早期自然流产病人血清、胎盘绒毛和蜕膜组织中 瘦素水平的测定
[摘要]目的 探讨瘦素水平与早期自然流产的关系。方法 检测25例正常早孕妇女(对照组)及30例原因不明自然流产病人(研究组)的血清、绒毛和蜕膜组织中瘦素及β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)的水平。结果研究组及对照组胎盘绒毛组织中瘦素水平均有较高表达 ，但对照组瘦素水平高于研究组( H=15.26，P <0.01)，蜕膜组织无瘦素表达。对照组血清瘦素和β-hCG水平明显高于研究组( t=9.493、5.356，P <0.01);且两者呈正相关( r=0.776，P <0.05)。结论 血清和胎盘绒毛组织中瘦素水平降低可能是发生自然流产的原因之一。
[关键词] 流产，自然;瘦素;绒毛膜促性腺激素，β亚单位，人
DETERMINATION OF LEPTIN IN THE SERUM，SYNCYTIOTROPHOBLAST AND DECIDUA IN EARLY SPONTANEOUS ABORT-ERS
ZHAN YING，QI WEI-HONG，CHEN WEI-PING， et al
(Department of Obstetrics，The Affiliated Hospital of Qing-dao University Medical College，Qingdao 266003， China)
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the relationship between leptin and early spontaneous abortion. MethodsThe levels of leptin and β-hCG in serum，syncytiotrophoblast and decidua in 30 early spontaneous aborters (control group) and 25 healthy women with early pregnancy (research group) were determined. ResultsThe levels of leptin in syncytiotrophoblast were high in both spontaneous aborters and normal gravida，but it was higher in the controls ( H=15.26，P <0.01)，no leptin was expressed in decidua. The levels of serum leptin and β-hCG were significantly lower in spontaneous aborters than in normal gravida ( t= 9.493 ， 5.356 ;P <0.01)，showing a positive correlation between the two markers( r=0.776， P <0.05). ConclusionDe-crease of leptin in serum and syncytiotrophoblast may be one of the reasons of early spontaneous abortion.
[KEY WORDS]abortion，spontaneous;leptin;chorionic gonadotropin，beta subunit，human
自然流产是早期妊娠中最常见的并发症之一，反复自然流产率为1%～2%，流产原因除解剖、遗传、内分泌、感染等因素外，约有40%～70%的病人病因不明。近年来的研究认为自然流产主要原因是胎儿-胎盘单位微环境的异常。瘦素(LP)作为细胞因子家族的成员，参与了胎儿-胎盘单位发育的调节，在流产的发生中起到了一定的作用[1]。本研究通过对原因不明的自然流产妇女血清、蜕膜、胎盘绒毛组织中瘦素水平的检测，探讨其与早期自然流产的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2004年12月～2005年6月，选择在本院门诊及住院因自然流产行清宫术者30例为研究组，平均年龄(26.8±2.3)岁，平均孕期(54.5±6.5)d，排除解剖、遗传、内分泌、感染、抗精子抗体阳性、ΑBO血 型不合等因素。另取同期正常妊娠行人工流产术者25例为对照组，平均年龄(27.2±3.1)岁，平均孕龄(52.7±5.8)d。两组年龄、孕期、孕产次及体质量指数比较无显著性差异( P >0.05)。
1.2 方法
1.2.1血清LP及β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)水平的测定 所有孕妇均于清晨空腹抽取静脉血，分离血清，-70 ℃冰箱保存，采用放射免疫分析法同批检测LP、β-hCG的含量。试剂盒由北京生物制品公司提供，批内变异系数<5%。
1.2.2蜕膜、绒毛组织中LP的免疫组化染色 将取出的正常早孕及自然流产病人的蜕膜、绒毛组织用生理盐水冲洗干净，固定于40 g/L多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，制成4 μm厚切片，采用链霉素亲和素-过氧化物酶复合物(SABC)法进行免疫组化染色。LP单克隆抗体、SABC试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂由大连蓝江生物工程有限公司提供。
1.2.3染色评分标准 以磷酸盐缓冲溶液替代一抗作为阴性对照。根据细胞染色强度和染色细胞所占百分比判断瘦素表达水平。染色强度:不染色或染色不清为0，浅黄色为1，棕黄色为2，深黄色为3。染色细胞(胞浆或胞膜中出现黄色或棕黄色颗粒)百分率:无细胞染色为0，细胞染色<25%为1，细胞染色25%～50%为2，细胞染色>50%为3。若积分之和0～1，则表达为(-)，积分之和2则为(+)，积分之和3～4则为( )，积分之和5～6则为( )。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件包对血清LP、β-hCG测量结果进行 t 检验。对LP表达数据进行Kruskal-Wallis秩和检验。
2 结果
2.1 两组血清β-hCG和LP水平的比较 两组血清β-hCG水平比较差异有显著性( t= 5.356 ，P <0.01)。两组血清LP水平比较差异有显著性( t=9.493，P <0.01)。LP水平与β-hCG水平呈正相关( r=0.776，P <0.05)。见表1。
2.2 两组胎盘绒毛及蜕膜组织中LP水平的表达 LP不论在研究组还是对照组胎盘绒毛组织中均有较高水平的表达，分别为63.3%和84.0%;对照组胎盘绒毛组织中LP的表达强度以( )～( )为主，研究组胎盘绒毛组织中LP的表达强度以(+)～( )为主，研究组LP表达水平明显低于对照组( H=15.26，P <0.01)。LP在蜕膜组织中无表达。见表2。
表1 两组病人血清LP及β-hCG水平的比较(略)
表2 两组病人胎盘绒毛组织中LP的表达(略)
3 讨论
LP是肥胖基因(Ob)的产物，参与细胞的成熟与生长，而妊娠的建立和早期胚胎发育与多种因素有关。近年来研究显示，LP对早期胚胎发育和着床过程有着重要作用。GONZALEZ等[2]发现，LP能上调在受精卵植入中起重要作用的整合素亚单位和 金属蛋白酶9的表达，有助于增加滋养细胞的侵袭力，提示LP可能以自分泌或旁分泌的方式在受精卵植入和胎盘形成过程中起着调节作用。通过逆转录聚合酶链反应技术，检测到人胎盘组织中有Ob基因mRNA的表达。来源于胎盘滋养层的细胞株JEG3和JAR有LP mRNA的表达，这些细胞可以合成和分泌人绒毛膜促性腺激素(hCG)、胎盘生乳素、孕酮等激素，因此LP也是胎盘分泌的激素，可能参与胎儿生长发育的调节[3]。免疫组化研究表明，LP存在于胎盘合体滋养层细胞的胞浆中，而在基质、绒毛膜和血管内皮细胞中均检测不到LP，证明胎盘合体滋养层细胞系产生LP的部位[4]。本研究也证实，LP不论在研究组还是对照组胎盘绒毛组织中均有较高水平的表达，但研究组中LP的表达强度和水平均低于对照组。LP在蜕膜组织中无表达。流产的发生被认为主要与异常发育的胎儿-胎盘单位有关，LP在其中的作用主要为:①LP作为细胞因子，可以通过影响胎儿-胎盘单位内的其他细胞因子之间的平衡来影响妊娠结局;②LP也可以影响细胞滋养细胞的功能，增加其hCG的合成与基质金属蛋白酶的分泌，有助于增加滋养细胞的侵袭力;③LP还具有血管生成活性，可通过影响胎盘血管丛的生成影响胎儿发育[5]。有研究证明，孕妇流产前的血中LP含量明显低下，而流产后24 h母体血中LP的含量与正常分娩后24 h的母体LP含量相似，说明孕妇血中LP含量下降是流产的标志，孕妇血中LP不足的重要原因是胎盘分泌LP能力降低。本研究也表明，对照组妇女的血清LP水平明显高于研究组，并且与β-hCG水平呈正相关;研究组胎盘绒毛组织中LP水平表达明显低于对照组，推测由于合体滋养细胞LP分泌减少，影响hCG的合成和基质金属蛋白酶的分泌，阻碍了滋养层细胞对子宫内膜的侵入和胚胎的发育，可能导致流产的发生。由于LP的表达受多种激素、生长因子和细胞因子影响，且它们之间相互调节，协调完成胚胎的发育和着床，因此，LP在自然流产中的作用机制仍有待于进一步研究证实。
[参考文献]
[1] LAIRD S M， QUINTON N D， ANSTIE B， et al. Leptin and leptin-binding activity in women with recurrent miscarriage:correlation with pregnancy outcome[J]. Hum Reprod， 2001，16(9): 2008.
[2] GONZALEZ R R， DEVOTO L， CAMPANA A， et al. Effect of leptin， interleukin-1alpha， interleukin-6， and transforming phenotype:integrins and metalloproteinases[J]. Endocrine， 2001，15(2):157.
[3] MALEK A， WILLI A， MULLER J， et al. Capacity for hor-mone production of cultured trophoblast obtained from placen- tae at term in early pregnancy[J]. J Assist Reprod Genet，2001，18(5):299.
[4] ASHWOTH C J， HOGGARD N， THOMAS L， et al. Placen-tal leptin[J]. Rev Reprod， 2000，5:18.
[5] GONZALEZ R R， SIMON C， CABALLERO-CAMPO P， et al. Leptin and reproduction[J]. Hum Reprod Update， 2000，6(3):290.
(本文编辑 厉建强)
(青岛大学医学院附属医院产科，山东 青岛 266003), 百拇医药(詹瑛，齐卫红，陈维萍，相尧美)
[关键词] 流产，自然;瘦素;绒毛膜促性腺激素，β亚单位，人
DETERMINATION OF LEPTIN IN THE SERUM，SYNCYTIOTROPHOBLAST AND DECIDUA IN EARLY SPONTANEOUS ABORT-ERS
ZHAN YING，QI WEI-HONG，CHEN WEI-PING， et al
(Department of Obstetrics，The Affiliated Hospital of Qing-dao University Medical College，Qingdao 266003， China)
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the relationship between leptin and early spontaneous abortion. MethodsThe levels of leptin and β-hCG in serum，syncytiotrophoblast and decidua in 30 early spontaneous aborters (control group) and 25 healthy women with early pregnancy (research group) were determined. ResultsThe levels of leptin in syncytiotrophoblast were high in both spontaneous aborters and normal gravida，but it was higher in the controls ( H=15.26，P <0.01)，no leptin was expressed in decidua. The levels of serum leptin and β-hCG were significantly lower in spontaneous aborters than in normal gravida ( t= 9.493 ， 5.356 ;P <0.01)，showing a positive correlation between the two markers( r=0.776， P <0.05). ConclusionDe-crease of leptin in serum and syncytiotrophoblast may be one of the reasons of early spontaneous abortion.
[KEY WORDS]abortion，spontaneous;leptin;chorionic gonadotropin，beta subunit，human
自然流产是早期妊娠中最常见的并发症之一，反复自然流产率为1%～2%，流产原因除解剖、遗传、内分泌、感染等因素外，约有40%～70%的病人病因不明。近年来的研究认为自然流产主要原因是胎儿-胎盘单位微环境的异常。瘦素(LP)作为细胞因子家族的成员，参与了胎儿-胎盘单位发育的调节，在流产的发生中起到了一定的作用[1]。本研究通过对原因不明的自然流产妇女血清、蜕膜、胎盘绒毛组织中瘦素水平的检测，探讨其与早期自然流产的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2004年12月～2005年6月，选择在本院门诊及住院因自然流产行清宫术者30例为研究组，平均年龄(26.8±2.3)岁，平均孕期(54.5±6.5)d，排除解剖、遗传、内分泌、感染、抗精子抗体阳性、ΑBO血 型不合等因素。另取同期正常妊娠行人工流产术者25例为对照组，平均年龄(27.2±3.1)岁，平均孕龄(52.7±5.8)d。两组年龄、孕期、孕产次及体质量指数比较无显著性差异( P >0.05)。
1.2 方法
1.2.1血清LP及β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)水平的测定 所有孕妇均于清晨空腹抽取静脉血，分离血清，-70 ℃冰箱保存，采用放射免疫分析法同批检测LP、β-hCG的含量。试剂盒由北京生物制品公司提供，批内变异系数<5%。
1.2.2蜕膜、绒毛组织中LP的免疫组化染色 将取出的正常早孕及自然流产病人的蜕膜、绒毛组织用生理盐水冲洗干净，固定于40 g/L多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，制成4 μm厚切片，采用链霉素亲和素-过氧化物酶复合物(SABC)法进行免疫组化染色。LP单克隆抗体、SABC试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂由大连蓝江生物工程有限公司提供。
1.2.3染色评分标准 以磷酸盐缓冲溶液替代一抗作为阴性对照。根据细胞染色强度和染色细胞所占百分比判断瘦素表达水平。染色强度:不染色或染色不清为0，浅黄色为1，棕黄色为2，深黄色为3。染色细胞(胞浆或胞膜中出现黄色或棕黄色颗粒)百分率:无细胞染色为0，细胞染色<25%为1，细胞染色25%～50%为2，细胞染色>50%为3。若积分之和0～1，则表达为(-)，积分之和2则为(+)，积分之和3～4则为( )，积分之和5～6则为( )。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件包对血清LP、β-hCG测量结果进行 t 检验。对LP表达数据进行Kruskal-Wallis秩和检验。
2 结果
2.1 两组血清β-hCG和LP水平的比较 两组血清β-hCG水平比较差异有显著性( t= 5.356 ，P <0.01)。两组血清LP水平比较差异有显著性( t=9.493，P <0.01)。LP水平与β-hCG水平呈正相关( r=0.776，P <0.05)。见表1。
2.2 两组胎盘绒毛及蜕膜组织中LP水平的表达 LP不论在研究组还是对照组胎盘绒毛组织中均有较高水平的表达，分别为63.3%和84.0%;对照组胎盘绒毛组织中LP的表达强度以( )～( )为主，研究组胎盘绒毛组织中LP的表达强度以(+)～( )为主，研究组LP表达水平明显低于对照组( H=15.26，P <0.01)。LP在蜕膜组织中无表达。见表2。
表1 两组病人血清LP及β-hCG水平的比较(略)
表2 两组病人胎盘绒毛组织中LP的表达(略)
3 讨论
LP是肥胖基因(Ob)的产物，参与细胞的成熟与生长，而妊娠的建立和早期胚胎发育与多种因素有关。近年来研究显示，LP对早期胚胎发育和着床过程有着重要作用。GONZALEZ等[2]发现，LP能上调在受精卵植入中起重要作用的整合素亚单位和 金属蛋白酶9的表达，有助于增加滋养细胞的侵袭力，提示LP可能以自分泌或旁分泌的方式在受精卵植入和胎盘形成过程中起着调节作用。通过逆转录聚合酶链反应技术，检测到人胎盘组织中有Ob基因mRNA的表达。来源于胎盘滋养层的细胞株JEG3和JAR有LP mRNA的表达，这些细胞可以合成和分泌人绒毛膜促性腺激素(hCG)、胎盘生乳素、孕酮等激素，因此LP也是胎盘分泌的激素，可能参与胎儿生长发育的调节[3]。免疫组化研究表明，LP存在于胎盘合体滋养层细胞的胞浆中，而在基质、绒毛膜和血管内皮细胞中均检测不到LP，证明胎盘合体滋养层细胞系产生LP的部位[4]。本研究也证实，LP不论在研究组还是对照组胎盘绒毛组织中均有较高水平的表达，但研究组中LP的表达强度和水平均低于对照组。LP在蜕膜组织中无表达。流产的发生被认为主要与异常发育的胎儿-胎盘单位有关，LP在其中的作用主要为:①LP作为细胞因子，可以通过影响胎儿-胎盘单位内的其他细胞因子之间的平衡来影响妊娠结局;②LP也可以影响细胞滋养细胞的功能，增加其hCG的合成与基质金属蛋白酶的分泌，有助于增加滋养细胞的侵袭力;③LP还具有血管生成活性，可通过影响胎盘血管丛的生成影响胎儿发育[5]。有研究证明，孕妇流产前的血中LP含量明显低下，而流产后24 h母体血中LP的含量与正常分娩后24 h的母体LP含量相似，说明孕妇血中LP含量下降是流产的标志，孕妇血中LP不足的重要原因是胎盘分泌LP能力降低。本研究也表明，对照组妇女的血清LP水平明显高于研究组，并且与β-hCG水平呈正相关;研究组胎盘绒毛组织中LP水平表达明显低于对照组，推测由于合体滋养细胞LP分泌减少，影响hCG的合成和基质金属蛋白酶的分泌，阻碍了滋养层细胞对子宫内膜的侵入和胚胎的发育，可能导致流产的发生。由于LP的表达受多种激素、生长因子和细胞因子影响，且它们之间相互调节，协调完成胚胎的发育和着床，因此，LP在自然流产中的作用机制仍有待于进一步研究证实。
[参考文献]
[1] LAIRD S M， QUINTON N D， ANSTIE B， et al. Leptin and leptin-binding activity in women with recurrent miscarriage:correlation with pregnancy outcome[J]. Hum Reprod， 2001，16(9): 2008.
[2] GONZALEZ R R， DEVOTO L， CAMPANA A， et al. Effect of leptin， interleukin-1alpha， interleukin-6， and transforming phenotype:integrins and metalloproteinases[J]. Endocrine， 2001，15(2):157.
[3] MALEK A， WILLI A， MULLER J， et al. Capacity for hor-mone production of cultured trophoblast obtained from placen- tae at term in early pregnancy[J]. J Assist Reprod Genet，2001，18(5):299.
[4] ASHWOTH C J， HOGGARD N， THOMAS L， et al. Placen-tal leptin[J]. Rev Reprod， 2000，5:18.
[5] GONZALEZ R R， SIMON C， CABALLERO-CAMPO P， et al. Leptin and reproduction[J]. Hum Reprod Update， 2000，6(3):290.
(本文编辑 厉建强)
(青岛大学医学院附属医院产科，山东 青岛 266003), 百拇医药(詹瑛，齐卫红，陈维萍，相尧美)