黄芪总苷对实验性急性胰腺炎的保护作用
摘要：目的探索黄芪总苷(AST)对实验性急性胰腺炎的保护作用及其作用机理。方法用扭体法和热板法研究其镇痛作用；用脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射诱导急性胰腺炎模型，测定血清淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)的活性。结果AST(20～80 mg·kg1)均可不同程度地减轻拟痛反应，降低模型动物的血清AMS和LPS水平。结论AST有镇痛作用和对急性胰腺炎的保护作用。
关键词：黄芪总苷； 镇痛； 急性胰腺炎； 脱氧胆酸钠
Effects of Astragalosides on Experimental Acute Pancreatitis
SUN Haiyan， HUANG Min， GUAN Su
(Department of Applied Biological Engineering, Shenzhen Polytechnic College, Shenzhen, 518055 China;School of Pharmacology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080 China)
Abstract：ObjectiveTo study the protective effects of astragalosides (AST) on acute pancreatitis (AP) in rats.MethodsAP models were induced by retrograde injection of sodium deoxycholate into bilipancreatic duct in rats. Rats were injected subcutaneously with saline, astragalosides(20,40, 80 mg·kg1) and octreotide(0.01 mg·kg1) respectively before operation. The activity of the amylase(AMS) and lipase(LPS) were measured at 6 and 12 h after induction of AP. Pathomorphology of the pancreaces was observed under the microscope. Analgesic action of AST also be observed in two kinds of models. ResultsIt was shown that the activity of AMS and LPS in AST treated groups were much lower than that in model groups. Pathologic study showed that pancreatic leision was alleviated. The analgesic action of AST has also been proved. ConclusionAST has certain protective effects on AP.
Key words：Astragalosides; Analgesia; Acute pancreatitis; Sodium deoxycholate
黄芪总苷(astragalosides，AST)是本实验室采用超临界萃取技术，从膜荚黄芪根中提取的有效部位。中医临床研究表明，黄芪对治疗急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)有较好的疗效。药理学研究证实，AST具有抗炎、抗氧化和免疫调节等作用，但其抗胰腺炎的作用机制未见有研究报道。为进一步探讨AST对AP的保护作用，采用化学刺激和热传导两种拟痛方法，研究AST的镇痛作用，采用脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射诱导急性胰腺炎AP模型，研究AST对模型大鼠血清淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)活性的影响，以期通过研究AST对AP的保护作用及作用机制，为黄芪的开发利用提供实验依据。
1 材料
1.1 动物昆明种小鼠，雄性，6～8周龄，体重(20±2)g。SD大鼠，雌性，14～15周龄，体重(200±20)g。均由深圳市光明生物制品公司实验动物中心提供。
1.2 药品和试剂 黄芪总苷(AST)由生物应用工程系实验室提供，使用时用蒸馏水配成所需浓度；阿司匹林(aspirin)，石家庄制药集团有限公司，批号20031117；奥曲肽(Octreotide)，瑞士诺华制药有限公司，批号20040618；脱氧胆酸钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号20030106；血清淀粉酶和脂肪酶检测试剂盒，均由上海荣盛生物技术有限公司提供；其他试剂均为国产AR级。
2 方法
2.1 AST对拟痛反应小鼠的作用
2.1.1 AST对化学刺激引起拟痛反应的影响[1]选健康小鼠50只，按体重均衡随机分为5组，分别为(1)正常对照组，(2)AST大剂量组(120 mg·kg1)，(3)AST中剂量组(60 mg·kg1)，(4)AST小剂量组(30 mg·kg1)和(5)阿司匹林组(60 mg·kg1)。AST组和阿司匹林组每天ig给药，连续3 d，正常对照组每天给予等量生理盐水。末次给药后1h各组均ip 0.6% 醋酸溶液10ml·kg1，记录扭体反应出现时间以及注射后20 min内小鼠扭体次数。所得实验数据进行统计学处理，扭体反应次数采用t检验，扭体反应潜伏期采用序值法。结果见表1。
2.1.2 AST对热传导引起拟痛反应的影响[2]选健康雄性小鼠50只，分组同2.1.1。将小鼠放在温度为(55±0.5)℃的金属热板上，记录小鼠出现舔后足时间(s)，测定两次，取平均值作为该鼠的痛阈值。凡30 s内不出现舔后足者，弃之不用。按2.1.1所示剂量给药，给药后分别于0.5，1，1.5和2 h测定小鼠的痛阈值，与对照组相比较。若小鼠60 s内仍无痛觉，即按60 s计算。结果见表2。
2.2 AST对脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎(NaDc AP)模型大鼠的作用
2.2.1 实验分组与药物处理 健康SD大鼠60只按体重均衡随机分为6组，分别为(1)正常对照组，(2)模型对照组，(3)～(5)组为AST (20，40，80 mg·kg1)组，(6)奥曲肽(0.01 mg·kg1)组。AST(20，40，80 mg·kg1)组分别在大鼠造模前sc给药2次，间隔1 h。于第2次给药后30 min造模。造模前30 min，奥曲肽组sc给药1次，正常对照和模型组sc给予生理盐水10 ml·kg1。
2.2.2 AP模型的制备[3,4]及指标的检测大鼠ip戊巴比妥钠(30 mg·kg1)麻醉，上腹正中切口，显露胆胰管。在靠近肝门处用动脉夹夹闭胆总管做暂时性阻断，然后经十二指肠壁从胆胰管开口处，逆行注入脱氧胆酸钠(0.25%，0.5 ml·kg1)。推注1 min，滞留3 min后去除动脉夹和针头，关腹。造模后分别于6 h和12 h取血，离心，分离血清，检测血清淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)活性。24 h后处死大鼠，分离胰腺，取胰头部位组织HE染色，光镜下检查胰腺的病理学改变。AMS和LPS的测定按照试剂盒说明书进行。酶单位定义：100 ml血清中的淀粉酶，37℃ 15 min水解5 mg淀粉为1个单位。
2.3 统计学方法 数据均用 ±s表示，采用组间t检验，P<0.05为具有显著的统计学差异。
3 结果
3.1 AST对化学刺激引起拟痛反应的影响结果见表1。
表1 AST对醋酸扭体反应的影响(略)
与正常对照组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，AST的3个剂量均可以显著减少化学刺激引起的小鼠扭体次数，具有较好的镇痛效果，且呈现较好的量效关系，但AST对小鼠扭体反应出现的潜伏期并无延长。
3.2 AST对热传导引起拟痛反应的影响结果见表2。
表2 AST对小鼠热板法镇痛作用的影响(略)
与正常对照组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，AST 3个剂量组均可不同程度地提高小鼠对热传导引起拟痛反应的痛阈值，其中以AST 60 mg·kg1组效果最好，给药后0.5，1，1.5和2 h均能发挥显著镇痛效果。AST小剂量和大剂量组则是在给药后1 h的镇痛效果最好。
3.3 AST对NaDc AP大鼠AMS活性的影响结果见表3。
表3 AST对NaDc AP大鼠AMS活性的影响(略)
与模型组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎模型建造成功，模型大鼠血清AMS大幅度升高。与模型组比较，AST 40 mg·kg1组可使造模后6 h大鼠血清AMS下降，AST40， 80 mg·kg1和奥曲肽组可使造模后12 h大鼠血清AMS显著下降，但AST 20 mg·kg1组对模型大鼠血清的AMS无影响。
3.4 AST对NaDc AP大鼠血清脂肪酶(LPS)水平的影响见表4。
表4 AST对NaDc AP大鼠血清脂肪酶(LPS)水平的影响(略)
与模型组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎模型建造成功，模型大鼠血清LPS大幅度升高。与模型组比较，AST 40 mg·kg1组可使造模后6 h大鼠血清LPS下降，AST 80 mg·kg1和奥曲肽组可使造模后12 h大鼠血清LPS显著下降，但AST 20 mg·kg1组对模型大鼠血清的LPS无影响。
3.5 胰腺组织学变化HE染色，光镜下观察可见，模型组的胰腺组织广泛性坏死，炎性细胞弥漫性浸润，胰腺细胞内有空泡形成。AST剂量组和奥曲肽组的胰腺组织坏死性程度明显减弱，炎性细胞浸润范围缩小，少数胰腺细胞内有空泡。
4 讨论
急性胰腺炎是由胰酶过度分泌引起的一种急性消化系统疾病，早期血清淀粉酶和脂肪酶即升高，而国内外也均以AMS和LPS作为诊断AP的主要实验室指标。本实验采用脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎模型，通过测定给药后模型大鼠血清AMS和LPS的变化对AST的抗AP作用进行了初步的研究。结果表明，AST皮下注射均能显著降低Na-Dc AP模型大鼠血清的AMS活性和LPS水平，而且可以有效改善胰腺组织的病理变化。AST的镇痛结果表明，AST可减少化学刺激小鼠的扭体次数，且呈现较好的剂量依赖性。AST 3个剂量组均可不同程度地提高小鼠对热传导引起拟痛反应的痛阈值，其中以AST中剂量效果最好。细胞因子、炎症介质在AP病程的演变过程中起着一定的作用[5]，AST的镇痛效果可能与其抑制PG等致痛因子的产生有关。近年来研究显示，氧自由基在AP发病中的作用尤为重要。有关AST对实验性AP的保护作用与其抗氧化作用、抑制致炎致痛细胞因子产生的作用之间的关系，值得我们进行更深入地探讨，从而在更深层次上了解AST抗AP的作用机理，为该药的开发利用提供理论和实验依据。
参考文献：
[1] 徐庆荣，李 娜. 牛黄千金散抗炎镇痛和免疫抑制作用[J].中药新药与临床药理，2001，12(2)：98.
[2] 张红梅，李长龄. 1，6二(4苯乙基1甲基1哌嗪基)己烷二溴化物的镇痛活性研究[J].中国药理学通报，2003，19(6)：303.
[3] Aho HJ, Koskensala SML, Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat: taurocholate-induced acute hemorrhagic pancreatitis[J].Scand J Gastroenterol, 1980, 15(3): 411.
[4] 贾玉杰，裴德凯. 急性胰腺炎时胰腺亚细胞器的功能变化及栀子的影响[J]. 大连医学院学报，1991，13 (1): 36.
[5] 杨 沁，路景涛. 黄芪总甙的抗炎作用及其作用机制探索[J].中国临床药理学与治疗学，2001，6(1) : 21.
(深圳职业技术学院，广东 深圳 518055； 中山大学药学院，广东 广州 510080), http://www.100md.com(孙海燕， 黄民， 关溯)
关键词：黄芪总苷； 镇痛； 急性胰腺炎； 脱氧胆酸钠
Effects of Astragalosides on Experimental Acute Pancreatitis
SUN Haiyan， HUANG Min， GUAN Su
(Department of Applied Biological Engineering, Shenzhen Polytechnic College, Shenzhen, 518055 China;School of Pharmacology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080 China)
Abstract：ObjectiveTo study the protective effects of astragalosides (AST) on acute pancreatitis (AP) in rats.MethodsAP models were induced by retrograde injection of sodium deoxycholate into bilipancreatic duct in rats. Rats were injected subcutaneously with saline, astragalosides(20,40, 80 mg·kg1) and octreotide(0.01 mg·kg1) respectively before operation. The activity of the amylase(AMS) and lipase(LPS) were measured at 6 and 12 h after induction of AP. Pathomorphology of the pancreaces was observed under the microscope. Analgesic action of AST also be observed in two kinds of models. ResultsIt was shown that the activity of AMS and LPS in AST treated groups were much lower than that in model groups. Pathologic study showed that pancreatic leision was alleviated. The analgesic action of AST has also been proved. ConclusionAST has certain protective effects on AP.
Key words：Astragalosides; Analgesia; Acute pancreatitis; Sodium deoxycholate
黄芪总苷(astragalosides，AST)是本实验室采用超临界萃取技术，从膜荚黄芪根中提取的有效部位。中医临床研究表明，黄芪对治疗急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)有较好的疗效。药理学研究证实，AST具有抗炎、抗氧化和免疫调节等作用，但其抗胰腺炎的作用机制未见有研究报道。为进一步探讨AST对AP的保护作用，采用化学刺激和热传导两种拟痛方法，研究AST的镇痛作用，采用脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射诱导急性胰腺炎AP模型，研究AST对模型大鼠血清淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)活性的影响，以期通过研究AST对AP的保护作用及作用机制，为黄芪的开发利用提供实验依据。
1 材料
1.1 动物昆明种小鼠，雄性，6～8周龄，体重(20±2)g。SD大鼠，雌性，14～15周龄，体重(200±20)g。均由深圳市光明生物制品公司实验动物中心提供。
1.2 药品和试剂 黄芪总苷(AST)由生物应用工程系实验室提供，使用时用蒸馏水配成所需浓度；阿司匹林(aspirin)，石家庄制药集团有限公司，批号20031117；奥曲肽(Octreotide)，瑞士诺华制药有限公司，批号20040618；脱氧胆酸钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号20030106；血清淀粉酶和脂肪酶检测试剂盒，均由上海荣盛生物技术有限公司提供；其他试剂均为国产AR级。
2 方法
2.1 AST对拟痛反应小鼠的作用
2.1.1 AST对化学刺激引起拟痛反应的影响[1]选健康小鼠50只，按体重均衡随机分为5组，分别为(1)正常对照组，(2)AST大剂量组(120 mg·kg1)，(3)AST中剂量组(60 mg·kg1)，(4)AST小剂量组(30 mg·kg1)和(5)阿司匹林组(60 mg·kg1)。AST组和阿司匹林组每天ig给药，连续3 d，正常对照组每天给予等量生理盐水。末次给药后1h各组均ip 0.6% 醋酸溶液10ml·kg1，记录扭体反应出现时间以及注射后20 min内小鼠扭体次数。所得实验数据进行统计学处理，扭体反应次数采用t检验，扭体反应潜伏期采用序值法。结果见表1。
2.1.2 AST对热传导引起拟痛反应的影响[2]选健康雄性小鼠50只，分组同2.1.1。将小鼠放在温度为(55±0.5)℃的金属热板上，记录小鼠出现舔后足时间(s)，测定两次，取平均值作为该鼠的痛阈值。凡30 s内不出现舔后足者，弃之不用。按2.1.1所示剂量给药，给药后分别于0.5，1，1.5和2 h测定小鼠的痛阈值，与对照组相比较。若小鼠60 s内仍无痛觉，即按60 s计算。结果见表2。
2.2 AST对脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎(NaDc AP)模型大鼠的作用
2.2.1 实验分组与药物处理 健康SD大鼠60只按体重均衡随机分为6组，分别为(1)正常对照组，(2)模型对照组，(3)～(5)组为AST (20，40，80 mg·kg1)组，(6)奥曲肽(0.01 mg·kg1)组。AST(20，40，80 mg·kg1)组分别在大鼠造模前sc给药2次，间隔1 h。于第2次给药后30 min造模。造模前30 min，奥曲肽组sc给药1次，正常对照和模型组sc给予生理盐水10 ml·kg1。
2.2.2 AP模型的制备[3,4]及指标的检测大鼠ip戊巴比妥钠(30 mg·kg1)麻醉，上腹正中切口，显露胆胰管。在靠近肝门处用动脉夹夹闭胆总管做暂时性阻断，然后经十二指肠壁从胆胰管开口处，逆行注入脱氧胆酸钠(0.25%，0.5 ml·kg1)。推注1 min，滞留3 min后去除动脉夹和针头，关腹。造模后分别于6 h和12 h取血，离心，分离血清，检测血清淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)活性。24 h后处死大鼠，分离胰腺，取胰头部位组织HE染色，光镜下检查胰腺的病理学改变。AMS和LPS的测定按照试剂盒说明书进行。酶单位定义：100 ml血清中的淀粉酶，37℃ 15 min水解5 mg淀粉为1个单位。
2.3 统计学方法 数据均用 ±s表示，采用组间t检验，P<0.05为具有显著的统计学差异。
3 结果
3.1 AST对化学刺激引起拟痛反应的影响结果见表1。
表1 AST对醋酸扭体反应的影响(略)
与正常对照组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，AST的3个剂量均可以显著减少化学刺激引起的小鼠扭体次数，具有较好的镇痛效果，且呈现较好的量效关系，但AST对小鼠扭体反应出现的潜伏期并无延长。
3.2 AST对热传导引起拟痛反应的影响结果见表2。
表2 AST对小鼠热板法镇痛作用的影响(略)
与正常对照组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，AST 3个剂量组均可不同程度地提高小鼠对热传导引起拟痛反应的痛阈值，其中以AST 60 mg·kg1组效果最好，给药后0.5，1，1.5和2 h均能发挥显著镇痛效果。AST小剂量和大剂量组则是在给药后1 h的镇痛效果最好。
3.3 AST对NaDc AP大鼠AMS活性的影响结果见表3。
表3 AST对NaDc AP大鼠AMS活性的影响(略)
与模型组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎模型建造成功，模型大鼠血清AMS大幅度升高。与模型组比较，AST 40 mg·kg1组可使造模后6 h大鼠血清AMS下降，AST40， 80 mg·kg1和奥曲肽组可使造模后12 h大鼠血清AMS显著下降，但AST 20 mg·kg1组对模型大鼠血清的AMS无影响。
3.4 AST对NaDc AP大鼠血清脂肪酶(LPS)水平的影响见表4。
表4 AST对NaDc AP大鼠血清脂肪酶(LPS)水平的影响(略)
与模型组比较，P>0.05，+P<0.05，* P<0.01；n=10
结果表明，脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎模型建造成功，模型大鼠血清LPS大幅度升高。与模型组比较，AST 40 mg·kg1组可使造模后6 h大鼠血清LPS下降，AST 80 mg·kg1和奥曲肽组可使造模后12 h大鼠血清LPS显著下降，但AST 20 mg·kg1组对模型大鼠血清的LPS无影响。
3.5 胰腺组织学变化HE染色，光镜下观察可见，模型组的胰腺组织广泛性坏死，炎性细胞弥漫性浸润，胰腺细胞内有空泡形成。AST剂量组和奥曲肽组的胰腺组织坏死性程度明显减弱，炎性细胞浸润范围缩小，少数胰腺细胞内有空泡。
4 讨论
急性胰腺炎是由胰酶过度分泌引起的一种急性消化系统疾病，早期血清淀粉酶和脂肪酶即升高，而国内外也均以AMS和LPS作为诊断AP的主要实验室指标。本实验采用脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射型急性胰腺炎模型，通过测定给药后模型大鼠血清AMS和LPS的变化对AST的抗AP作用进行了初步的研究。结果表明，AST皮下注射均能显著降低Na-Dc AP模型大鼠血清的AMS活性和LPS水平，而且可以有效改善胰腺组织的病理变化。AST的镇痛结果表明，AST可减少化学刺激小鼠的扭体次数，且呈现较好的剂量依赖性。AST 3个剂量组均可不同程度地提高小鼠对热传导引起拟痛反应的痛阈值，其中以AST中剂量效果最好。细胞因子、炎症介质在AP病程的演变过程中起着一定的作用[5]，AST的镇痛效果可能与其抑制PG等致痛因子的产生有关。近年来研究显示，氧自由基在AP发病中的作用尤为重要。有关AST对实验性AP的保护作用与其抗氧化作用、抑制致炎致痛细胞因子产生的作用之间的关系，值得我们进行更深入地探讨，从而在更深层次上了解AST抗AP的作用机理，为该药的开发利用提供理论和实验依据。
参考文献：
[1] 徐庆荣，李 娜. 牛黄千金散抗炎镇痛和免疫抑制作用[J].中药新药与临床药理，2001，12(2)：98.
[2] 张红梅，李长龄. 1，6二(4苯乙基1甲基1哌嗪基)己烷二溴化物的镇痛活性研究[J].中国药理学通报，2003，19(6)：303.
[3] Aho HJ, Koskensala SML, Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat: taurocholate-induced acute hemorrhagic pancreatitis[J].Scand J Gastroenterol, 1980, 15(3): 411.
[4] 贾玉杰，裴德凯. 急性胰腺炎时胰腺亚细胞器的功能变化及栀子的影响[J]. 大连医学院学报，1991，13 (1): 36.
[5] 杨 沁，路景涛. 黄芪总甙的抗炎作用及其作用机制探索[J].中国临床药理学与治疗学，2001，6(1) : 21.
(深圳职业技术学院，广东 深圳 518055； 中山大学药学院，广东 广州 510080), http://www.100md.com(孙海燕， 黄民， 关溯)