1] 。AIDS在世界范围内的蔓延和耐药性结核病例和多耐药结核病例的增加，使有效控制TB的工作更加困难。卡介苗(BCG)在预防儿童结核病成效已得到肯定，但预防成人TB则效果不稳定。经严格设计控制的调查结果表明，BCG的保护率在0～80%之间 [2] 。为此寻求优效的新型疫苗乃当务之急。不少学者尝试亚单位疫苗和DNA疫苗在结核病的预防工作中发挥更加有效的作用。从目前的结果看，效果仍然欠缺 [3] 。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白Mtb8.4的基因连接、插入美国FDA推荐可用于人体的表达载体pVAXl中，构建表达结核菌保护抗原Mtb8.4的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系C57BL/6小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌H37Rv攻击的能力显著增强，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 结核菌H37Rv标准株(ATCC27294) 由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。细菌的增殖在改良罗氏(Lowenstein-Jensen Medium，L-J)培养基进行。
1.1.2 pVAXl真核表达载体 美国Invitrogen公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料(WWW.invitro-gen.com)。
1.1.3 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α及JM109株 本院检验科保存菌株。
1.1.4 Ex TaqDNA酶，LA TaqDNA多聚酶，10×PCR缓冲液，dNTPs，限制内切酶KpnⅠ，HindⅢ，BamHⅠ和NheⅠ等购自大连宝生物公司。
1.1.5 PCR试剂等 PCR产物回收试剂盒，DNA连接试剂盒，DNA Marker等购自大连宝生物公司。
1.1.6 BCG 上海生物制品研究所生产。
1.1.7 C57BL/6小鼠 购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时6～8周龄，初次免疫时8-10周龄。动物在实验期间，饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的C57BL/6小鼠的核心种群来源于Charles River Laboratories(Wilmington，Mass，USA)。
1.1.8 hlL-2、鼠白细胞介素-2(murine interleukin-2，mIL-2)、鼠白细胞介素-6(mIL-6)、鼠白细胞介素-10(mIL-10)和鼠干扰素γ(murine Interferonγ，mlFN-γ)定量测定试剂盒由法国Diaclone Research公司产品。
1.1.9 胎牛血清(CSF) 购自暨南大学生物技术研究所，为进口分装产品。
1.1.10 RPMI1640培养基 Gibco公司产品。临用前，10ml CSF与90ml RPMI培养液混合即可。
1.1.11 免疫读数仪 芬兰Labsystem公司生产的Wellscan MKⅡ型。
1.2 方法
1.2.1 结核菌基因组DNA的提取 用接种环从L-J斜面上刮取少许H37Rv菌落，放入尖底塑料离心管管 底，加入溶菌酶和蛋白酶K裂解菌体后，苯酚氯仿纯化，无水乙醇沉淀DNA后，加入100μl TE缓冲液溶解备用 [4] 。
1.2.2 表达载体的构建过程:见图1。
1)合成引物:hIL-2信号序列DNA片段的制作:hIL2sig-P1:5'-CCG CAT GCT AGC ATG TAC AGG ATG CAA CTC CTG TCT TGC ATT GCA CTA TGT CTT GCA CTT GTC ACA AAC AGT GCA AAG CTT CAG-3'。hIL2sig-P2:3'-GGC GTA CGA TCG TAC ATG TCC TAC GTT GAG GAC AGA ACG TAA CGT GAT TCA GAA CGT GAA CAG TGT TTG TCA CGT TTC GAA GTC-5'。以上两条单链核酸分别为hIL-2信号序列互补的正链和负链，见hIL-2基因:Genbank accession nmber:NM-000586。信号序列(Signal-peptide:295～354位碱基序列，60bp，20aa);成熟肽链(Mat-peptide:355-753位寡核苷酸链，399bp，133aa) [6，7] 。下划线部分分别为NheⅠ和HindⅢ酶切位点。
2)根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链叫A片段。
3)上述合成的片断经NheⅠ和HindⅢ双切酶，产物通过PCR Fragment Recovery Kit回收，命名为hIL-2s。
4)将pVAX1质粒DNA经NheⅠ和HindⅢ双酶切，并回收目的片段。
5)设计合成扩增Mtb8.4基因引物:Mtb8.4-P1:5'-A TAT AAG CTT GCC GCC GCC ATG AGG CTG TCG TTG ACC GCA-3'(40mer)。下划线部分为HindⅢ酶切位点。斜体部分GCC GCC GCC为Kozak序列，该序列位于启始密码子前有利于抗原的高效表达。含有起始密码子ATG。Mtb8.4-P2:5'-GCG GGT ACC CTAGAA TTC ATA GTT GTT GCA GGA GCC GGC-3'(39mer)。下划线部分为KpnⅠ酶切位点。双下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。斜体部分为终止密码子。Mtb8.4-P1和Mtb8.4-P2的位置分别是969～989位和1279～1299位碱基序列，见H37RV RV1174C Gen-bank Accession number:CAA15851 [8，9] 。扩增产物为结核菌Mtb8.4的基因成熟蛋白编码区。
6)用Mtb8.4-P1和P2扩增结核菌Mtb8.4，用EcoRⅠ/ApaⅠ分别进行酶切，酶切产物使用PCR Fragment Recovery Kit切胶回收即TB-V6-1。
7)使用DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将hlL-2s连接到pVAX1载体，hlL-2s和TB-V6-1连接后再插入pVAX1载体，分别热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板过夜培养菌体。
8)挑选菌落，提取质粒，将插入Mtb8.4的质粒被命名为pVS84。将仅插入hlL-2信号肽的质粒命名为plL2S。
9)质粒pVS84用NheⅠ/BamHⅠ酶切检测。
10)用引物T7Promoter/pcDNA R对质粒pVS84和plL2S进行DNA测序。
图1 pVS84疫苗基因的位置、构建及酶切示意图(略)
Fig1 Target gene position，construction procedure and endonuclease sites of pVS84.
1.2.3 质粒DNA的提取及纯化 见文献 [5] 。
1.2.4 C57BL/6的分组及免疫程序 共分pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS及BCG对照组，共5组，每组20只，其中10只小鼠用于脾淋巴细胞体外产生细胞因子试验，余下10只用于观察疫苗免疫小鼠抵抗H37Rv攻击试验。免疫方法为将各种质粒浓缩制剂用pH7.2的无热源0.1MPBS稀释至1000μg/ml，每只小鼠取0.1ml分四点注射入腿部肌肉内，pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS对照组，分别在0、15和30d分别免疫或者注射一次，共3次。BCG皮内注射免疫，每只小鼠10 5 个CFU。只免疫一次。
1.2.5 小鼠脾淋巴细胞培养及上清收集 免疫组小鼠和各对照组小鼠经挑除眼球收集血清后断颈处死，用75%酒精消毒皮毛，无菌操作取脾称重，去筋膜，研磨成匀浆，加适量不完全RPMl1640，纱网过滤，计数淋巴细胞数目，用RPMl1640完全培养基配制成10 6 /ml，接种于24孔培养板，5%CO 2 环境37℃培养72h，收集培养液，离心取上清-20℃保存待检。
1.2.6 细胞因子的定量测定 以mIL-10定量检测为例。1)将小鼠血清、标准品(mlL-10:1000pg/ml倍比稀释至31.25pg/ml)、标准品稀释液(作空白对照用)和质控品复溶液各100μl加入微孔内，均作复孔。2)将生物素标记的抗mIL-10抗体用生物素化抗体稀释液1:27.5稀释，每孔加50μl，微型混合器混匀。3) 置37℃恒温箱1h后，甩干液体，每孔加300μl洗涤液洗1min，共洗涤3次。4)将工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl加入各孔(含空白孔)，37℃放置30min。5)同前洗涤后，每孔加入100μl TMB底物避光反应15min。6)各孔加入100μl2M硫酸终止反应，用酶免疫读数仪测OD450。7)标准曲线完成后，将各标本复孔OD的均数代入方程求得mIL-10的含量。
1.2.7 H37Rv感染C57BL/6小鼠 将结核菌H37Rv株接种于L-J斜面37℃培养20d，挑取菌落，加少许生理盐水，用组织研磨器制成悬液，与麦氏比浊管进行比色，配制成2mg/ml，(相当于2×10 7 CFU/ml)，冻存于-20℃。取0.1ml接种L-J斜面，共接种3管，培养20～30d，计数CFU。根据CFU计数结果，用无热源、无菌生理盐水将H37Rv菌配制成10 7 CFU/ml，每只小鼠尾静脉注射0.1ml(10 6 个结核菌)感染小鼠。
1.2.8 感染鼠的组织器官的结核菌培养及计数 小鼠感染结核菌后喂养15d后杀鼠，取肝、肺和脾无菌取出、称重、制备成匀浆，取0.1ml接种于L-J培养基斜面，每只鼠的每个器官接种个接种3管，37℃培养20～30d后，观察并计数L-J斜面培养基上的结核菌菌落数。计算公式如下。
S(CFU)=C×(0+V)/O×10
C:3个L-J培养管出现的菌落数的均数;
10:接种量为0.1ml，相当于1/10g，为常数。乘以10为每g器官里的结核菌数;O:为器官的重量(g);
V:为加入生理盐水的体积，1ml=lg;
S:为每只鼠的结核菌个数，单位为CFU/g
1.2.9 统计学处理 pVS84疫苗免疫组与各对照组的细胞因子和脏器结核菌落数比较采用单向方差分析。两两之间的均数比较采用q检验。分析工具为SPSS10.0系统。
2 结果
2.1 表达结核菌Mtb8.4蛋白表达载体的构建及鉴定 从结核菌基因组DNA中扩增Mtb8.4DNA大小，连接后形成的表达质粒的大小及与各种酶切反应的大小相符。在DNA序列中，由于连接的需要，插入了酶切位置，序列为AAG CTT(HindⅢ)，其表达蛋白则增加了Lys-Leu2个aa，与设计相符合。其余部分基因测序的结果表明与已公布的序列完全一致 [8，9] 。见图2。
2.2 结核菌DNA疫苗的含量及纯度 提取的pVS84疫苗、pVAXl和plL2S用紫外分光光度计测得的OD 260 /OD 280 的比值为1.726、1.842和1.754，表明纯度达到要求。3种质粒的浓度分别为1324.4、1234.3和1356μg/ml，免疫时均稀释至1000μg/ml使用。
2.3 免疫组及对照组小鼠的培养上清的细胞因子含量对比 pVS84免疫组的C57BL/6小鼠血清平均hlL-2与BCG免疫对照组、plL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均hlL-2含量无显著性差异。其脾淋巴细胞培养上清mIL-2和mlFN-γ的平均含量与BCG阳性对照组的平均浓度无显著性差异，且显著高于pIL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均浓度(P<0.001)。培养上清中的mIL-6和mIl-10的平均浓度在5个组中间无显著性差异。见表1。
2.4 免疫组和对照组小鼠的脾、肝和肺的结核菌落数对比 pVS84免疫C57BL/6小鼠的脾、肝和肺组织培养的菌落均数均显著高于阴性或者空白对照组的结核菌载量(Bacterial load)，而除免疫组脾脏结核菌显著高于BCG免疫组的相应器官的细菌载量(P<0.001)外，pVS84免疫组的肝和肺的结核菌载量与BCG免疫组之间无显著性差异(P>0.05)。见表2。
图2 插入的基因，质粒及质粒的酶切产物电泳图(略)
M，DNAmarker;1.hIL-2信号序列基因片段，约80bp;2.Mtb8.4基因PCR产物，330bp;3.Mtb8.4基因PCR产物酶切回收片段330bp;4.pVS84质粒，3410bp;5.pVS84质粒NheⅠ/KpnⅠ双酶切片段约3000bp和410bp。
Fig2 Electrophoresis of product of inserted gene，plasmid and en-zyme-digested plasmid
M，DNA marker;1.hIL-2signal peptide gene fragment，80bp.2.PCR product of mtb8.4，330bp;3.MTB mtb8.4fragment after HindⅢ/KpnⅠdigestions;4.Expressing vector of pVS84，3400bp;5.pVS84fragment after KpnⅠ/NheⅠdigestions，3000and410bp respectively.
表1 结核菌DNA疫苗免疫后脾细胞培养上清细胞因子含量对比(略)
Table1 The concentrations of CKS in the sera or culture supernatants of the splenocytes of TB DNA vaccine immunized mice and the controls
※与pVS84及BCG免疫组比较，差异均有非常显著性(P<0.001)。其余两组间比较，差异均无显著性。
表2 结核DNA疫苗及对照组免疫小鼠的内脏组织培养的结核菌落数比较(略)
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in the spleen，liver and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control groups
结果采用M±SD表示。单位为CFU/g。
*表示与pVS84比较，细菌载量低于阴性对照组差异有显著性;**表示BCG免疫组细菌载量既低于阴性对照组又低于pVS84免疫组差异有显著性。
表3 结核DNA疫苗及对照免疫小鼠的内脏培养结核菌落数对数值比较(略)
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in log units in the spleens，livers and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control mice
从表3中可以看出，结核DNA疫苗pVS84免疫的C57BL/6小鼠的脾、肝和肺淋巴细胞载量的对数值比阴性对照组(plL2S、pVAX1和PBS)分别下降0.2，0.5和0.4个对数单位(log10)。而BCG免疫对照组的相应器官的结核菌载量分别下降0.8，0.6和0.7个log10对数单位。两组下降的幅度非常接近。
各组动物的脾、肝和肺的结核菌生长情况从小鼠脾脏分离的结核菌落显示发现，仅表达hIL-2信号肽的载体(pIL2S)(B)、pVAX1(C)和PBS(D)注射C57BL/6小鼠后，H37Rv攻击后15d脾脏悬液培养H37Rv结果，可见L-J斜面上菌落密布。pVS84(A)和BCG(E)免疫后，脾淋巴细胞培养，斜面上菌落明显减少。
3 讨论
由于BCG预防TB效果的不确定性，世界各国一直未放弃对新型结核疫苗进行的研发。从目前的发展的近况看，主要存在以下三个技术路线。一是减毒活分枝杆菌疫苗。基因操作技术的发展激起了一系列增强现正使用的BCG效用的尝试。使生物合成通路相关的基因灭活产生的营养缺陷型突变株比BCG安全，而且不受干扰 [10，11] 。BCG的免疫性可以通过导入编码哺乳动物的细胞因子如INF-γ或细胞因子的拮抗剂 [12，13] 。减毒活分枝杆菌疫苗的缺陷是加速疫苗的清除，对免疫回忆反应造成重大伤害。保护性抗原的加强表达是加强BCG免疫原性的另一种方法。携带多拷贝表达分泌性抗原Ag85B的BCG株在豚鼠模型中显示有保护作用增强 [14] 。70kDa热休克蛋白(heatshock protein)转入BCG后具有近似的效果 [15] ;二是结核菌减毒株的疫苗作用研究。减毒结核菌株的免疫效果优于BCG。改变结核菌的表面性质，破坏调控基因和营养缺陷变异株实验的结果更令人鼓舞 [16] 。挑选可干扰感染不同阶段的突变株，可以使免疫原性最优，诱导免疫记忆而且可消除不良后果。可以乐观地估计，达到上述效果，且比自然感染更好免疫原性的菌株是完全可能的。利用减毒活结核菌作为疫苗最大的隐忧是造成免疫缺陷病人结核菌感染;三是亚单位疫苗研究。核酸疫苗(nucleic acid vaccine)包括DNA疫苗(DNA vaccine)和RNA疫苗(RNA vaccine)，由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和载体组成，将其直接导入机体细胞后，并不与宿主染色体整合，而是通过宿主细胞转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗(genetic vaccine)、基因免疫(genetic immuniza-tion)或核酸免疫(nucleic acid immunization)，但目前研究最多的是DNA疫苗，由于其不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗(naked DNA vaccine) [17] 。这是近年来自基因治疗研究中所衍生而发展的一项新技术、新领域，1995年4月美国纽约科学院称核酸疫苗是疫苗学的新纪元。1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一。
Coler等 [8] 研究抗原能否刺激健康献血者的外周血淋巴细胞增殖及产生IFN-γ，并进而研究其在动物模型中产生保护性免疫时发现Mtb8.4为T细胞识别抗原。Mtb8.4基因由330个核苷酸组成(编号Rv1174c;CAA15851)，编码110个氨基酸(aa)的肽链，信号肽为28个aa(969-1025)。预测其成熟即无信号肽的分子量为8.4kDa，故编号为Mtb8.4。表达该抗原的DNA疫苗或其重组蛋白联合佐剂均能刺激产生强烈的CD 4+ T细胞和CD 8+ CTL应答，并能保护结核菌有毒株的攻击。他们以前的研究报告显示表达分支杆菌的MPT-63，MPT-83或ESAT-6的疫苗与对照组比较，肺组织的CFU的对数值只降低0.41-0.61。编码Mtb8.4抗原的DNA疫苗具有与多个DNA疫苗联合免疫的保护水平。重组Mtb8.4蛋白和Mtb8.4的DNA疫苗均可使肺组织结核菌CFU的对数值降低1 -1.2，与BCG免疫下降的程度相当。也证实表达Mtb8.4的质粒只诱导Thl型应答而不诱导体液免疫应答 [9]。说明Mtb8.4抗原是良好的保护性抗原。因此选择该抗原作为我们疫苗的主要抗原。
由于已报道的结核DNA疫苗效果不理想，主要表现在免疫保护效果达不到BCG免疫的效果，因此，设计制备了表达结核菌蛋白Mtb8.4分泌蛋白的DNA疫苗pVS84。构建的DNA疫苗pVS84及表达hIL-2信号肽的质粒pIL2S经过菌斑筛选，抗生素抗性筛选、限制性内切酶鉴定及基因测序证明，构建的DNA疫苗及pIL2S质粒的基因序列与文献报道的一致 [6～9] ，符合设计要求(图1和2)。pVS84免疫小鼠后，其脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-2、mIFN-γ分别为379.6±58.2pg/ml和529.7±63.7pg/ml，显著高于pVAX1、pIL2S和PBS对照组(P<0.001)，与BCG免疫对照组差异均无显著性。实验组和对照组脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-6和mIL-10浓度，每组之间均差异无显著性(P>0.05，见表1)。表明构建DNA疫苗pVS84可刺激机体产生Thl型免疫应答。
pVS84免疫C57BL/6小鼠组的脾、肝及肺的平均结核菌载量分别为(39176.9±3702.6)CFU/g、(18780.1±2535.8)CFU/g和(24410.3土1846.8)CFU/g，分别低于pYAX1、pIL2S和PBS等阴性对照组的相应器官的结核菌载量，差异具有显著性(P<0.001，见表2)。与BCG免疫小鼠的结核菌载量比较，3种免疫器官的平均细菌载量差异仍具有显著性。揭示本研究中构建的DNA疫苗pVS84免疫的小鼠具有抵抗标准结核菌株H37Rv经静脉攻击的能力，免疫保护作用显著。
本研究的结果表明，pVS84具有刺激机体产生的抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答的能力。小鼠经该疫苗免瘴后，抵抗结核菌H37Rv攻击的能力比对照组显著增强。此疫苗的免疫保护效果与BCG比较尚有差距，多个DNA疫苗或者与表达细胞因子联合免疫的效果如何值得深入研究。
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