三氧化二砷与刺五加合用诱导HeLa细胞凋亡的实验研究
摘要：目的探讨三氧化二砷与刺五加合用对癌细胞生长的抑制作用及其机理。方法以 HeLa细胞的生长抑制情况，流式细胞仪 PI单染法检测药物诱导细胞的凋亡状况。结果两药合用24 h组细胞变小变圆，脱落情况都较其他组明显，该组细胞生长抑制率明显高于单用组，合用24 h组细胞的凋亡率明显高于合用16 h和8 h组(P<0.01)。结论刺五加可以作为三氧化二砷的抗癌增效剂，两药合用有很强的抗癌活性，其作用机理与抑制癌细胞生长、诱导其凋亡有关。
关键词：三氧化二砷； 刺五加； HeLa细胞； 凋亡
Experimental Study on the Apoptosis of HeLa Cells Induced by Arsenic Trioxide and acanthopanax senticosus
HUANG Liujiao, ZHAO Gang
(Department of Basic Medicine, Hubei College of Triditional Chinese Medicine ,Wuhan 430061, China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of Arsenic trioxide and Acanthopanax Senticosus on carcinoma cells and its probable mechanism.MethodsHeLa cells were cultured as a pathological model. HeLa cells structural change were examined by inverted phase microscope. The inhibition effect on the growth of cells was evaluated by microculture tetrazolium assay(MTT). The apoptosis of cells were detected by flow cytometry(FCM).ResultsThe cells of the group of two medicines used together turned smaller and rounder than other groups .The growth inhibited rate of this group was higher than that of control group. The apoptosis rate of two medicines used together 24 hours was higher than 16 hours and 8 hours(P<0.01).ConclusionAcanthopanax Senticosus can improve the antitumor effects of Arsenic trioxide ,but whether it can decrease the toxicities of Arsenic trioxide or not is worth more studying.
Key words:Acanthopanax senticosus; Arsenic trioxide; HeLa cell; Apoptosis
三氧化二砷(As2O3)是中药砒霜的主要成分，祖国医学中它曾被用于治疗恶性肿瘤等多种疾病，但 As2O3又是一种能引起机体细胞染色体畸变的剧毒物质，故长期以来它的药用价值一直被其毒副作用所掩盖，直到近年来，我国研究者发现 As2O3对急性早幼粒细胞白血病具有良好的治疗效果[1，2]，它的药用价值才被人们重新审视，有关 As2O3抗肿瘤作用及其机理的研究近年来取得了较大进展，发现该药具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用[3~5]。刺五加Acanthopanax senticosus是临床上常用中药，具有益气健脾、补肾安神的功效，可作为细胞毒抗癌药的辅助剂。动物实验证实，刺五加能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制实验性肿瘤的生长和转移[6]。本研究以人宫颈癌细胞系 HeLa细胞为病理模型，将刺五加与 As2O3联合作用于HeLa细胞，以探讨两药合用对肿瘤细胞生长抑制和诱导其发生凋亡的作用，了解刺五加对 As2O3的抗肿瘤作用是否具有增强效应，为临床上两种中药合用治疗恶性肿瘤提供细胞学的实验依据。
1 材料与方法
1.1 药品与仪器刺五加注射液(20 ml/支，黑龙江省珍宝岛制药有限公司)；亚砷酸注射液(规格10 mg/10 ml,哈尔滨伊达药业有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT,Amresco公司)；RPMI1640培养基(美国 GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青生物制品公司)；酶标仪(560型，美国 BIORAD公司)，流式细胞仪(FACS calibur型，美国 BD公司)；数码相机(日本 Canon公司)。
1.2 细胞系HeLa细胞，为人宫颈癌细胞系，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
1.3 药用浓度的确定
1.3.1 刺五加药用浓度的确定采用 MTT法，取对数生长期 HeLa细胞，1×105/ml的细胞100 μl至96孔培养板，加入等量不同浓度的刺加五溶液，使各组终浓度分别为0.1，0.5，1， 1.5 mg/ml，每个浓度组和对照组均设5个重复孔，以加细胞而不加药物组为空白对照组。37℃ ，5%CO2培养箱培养24 h后，取出培养板，弃旧培养液，每孔加入5 mg/ml的 MTT溶液20 μl，37℃ 继续培养4 h，弃培养液，每孔加入 DMSO 150 μl，振荡15 min，使结晶物充分溶解，最后在酶标仪上用490 nm波长测定各孔的 OD值，计算细胞存活率和半数抑制浓度(IC50)，从而确定刺五加的用药浓度为0.5 mg/ml。
1.3.2 As2O3药用浓度的确定参考文献，采用最小有效浓度2 μmol/L[7]。
1.4 两药合用对 HeLa细胞的生长抑制实验采用 MTT法，实验共分4组，空白对照组，As2O3组，刺五加组及 As2O3与刺五加合用组，所有操作方法同3.1，最后计算细胞的生长抑制率。
生长抑制率=1-(实验孔平均OD值) 对照孔平均 OD值×100%
1.5 细胞凋亡的检测采用流式细胞仪 PI单染色法取24孔培养板3个，每板随机分为4组(空白对照组，As2O3组，刺五加组及As2O3与刺五加合用组)，每组6个重复孔，每孔加入浓度为1×105/ml的 HeLa细胞悬液800 μl，生长至对数生长期，去旧液，每孔加含10%新生牛血清的1640培养液，同时分别加入生理盐水、刺加五溶液，As2O3及两药合加，使每孔液体总量相等，同时保证每孔刺五加终浓度为0.5 mg/ml，As2O3终浓度为2 μmol/L37℃，5%CO2培养箱分别培养8 ，16，24 h后，收集每组细胞，PBS洗涤1次，离心去 PBS，加入冰预冷的70%乙醇3 ml，4℃固定24 h以上，离心去固定液，3 ml PBS重悬细胞。离心5 min去 PBS，每管加入1 mlPI染液，室温避光反应30 min。制备好的细胞悬液经300目尼龙筛网过滤后立即在流式细胞仪上检测，CELLQuest软件获取并分析检测数据。
1.6 细胞形态学观察按上述方法分别让药物作用细胞8 ，16，24 h，然后在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并用数码相机照相记录结果。
2 结果
2.1 细胞生长抑制率刺五加与 As2O3合用对 HeLa细胞增殖有显著的抑制作用。结果见表1。
表1 药物对 HeLa细胞的生长抑制率(略)
c与 b比较，P<0.01，c与a比较，P<0.01
2.2 HeLa细胞的凋亡分别观察药物作用 HeLa细胞8，16，24 h的凋亡情况，结果显示两药合用能明显诱导 HeLa细胞凋亡，且有明显的时间依赖性(见表2)，合 用16，24 h流式检测出现明显的凋亡峰。见图1。
a对照组流式 b两药合用24 h凋亡 c两药合用16 h凋亡
图1 刺五加与As2O3合用诱导HeLaxl细胞凋亡的流式检测图(略)
表2 药物作用 HeLa细胞不同时间的细胞凋亡率(略)
c与相对应时间 a，b各组认及生理盐水组比较，P<0.01；c24与c8，c16比较P<0.01；b与相对时间a组和生盐盐组比较， P<0.05
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)是机体中普遍存在的重要的生物学事件，是受基因调控的主动性死亡过程，其形态变化和生化特征明显不同于细胞坏死，这种特殊的细胞死亡方式对机体发育和正常功能的维持有重要意义，而肿瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞增殖异常有关，也与肿瘤细胞凋亡异常有密切关系。大量的研究表明，抗肿瘤药物的一个重要作用机理是诱导肿瘤细胞发生凋亡[2]。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗癌药物设计和筛选的新靶点，与诱导细胞坏死相比，通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞不会引起机体强烈的炎症反应。由于正常细胞与肿瘤细胞在表达某些凋亡相关基因方面存在差异，诱导肿瘤细胞凋亡的治疗模式可减少抗癌物损伤正常组织所引起的副作用。自1996-08 Science杂志介绍中国科学家应用 As2O3成功治愈急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的成果以来[8]，对 As2O3抗肿瘤作用的探索引起了世界医学界的重视。除白血病以外，As2O3对实体瘤也有抑制作用，它能诱导多种癌细胞发生凋亡，其抗癌谱较为广泛，是一种具有良好应用前景的抗癌药，该药诱导细胞凋亡的主要标志为细胞形态学和生化学等方面的特异性改变[7，9]。刺五加注射液系刺五加全株经提炼而来，含黄酮、刺五加多糖、丁香甙等多种有效成分。该药所具有扶正固本、益气健脾、补肾之功效是通过增强机体的免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤效应的[10]。有研究表明，刺五加多糖对实验性动物移植瘤，药物诱发瘤，小鼠自发白血病等都有一定的抑制作用，还能减轻某些抗癌药物的毒性，其作用机理可能与引起细胞膜磷脂的变化有关[11，12]。HeLa细胞为人宫颈鳞癌上皮细胞系，在体外培养条件下，易于生长繁殖，常被应用于细胞生物学研究和抗癌药物的筛选，故本实验选用该细胞系作为病理模型。本研究结果显示，刺五加与 As2O3合用对 HeLa细胞具有明显的生长抑制和诱导凋亡作用，合用组细胞的生长抑制率和凋亡率分别与两药的单用组比均具有显著性差异(P<0.01)。说明刺五加与 As2O3合用具有很强的抗肿瘤活性两者可产生协同作用，刺五加可以作为 As2O3抗肿瘤作用的增效剂。至于两药合用抗肿瘤作用的分子机理还有待进一步研究。
参考文献：
[1] 张 鹏.王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒白血病[J].中华血液学杂志，1996，17(2)：58.
[2] Shen ZX,Chen GQ,Ni JH,et al.Use of arsenic trioxide in the treatment of acute promyelocytic:Ⅱclinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients[J].Blood,1997,89(9):3354.
[3] Karen H.A.Introduction :The history of Arsenic trioxide in cancer therapy[J].The Oncologist ,2001,6(2):1.
[4] Mohamad A.H.MD.Trials of Arsenic Trioxide in multipe myloma[J].Cancer Control,2003,10(5):370.
[5] 黄浏姣，赵 刚.三氧化二砷抗肿瘤作用及其机理的研究现状和展望[J].湖北中医学院学报，2005，7(1)：60.
[6] 冯雪梅，叶红军，韩登春，等.刺五加叶皂甙对动物实验性肝癌抑制作用的研究[J].中国老年医学杂志，1999，19(5)：298.
[7] 吕秀宁，郑 杰.As2O3诱导宫颈癌 HeLa细胞凋亡与细胞内端粒酶活性关系的研究[J].东南大学学报(医学版)2003，22(4)：227.
[8] Gurr JR,Lin YC,Ho Ky, et al.Induction of chromatid breaks and tetraplody in Chinese hamster ovary cells by treatment with sodium arsenite during G2 phase[J].Mutat Res,1993,319(2):135.
[9] Yu Ding ,Wang Zhihui ,Zhu Liyuan,et al.Nuclear matrix associated protein PML:an arsenic trioxide apoptosis therapeutic target protein in HepG2 cells[J].Chinese Medical Journal,2003,116(1):93.
[10] 佟 丽，黄添友，梁 谋，等.刺五加多糖抗肿瘤作用与机理的实验研究[J].中国药理学通报1994，10(2)：105.
[11] Chaudry A,McClintons S,Moffat LEF,et al .Essential fatty acid distribution in theplasma and tissue phosphlipids of patients with benign and maligmant prostatic disease[J].BrJ Cancer 1991,64：1157.
(湖北中医学院基础医学部，湖北 武汉 430061), 百拇医药(黄浏姣， 赵刚)
关键词：三氧化二砷； 刺五加； HeLa细胞； 凋亡
Experimental Study on the Apoptosis of HeLa Cells Induced by Arsenic Trioxide and acanthopanax senticosus
HUANG Liujiao, ZHAO Gang
(Department of Basic Medicine, Hubei College of Triditional Chinese Medicine ,Wuhan 430061, China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of Arsenic trioxide and Acanthopanax Senticosus on carcinoma cells and its probable mechanism.MethodsHeLa cells were cultured as a pathological model. HeLa cells structural change were examined by inverted phase microscope. The inhibition effect on the growth of cells was evaluated by microculture tetrazolium assay(MTT). The apoptosis of cells were detected by flow cytometry(FCM).ResultsThe cells of the group of two medicines used together turned smaller and rounder than other groups .The growth inhibited rate of this group was higher than that of control group. The apoptosis rate of two medicines used together 24 hours was higher than 16 hours and 8 hours(P<0.01).ConclusionAcanthopanax Senticosus can improve the antitumor effects of Arsenic trioxide ,but whether it can decrease the toxicities of Arsenic trioxide or not is worth more studying.
Key words:Acanthopanax senticosus; Arsenic trioxide; HeLa cell; Apoptosis
三氧化二砷(As2O3)是中药砒霜的主要成分，祖国医学中它曾被用于治疗恶性肿瘤等多种疾病，但 As2O3又是一种能引起机体细胞染色体畸变的剧毒物质，故长期以来它的药用价值一直被其毒副作用所掩盖，直到近年来，我国研究者发现 As2O3对急性早幼粒细胞白血病具有良好的治疗效果[1，2]，它的药用价值才被人们重新审视，有关 As2O3抗肿瘤作用及其机理的研究近年来取得了较大进展，发现该药具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用[3~5]。刺五加Acanthopanax senticosus是临床上常用中药，具有益气健脾、补肾安神的功效，可作为细胞毒抗癌药的辅助剂。动物实验证实，刺五加能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制实验性肿瘤的生长和转移[6]。本研究以人宫颈癌细胞系 HeLa细胞为病理模型，将刺五加与 As2O3联合作用于HeLa细胞，以探讨两药合用对肿瘤细胞生长抑制和诱导其发生凋亡的作用，了解刺五加对 As2O3的抗肿瘤作用是否具有增强效应，为临床上两种中药合用治疗恶性肿瘤提供细胞学的实验依据。
1 材料与方法
1.1 药品与仪器刺五加注射液(20 ml/支，黑龙江省珍宝岛制药有限公司)；亚砷酸注射液(规格10 mg/10 ml,哈尔滨伊达药业有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT,Amresco公司)；RPMI1640培养基(美国 GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青生物制品公司)；酶标仪(560型，美国 BIORAD公司)，流式细胞仪(FACS calibur型，美国 BD公司)；数码相机(日本 Canon公司)。
1.2 细胞系HeLa细胞，为人宫颈癌细胞系，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
1.3 药用浓度的确定
1.3.1 刺五加药用浓度的确定采用 MTT法，取对数生长期 HeLa细胞，1×105/ml的细胞100 μl至96孔培养板，加入等量不同浓度的刺加五溶液，使各组终浓度分别为0.1，0.5，1， 1.5 mg/ml，每个浓度组和对照组均设5个重复孔，以加细胞而不加药物组为空白对照组。37℃ ，5%CO2培养箱培养24 h后，取出培养板，弃旧培养液，每孔加入5 mg/ml的 MTT溶液20 μl，37℃ 继续培养4 h，弃培养液，每孔加入 DMSO 150 μl，振荡15 min，使结晶物充分溶解，最后在酶标仪上用490 nm波长测定各孔的 OD值，计算细胞存活率和半数抑制浓度(IC50)，从而确定刺五加的用药浓度为0.5 mg/ml。
1.3.2 As2O3药用浓度的确定参考文献，采用最小有效浓度2 μmol/L[7]。
1.4 两药合用对 HeLa细胞的生长抑制实验采用 MTT法，实验共分4组，空白对照组，As2O3组，刺五加组及 As2O3与刺五加合用组，所有操作方法同3.1，最后计算细胞的生长抑制率。
生长抑制率=1-(实验孔平均OD值) 对照孔平均 OD值×100%
1.5 细胞凋亡的检测采用流式细胞仪 PI单染色法取24孔培养板3个，每板随机分为4组(空白对照组，As2O3组，刺五加组及As2O3与刺五加合用组)，每组6个重复孔，每孔加入浓度为1×105/ml的 HeLa细胞悬液800 μl，生长至对数生长期，去旧液，每孔加含10%新生牛血清的1640培养液，同时分别加入生理盐水、刺加五溶液，As2O3及两药合加，使每孔液体总量相等，同时保证每孔刺五加终浓度为0.5 mg/ml，As2O3终浓度为2 μmol/L37℃，5%CO2培养箱分别培养8 ，16，24 h后，收集每组细胞，PBS洗涤1次，离心去 PBS，加入冰预冷的70%乙醇3 ml，4℃固定24 h以上，离心去固定液，3 ml PBS重悬细胞。离心5 min去 PBS，每管加入1 mlPI染液，室温避光反应30 min。制备好的细胞悬液经300目尼龙筛网过滤后立即在流式细胞仪上检测，CELLQuest软件获取并分析检测数据。
1.6 细胞形态学观察按上述方法分别让药物作用细胞8 ，16，24 h，然后在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并用数码相机照相记录结果。
2 结果
2.1 细胞生长抑制率刺五加与 As2O3合用对 HeLa细胞增殖有显著的抑制作用。结果见表1。
表1 药物对 HeLa细胞的生长抑制率(略)
c与 b比较，P<0.01，c与a比较，P<0.01
2.2 HeLa细胞的凋亡分别观察药物作用 HeLa细胞8，16，24 h的凋亡情况，结果显示两药合用能明显诱导 HeLa细胞凋亡，且有明显的时间依赖性(见表2)，合 用16，24 h流式检测出现明显的凋亡峰。见图1。
a对照组流式 b两药合用24 h凋亡 c两药合用16 h凋亡
图1 刺五加与As2O3合用诱导HeLaxl细胞凋亡的流式检测图(略)
表2 药物作用 HeLa细胞不同时间的细胞凋亡率(略)
c与相对应时间 a，b各组认及生理盐水组比较，P<0.01；c24与c8，c16比较P<0.01；b与相对时间a组和生盐盐组比较， P<0.05
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)是机体中普遍存在的重要的生物学事件，是受基因调控的主动性死亡过程，其形态变化和生化特征明显不同于细胞坏死，这种特殊的细胞死亡方式对机体发育和正常功能的维持有重要意义，而肿瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞增殖异常有关，也与肿瘤细胞凋亡异常有密切关系。大量的研究表明，抗肿瘤药物的一个重要作用机理是诱导肿瘤细胞发生凋亡[2]。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗癌药物设计和筛选的新靶点，与诱导细胞坏死相比，通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞不会引起机体强烈的炎症反应。由于正常细胞与肿瘤细胞在表达某些凋亡相关基因方面存在差异，诱导肿瘤细胞凋亡的治疗模式可减少抗癌物损伤正常组织所引起的副作用。自1996-08 Science杂志介绍中国科学家应用 As2O3成功治愈急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的成果以来[8]，对 As2O3抗肿瘤作用的探索引起了世界医学界的重视。除白血病以外，As2O3对实体瘤也有抑制作用，它能诱导多种癌细胞发生凋亡，其抗癌谱较为广泛，是一种具有良好应用前景的抗癌药，该药诱导细胞凋亡的主要标志为细胞形态学和生化学等方面的特异性改变[7，9]。刺五加注射液系刺五加全株经提炼而来，含黄酮、刺五加多糖、丁香甙等多种有效成分。该药所具有扶正固本、益气健脾、补肾之功效是通过增强机体的免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤效应的[10]。有研究表明，刺五加多糖对实验性动物移植瘤，药物诱发瘤，小鼠自发白血病等都有一定的抑制作用，还能减轻某些抗癌药物的毒性，其作用机理可能与引起细胞膜磷脂的变化有关[11，12]。HeLa细胞为人宫颈鳞癌上皮细胞系，在体外培养条件下，易于生长繁殖，常被应用于细胞生物学研究和抗癌药物的筛选，故本实验选用该细胞系作为病理模型。本研究结果显示，刺五加与 As2O3合用对 HeLa细胞具有明显的生长抑制和诱导凋亡作用，合用组细胞的生长抑制率和凋亡率分别与两药的单用组比均具有显著性差异(P<0.01)。说明刺五加与 As2O3合用具有很强的抗肿瘤活性两者可产生协同作用，刺五加可以作为 As2O3抗肿瘤作用的增效剂。至于两药合用抗肿瘤作用的分子机理还有待进一步研究。
参考文献：
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[6] 冯雪梅，叶红军，韩登春，等.刺五加叶皂甙对动物实验性肝癌抑制作用的研究[J].中国老年医学杂志，1999，19(5)：298.
[7] 吕秀宁，郑 杰.As2O3诱导宫颈癌 HeLa细胞凋亡与细胞内端粒酶活性关系的研究[J].东南大学学报(医学版)2003，22(4)：227.
[8] Gurr JR,Lin YC,Ho Ky, et al.Induction of chromatid breaks and tetraplody in Chinese hamster ovary cells by treatment with sodium arsenite during G2 phase[J].Mutat Res,1993,319(2):135.
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(湖北中医学院基础医学部，湖北 武汉 430061), 百拇医药(黄浏姣， 赵刚)