霉酚酸对树突状细胞延长移植肾存活效应的影响
霉酚酸对树突状细胞延长移植肾存活效应的影响 (pdf)
[摘要] 目的 探讨霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)对树突状细胞(dendritic cells,DC)延长移植肾存活效应的影响。方法 以BN、Lewis大鼠为肾移植供、受体；在供体DC培养过程中加入两种浓度MPA，以CTLA-4Ig基因转染DC使之成为表达CTLA-4Ig的致耐受DC；观察DC形态变化并检测受体脾细胞对上述DC的刺激反应。将未处理的致耐受DC以及0.05 μmol/L MPA处理DC于肾移植前72 h分别注入受体(组1、组2)，注入供体DC的受体为组3，未注入DC的受体为对照(组4)，观察受体血肌酐变化和移植肾存活时间。结果 MPA组DC形态老化延缓，脾细胞对两种浓度MPA处理的DC刺激反应均显著低于对未经MPA处理致耐受DC的刺激反应；与对照相比，组1、组2移植肾存活时间显著延长(P<0.01)，其中组2延长更为明显[(76.1±14.6)天vs(8.9±0.8)天，P<0.001]，组3存活时间显著缩短(5.3±0.6天,P<0.05)。术后45天后组2血肌酐水平明显低于组1。结论 MPA预处理可降低致耐受DC的抗原提呈能力，提高其延长移植肾存活的效能。
[关键词] 霉酚酸；树突状细胞；肾移植
Influence of mycophenolic acid on survival prolongation of renal allografts with tolerogenic dendritic cells
LI Jie,ZHANG Yin-fu,HUANG Chi-bing,et al.Department of Urology,Xinqiao Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing 400037,China
[Abstract] Objective To study the influence of mycophenolic acid (MPA) on survival prolongation of renal allografts with tolerogenic dendritic cells(DC)in rats.Methods The influence of MPA on CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs was observed in vitro morphologically and functionally. The influence of MPA on the survival time and function of the renal allografts was observed in a BN→Lewis kidney transplantation model with recipients treated by CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs.Results The maturation and aging of DC were delayed and the stimulating ability of DC to recipient splenic cells was impaired significantly with the adding of MPA. Survival time of renal allografts in CTLA-4Ig-gene-transferred DC group was prolonged significantly (compared with control,57.1±13.4 d vs 8.9±0.8 d,P<0.01) and further prolonged with the adding of MPA (76.1±14.6 d vs 8.9±0.8 d，P<0.001).The allografts functioned well even after forty-five days postoperatively in recipient treated with MPA preconditioned DC.Conclusion MPA preconditioning impairs the ability of antigen presentation of CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs and enhances it’s efficacy of survival prolongation of renal allografts in rats.
[Key words] mycophenolic acid;dendritic cells;kidney transplantation
树突状细胞(dendritic cells,DC)是介导器官移植排斥反应的重要成分，通过其表面的B7分子与抗原特异性T细胞表面的CD28分子结合所提供的共刺激信号对T细胞的激活起重要作用[1]。前期研究中，本中心采用B7分子阻断剂CTLA-4Ig基因转染供体DC，获得了表达CTLA-4Ig的致耐受DC，延长了移植肾存活时间，但未能实现长期存活。我们观察到CTLA-4Ig基因转染过程中DC迅速老化现象[2]，研究表明成熟DC表达更多的共刺激分子，可能阻碍CTLA-4Ig充分发挥作用[3]。资料显示，霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)具有抑制DC成熟的作用[4]。本研究观察了MPA预处理对致耐受DC形态和体外功能的影响，以及其对致耐受DC延长移植肾存活效应的影响，旨在探讨提高致耐受DC效能的方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料 肾移植供体为近交系Brown-Norway(BN)大鼠(本校西南医院烧伤研究所提供)，体重250～300 g；受体为近交系Lewis大鼠(本校西南医院烧伤研究所提供)，体重250～300 g，雌雄不拘。重组大鼠GM-CSF、IL-4均为美国R&D产品；FITC标记的小鼠抗大鼠DC单抗OX62，PE标记的小鼠抗人CTLA-4单抗均为美国Pharmingen产品。MPA购自Roche Bioscience，溶于甲醇，4 ℃放置过夜，过滤除菌后备用。美国Bio-Rad 450酶标仪，XTS-6A手术显微镜(江苏镇江中天光学仪器厂)。CTLA-4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA-4Ig由笔者构建[5]，滴度为5×109 pfu/ml。
1.2 方法
1.2.1 DC培养 根据文献方法[6]分离供体大鼠骨髓细胞，一组加入含20%胎牛血清RPMI 1640培养基的24孔板中以GM-CSF和IL-4刺激培养，另外3组按上述方法培养的同时分别加入终浓度为0.05 μmol/L和0.1 μmol/L的MPA。培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，以出现树枝状突起的细胞作为DC的形态学特征，培养后6天以流式细胞术根据DC表面标志OX62进行鉴定，收集阳性率达85%以上的培养皿中DC，用含20%胎牛血清RPMI 1640重悬，调整细胞密度为1×106/ml，备用。
1.2.2 CTLA-4Ig基因转染DC 按感染复数(MOI)500∶1向每毫升DC中加入AdvCTLA-4Ig，分置于24孔板中37 ℃孵育48 h后用0.01 M PBS反复洗涤、离心3次，收集DC，流式细胞术检测DC表面CTLA-4的阳性率，收集阳性率达95%以上的培养皿中DC，以含20%胎牛血清RPMI 1640重悬，制成1×106/ml细胞悬液。
1.2.3 受体脾细胞对DC的刺激反应检测 以DC为刺激细胞，根据DC性质分为：未经其他处理的DC(Control DC),CTLA-4Ig修饰的致耐受DC(CTLA-4Ig DC),以及0.05 μmol/L和0.1 μmol/L两种浓度MPA处理的致耐受DC(MPA DC1、MPA DC2)，各种DC同时培养，以CTLA-4Ig修饰DC完毕为刺激起点(培养后第8天)。以受体脾细胞为反应细胞，按文献方法[7]，用1%异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉受体，切取Lewis受体脾脏，分离脾细胞，用含20%胎牛血清的RPMI-1640重悬脾细胞，调整细胞密度为1×106/ml。在96孔板中，将脾细胞和DC各100 μl加入同一孔中，每一反应组设3个复孔，分别测定受体脾细胞对供体DC、CTLA-4Ig修饰的致耐受DC以及两种浓度MPA预处理的致耐受DC的刺激反应。在37 ℃于5%CO2条件下孵育细胞，每天轻轻摇动96孔板，使细胞充分接触、反应，孵育72 h，MTT法检测反应结果：每孔吸出培养液50 μl，加MTT 20 μl，37 ℃，继续孵育5 h，吸出培养液100 μl，加入无水乙醇100 μl，置37 ℃ 10 min，用酶标仪测OD值(波长595 nm)。
1.2.4 DC延长移植肾存活的效能 按注入受体DC的不同分为4组：注入未经MPA处理的致耐受DC为组1(n=8)，注入经0.05 μmol/L MPA处理的致耐受DC为组2(n=8)，注入未经任何处理的供体DC为组3(n=8)，未注入DC的受体为对照(组4)(n=6)。术前72 h,受体Lewis大鼠经1%异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(100 mg/kg)后，在显微镜下经股静脉注入1×106个DC。按过去建立的方法[8]行BN→Lewis同种肾移植，以停止排尿为终点，计算移植肾存活时间。
1.2.5 移植肾延长存活期间受体大鼠血肌酐检测 受体于移植前72 h、移植后第15天、30天、60天经1%异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(100 mg/kg)后，在显微镜下经股静脉穿刺抽血0.5～1 ml检测血清肌酐(SCr)浓度。
1.3 统计学方法 t检验处理各组数据，统计学显著性标准：P<0.05为差异有显著性；P<0.01为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 DC培养以及CTLA-4Ig的修饰 倒置显微镜下观察到，未经处理培养组骨髓细胞分离当天仅有个别DC形态的细胞，培养后第3天开始DC形态细胞逐渐增多，第6～7天出现大量DC形态的细胞并逐渐悬浮，10天后DC出现树突活动逐渐减少、僵直等老化现象。加入MPA后，DC出现树突形态时间无明显变化，但其老化现象延迟，0.05 μmol/L和0.1 μmol/L浓度组至16～17天后才出现。培养6天后，以流式细胞术检测各孔DC形态悬浮细胞表面标志OX62，阳性率为83.1%～92.6%。各组DC与AdvCTLA-4Ig孵育48 h后检测各孔中DC的CTLA-4阳性率为92.9%～96.1%，孵育后3天，两种浓度MPA组DC未见明显老化改变，无MPA组DC出现明显老化现象。
2.2 各组DC对受体脾细胞刺激能力 见表1。两种浓度MPA均显著降低了DC对脾细胞的刺激能力，其中0.05 μmol/L浓度组可达到和0.1 μmol/L高浓度组相同效果。
2.3 不同DC对移植肾及受体存活的影响 见表2。
2.4 各组移植肾功能的比较 术后第15天组3、组4受体因肾功能衰竭已全部死亡，各组血清肌酐变化，见表3。表1 不同DC对受体脾细胞刺激能力 (略) 注：与组2～4比较，▲P<0.001;与组3、4比较，■P<0.01；与组5比较，●P>0.05表2 不同DC对移植肾及受体存活的影响 (略)注：与组3、4比较，▲P<0.01;与组1、3、4比较，■P<0.01；与组4比较，★P<0.05表3 肾移植术后大鼠肾功能变化 (略)注：与同期其他组比较，▲P>0.05;与组2比较，■P<0.05；与术前比较，■P<0.05
3 讨论
作为目前发现的功能最强的抗原提呈细胞(APC)，DC在诱导移植抗原特异性免疫低反应甚至耐受中的作用正在得到广泛研究。目前发现高表达共刺激分子阻断剂如CTLA-4Ig的DC或者处于非成熟阶段的DC均有诱导受体抗原特异性T细胞产生免疫低反应状态的能力(即致耐受性)。本中心前期研究已经观察到CTLA-4Ig基因修饰DC在延长移植肾存活中的作用，但同时也观察到DC培养尤其是CTLA-4Ig基因修饰过程中DC的迅速成熟以及老化现象。研究发现DC成熟程度与诱导耐受能力成反比[9]，其重要原因是DC表面共刺激分子的表达随成熟进程而增加。理论上，抑制DC培养和CTLA-4Ig基因修饰过程中DC的成熟及老化可能有助于提高CTLA-4Ig基因修饰DC的致耐受能力。近年研究发现，免疫抑制剂霉酚酸酯(mycophenolate mofetil,MMF)的活性代谢产物MPA不仅具有抑制T、B淋巴细胞的作用，还可通过延缓DC的成熟过程抑制其抗原提呈功能[4]。本研究观察到，在DC培养过程中加入MPA后，一般在培养后10天出现的形态老化延迟6～7天发生。CTLA-4Ig基因转染DC过程中老化发生尤其迅速，MPA可有效抑制这一过程的发生。供体DC经CTLA-4Ig修饰后对受体脾细胞的刺激能力明显减弱，而MPA的预处理进一步降低了其对脾细胞的刺激能力，显示CTLA-4Ig修饰与MPA联合应用具有降低DC抗原提呈能力的协同作用。MPA对DC的上述作用在一定浓度范围内具有量-效关系，本研究中MPA的合适浓度为0.05 μmol/L。在进一步的肾移植实验中观察到，未经处理的供体DC诱发移植肾强烈排斥反应，使其提前丧失功能，可能是该DC在移植早期直接提呈供体抗原，激活抗供体抗原特异性淋巴细胞所致。经CTLA-4Ig修饰后的供体DC的则明显延长了移植肾存活，显示CTLA-4Ig有效发挥了阻断DC与抗原特异性T细胞间B7/CD28共刺激信号的作用，可能使T细胞发生无能或凋亡。MPA对DC的预处理进一步延长了移植肾的存活时间，接近了长期存活的目标(>100天)，显示MPA预处理提高了CTLA-4Ig修饰的供体DC延长移植肾存活的效能。上述研究显示MPA预处理可延缓培养过程中以及CTLA-4Ig致耐受处理过程中DC的成熟和老化，可提高CTLA-4Ig修饰的供体DC延长移植肾存活的效能，但未能实现长期存活的原因有待进一步探讨。
[参考文献]
1 Peche H,Trinite B,Martinet B,et al.Prolongation of heart allograft survival by immature dendritic cells generated from recipient type bone marrow progenitors.Am J Transplant,2005,5(2):255-267.
2 黄赤兵，张银甫，范明齐，等.共刺激阻断剂CTLA-4Ig基因修饰的树突状细胞对移植肾存活的影响.中国现代医学杂志，2006,16(1):57-59.
3 Colic M,Stojic-Vukanic Z,Pavlovic B,et al.Mycophenolate mofetil inhibits differentiation,maturation and allostimulatory function of human monocyte-derived dendritic cells.Clin Exp Immunol,2003,134(1):63-69.
4 Lagaraine C,Hoarau C,Chabot V,et al.Mycophenolic acid-treated human dendritic cells have a mature migratory phenotype and inhibit allogeneic responses via direct and indirect pathways.Int Immunol，2005,17(4):351-363.
5 黄赤兵，吴军，易绍萱，等.共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定.重庆医学,2002,31(8)：682-683.
6 Talmor M,Mirza A,Turley S,et al.Generation of large numbers of immature and mature dendritic cells from rat bone marrow cultures.Eur J Immunol,1998,28(3):811-817.
7 黄赤兵，吴军，易绍萱，等.基因重组融合蛋白B7-CD28共刺激阻断剂对大鼠移植肾存活的影响.中华外科杂志,2001,39(7):553-555.
8 黄赤兵,方玉华,吴军，等.应用新技术建立大鼠肾移植模型.中华器官移植杂志，2001,22(2):114.
9 Nouri-Shirazi M,Guinet E.Direct and indirect cross-tolerance of alloreactive T cells by dendritic cells retained in the immature stage.Transplantation,2002,74(7):1035-1044.
作者单位： 400037 重庆，第三军医大学新桥医院泌尿外科肾移植中心
(编辑：周 蕊), 百拇医药(李杰，张银甫，黄赤兵，范明齐，王平贤，冯嘉瑜，肖 )
[摘要] 目的 探讨霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)对树突状细胞(dendritic cells,DC)延长移植肾存活效应的影响。方法 以BN、Lewis大鼠为肾移植供、受体；在供体DC培养过程中加入两种浓度MPA，以CTLA-4Ig基因转染DC使之成为表达CTLA-4Ig的致耐受DC；观察DC形态变化并检测受体脾细胞对上述DC的刺激反应。将未处理的致耐受DC以及0.05 μmol/L MPA处理DC于肾移植前72 h分别注入受体(组1、组2)，注入供体DC的受体为组3，未注入DC的受体为对照(组4)，观察受体血肌酐变化和移植肾存活时间。结果 MPA组DC形态老化延缓，脾细胞对两种浓度MPA处理的DC刺激反应均显著低于对未经MPA处理致耐受DC的刺激反应；与对照相比，组1、组2移植肾存活时间显著延长(P<0.01)，其中组2延长更为明显[(76.1±14.6)天vs(8.9±0.8)天，P<0.001]，组3存活时间显著缩短(5.3±0.6天,P<0.05)。术后45天后组2血肌酐水平明显低于组1。结论 MPA预处理可降低致耐受DC的抗原提呈能力，提高其延长移植肾存活的效能。
[关键词] 霉酚酸；树突状细胞；肾移植
Influence of mycophenolic acid on survival prolongation of renal allografts with tolerogenic dendritic cells
LI Jie,ZHANG Yin-fu,HUANG Chi-bing,et al.Department of Urology,Xinqiao Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing 400037,China
[Abstract] Objective To study the influence of mycophenolic acid (MPA) on survival prolongation of renal allografts with tolerogenic dendritic cells(DC)in rats.Methods The influence of MPA on CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs was observed in vitro morphologically and functionally. The influence of MPA on the survival time and function of the renal allografts was observed in a BN→Lewis kidney transplantation model with recipients treated by CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs.Results The maturation and aging of DC were delayed and the stimulating ability of DC to recipient splenic cells was impaired significantly with the adding of MPA. Survival time of renal allografts in CTLA-4Ig-gene-transferred DC group was prolonged significantly (compared with control,57.1±13.4 d vs 8.9±0.8 d,P<0.01) and further prolonged with the adding of MPA (76.1±14.6 d vs 8.9±0.8 d，P<0.001).The allografts functioned well even after forty-five days postoperatively in recipient treated with MPA preconditioned DC.Conclusion MPA preconditioning impairs the ability of antigen presentation of CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs and enhances it’s efficacy of survival prolongation of renal allografts in rats.
[Key words] mycophenolic acid;dendritic cells;kidney transplantation
树突状细胞(dendritic cells,DC)是介导器官移植排斥反应的重要成分，通过其表面的B7分子与抗原特异性T细胞表面的CD28分子结合所提供的共刺激信号对T细胞的激活起重要作用[1]。前期研究中，本中心采用B7分子阻断剂CTLA-4Ig基因转染供体DC，获得了表达CTLA-4Ig的致耐受DC，延长了移植肾存活时间，但未能实现长期存活。我们观察到CTLA-4Ig基因转染过程中DC迅速老化现象[2]，研究表明成熟DC表达更多的共刺激分子，可能阻碍CTLA-4Ig充分发挥作用[3]。资料显示，霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)具有抑制DC成熟的作用[4]。本研究观察了MPA预处理对致耐受DC形态和体外功能的影响，以及其对致耐受DC延长移植肾存活效应的影响，旨在探讨提高致耐受DC效能的方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料 肾移植供体为近交系Brown-Norway(BN)大鼠(本校西南医院烧伤研究所提供)，体重250～300 g；受体为近交系Lewis大鼠(本校西南医院烧伤研究所提供)，体重250～300 g，雌雄不拘。重组大鼠GM-CSF、IL-4均为美国R&D产品；FITC标记的小鼠抗大鼠DC单抗OX62，PE标记的小鼠抗人CTLA-4单抗均为美国Pharmingen产品。MPA购自Roche Bioscience，溶于甲醇，4 ℃放置过夜，过滤除菌后备用。美国Bio-Rad 450酶标仪，XTS-6A手术显微镜(江苏镇江中天光学仪器厂)。CTLA-4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA-4Ig由笔者构建[5]，滴度为5×109 pfu/ml。
1.2 方法
1.2.1 DC培养 根据文献方法[6]分离供体大鼠骨髓细胞，一组加入含20%胎牛血清RPMI 1640培养基的24孔板中以GM-CSF和IL-4刺激培养，另外3组按上述方法培养的同时分别加入终浓度为0.05 μmol/L和0.1 μmol/L的MPA。培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，以出现树枝状突起的细胞作为DC的形态学特征，培养后6天以流式细胞术根据DC表面标志OX62进行鉴定，收集阳性率达85%以上的培养皿中DC，用含20%胎牛血清RPMI 1640重悬，调整细胞密度为1×106/ml，备用。
1.2.2 CTLA-4Ig基因转染DC 按感染复数(MOI)500∶1向每毫升DC中加入AdvCTLA-4Ig，分置于24孔板中37 ℃孵育48 h后用0.01 M PBS反复洗涤、离心3次，收集DC，流式细胞术检测DC表面CTLA-4的阳性率，收集阳性率达95%以上的培养皿中DC，以含20%胎牛血清RPMI 1640重悬，制成1×106/ml细胞悬液。
1.2.3 受体脾细胞对DC的刺激反应检测 以DC为刺激细胞，根据DC性质分为：未经其他处理的DC(Control DC),CTLA-4Ig修饰的致耐受DC(CTLA-4Ig DC),以及0.05 μmol/L和0.1 μmol/L两种浓度MPA处理的致耐受DC(MPA DC1、MPA DC2)，各种DC同时培养，以CTLA-4Ig修饰DC完毕为刺激起点(培养后第8天)。以受体脾细胞为反应细胞，按文献方法[7]，用1%异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉受体，切取Lewis受体脾脏，分离脾细胞，用含20%胎牛血清的RPMI-1640重悬脾细胞，调整细胞密度为1×106/ml。在96孔板中，将脾细胞和DC各100 μl加入同一孔中，每一反应组设3个复孔，分别测定受体脾细胞对供体DC、CTLA-4Ig修饰的致耐受DC以及两种浓度MPA预处理的致耐受DC的刺激反应。在37 ℃于5%CO2条件下孵育细胞，每天轻轻摇动96孔板，使细胞充分接触、反应，孵育72 h，MTT法检测反应结果：每孔吸出培养液50 μl，加MTT 20 μl，37 ℃，继续孵育5 h，吸出培养液100 μl，加入无水乙醇100 μl，置37 ℃ 10 min，用酶标仪测OD值(波长595 nm)。
1.2.4 DC延长移植肾存活的效能 按注入受体DC的不同分为4组：注入未经MPA处理的致耐受DC为组1(n=8)，注入经0.05 μmol/L MPA处理的致耐受DC为组2(n=8)，注入未经任何处理的供体DC为组3(n=8)，未注入DC的受体为对照(组4)(n=6)。术前72 h,受体Lewis大鼠经1%异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(100 mg/kg)后，在显微镜下经股静脉注入1×106个DC。按过去建立的方法[8]行BN→Lewis同种肾移植，以停止排尿为终点，计算移植肾存活时间。
1.2.5 移植肾延长存活期间受体大鼠血肌酐检测 受体于移植前72 h、移植后第15天、30天、60天经1%异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(100 mg/kg)后，在显微镜下经股静脉穿刺抽血0.5～1 ml检测血清肌酐(SCr)浓度。
1.3 统计学方法 t检验处理各组数据，统计学显著性标准：P<0.05为差异有显著性；P<0.01为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 DC培养以及CTLA-4Ig的修饰 倒置显微镜下观察到，未经处理培养组骨髓细胞分离当天仅有个别DC形态的细胞，培养后第3天开始DC形态细胞逐渐增多，第6～7天出现大量DC形态的细胞并逐渐悬浮，10天后DC出现树突活动逐渐减少、僵直等老化现象。加入MPA后，DC出现树突形态时间无明显变化，但其老化现象延迟，0.05 μmol/L和0.1 μmol/L浓度组至16～17天后才出现。培养6天后，以流式细胞术检测各孔DC形态悬浮细胞表面标志OX62，阳性率为83.1%～92.6%。各组DC与AdvCTLA-4Ig孵育48 h后检测各孔中DC的CTLA-4阳性率为92.9%～96.1%，孵育后3天，两种浓度MPA组DC未见明显老化改变，无MPA组DC出现明显老化现象。
2.2 各组DC对受体脾细胞刺激能力 见表1。两种浓度MPA均显著降低了DC对脾细胞的刺激能力，其中0.05 μmol/L浓度组可达到和0.1 μmol/L高浓度组相同效果。
2.3 不同DC对移植肾及受体存活的影响 见表2。
2.4 各组移植肾功能的比较 术后第15天组3、组4受体因肾功能衰竭已全部死亡，各组血清肌酐变化，见表3。表1 不同DC对受体脾细胞刺激能力 (略) 注：与组2～4比较，▲P<0.001;与组3、4比较，■P<0.01；与组5比较，●P>0.05表2 不同DC对移植肾及受体存活的影响 (略)注：与组3、4比较，▲P<0.01;与组1、3、4比较，■P<0.01；与组4比较，★P<0.05表3 肾移植术后大鼠肾功能变化 (略)注：与同期其他组比较，▲P>0.05;与组2比较，■P<0.05；与术前比较，■P<0.05
3 讨论
作为目前发现的功能最强的抗原提呈细胞(APC)，DC在诱导移植抗原特异性免疫低反应甚至耐受中的作用正在得到广泛研究。目前发现高表达共刺激分子阻断剂如CTLA-4Ig的DC或者处于非成熟阶段的DC均有诱导受体抗原特异性T细胞产生免疫低反应状态的能力(即致耐受性)。本中心前期研究已经观察到CTLA-4Ig基因修饰DC在延长移植肾存活中的作用，但同时也观察到DC培养尤其是CTLA-4Ig基因修饰过程中DC的迅速成熟以及老化现象。研究发现DC成熟程度与诱导耐受能力成反比[9]，其重要原因是DC表面共刺激分子的表达随成熟进程而增加。理论上，抑制DC培养和CTLA-4Ig基因修饰过程中DC的成熟及老化可能有助于提高CTLA-4Ig基因修饰DC的致耐受能力。近年研究发现，免疫抑制剂霉酚酸酯(mycophenolate mofetil,MMF)的活性代谢产物MPA不仅具有抑制T、B淋巴细胞的作用，还可通过延缓DC的成熟过程抑制其抗原提呈功能[4]。本研究观察到，在DC培养过程中加入MPA后，一般在培养后10天出现的形态老化延迟6～7天发生。CTLA-4Ig基因转染DC过程中老化发生尤其迅速，MPA可有效抑制这一过程的发生。供体DC经CTLA-4Ig修饰后对受体脾细胞的刺激能力明显减弱，而MPA的预处理进一步降低了其对脾细胞的刺激能力，显示CTLA-4Ig修饰与MPA联合应用具有降低DC抗原提呈能力的协同作用。MPA对DC的上述作用在一定浓度范围内具有量-效关系，本研究中MPA的合适浓度为0.05 μmol/L。在进一步的肾移植实验中观察到，未经处理的供体DC诱发移植肾强烈排斥反应，使其提前丧失功能，可能是该DC在移植早期直接提呈供体抗原，激活抗供体抗原特异性淋巴细胞所致。经CTLA-4Ig修饰后的供体DC的则明显延长了移植肾存活，显示CTLA-4Ig有效发挥了阻断DC与抗原特异性T细胞间B7/CD28共刺激信号的作用，可能使T细胞发生无能或凋亡。MPA对DC的预处理进一步延长了移植肾的存活时间，接近了长期存活的目标(>100天)，显示MPA预处理提高了CTLA-4Ig修饰的供体DC延长移植肾存活的效能。上述研究显示MPA预处理可延缓培养过程中以及CTLA-4Ig致耐受处理过程中DC的成熟和老化，可提高CTLA-4Ig修饰的供体DC延长移植肾存活的效能，但未能实现长期存活的原因有待进一步探讨。
[参考文献]
1 Peche H,Trinite B,Martinet B,et al.Prolongation of heart allograft survival by immature dendritic cells generated from recipient type bone marrow progenitors.Am J Transplant,2005,5(2):255-267.
2 黄赤兵，张银甫，范明齐，等.共刺激阻断剂CTLA-4Ig基因修饰的树突状细胞对移植肾存活的影响.中国现代医学杂志，2006,16(1):57-59.
3 Colic M,Stojic-Vukanic Z,Pavlovic B,et al.Mycophenolate mofetil inhibits differentiation,maturation and allostimulatory function of human monocyte-derived dendritic cells.Clin Exp Immunol,2003,134(1):63-69.
4 Lagaraine C,Hoarau C,Chabot V,et al.Mycophenolic acid-treated human dendritic cells have a mature migratory phenotype and inhibit allogeneic responses via direct and indirect pathways.Int Immunol，2005,17(4):351-363.
5 黄赤兵，吴军，易绍萱，等.共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定.重庆医学,2002,31(8)：682-683.
6 Talmor M,Mirza A,Turley S,et al.Generation of large numbers of immature and mature dendritic cells from rat bone marrow cultures.Eur J Immunol,1998,28(3):811-817.
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作者单位： 400037 重庆，第三军医大学新桥医院泌尿外科肾移植中心
(编辑：周 蕊), 百拇医药(李杰，张银甫，黄赤兵，范明齐，王平贤，冯嘉瑜，肖 )