通络益肾汤对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病大鼠血浆一氧化氮影响的实验研究
摘要：目的观察通络益肾汤对链脲佐菌素(STZ)糖尿病肾病大鼠的疗效，探讨其可能的作用机理。方法采用STZ糖尿病肾病大鼠模型，分为正常组、病理组、通络益肾汤治疗组、西药治疗组(糖适平+洛汀新)。观察各组大鼠治疗前后血糖、血脂、肾功能(BUN、Scr)、血浆蛋白、血浆NO等指标的变化。结果与病理组比较，通络益肾汤治疗组大鼠一般状况改善较好，血糖升高不明显(P<0.05)，血清BUN、Scr显著降低(P<0.01)、TG、TC降低，HDL升高，(P<0.01或P<0.05)。血浆NO含量明显升高(P<0.01)。通络益肾汤治疗组与西药组比较，各项指标无明显差异。结论通络益肾汤能延缓糖尿病肾病的病理进展，其作用机理可能与升高血浆NO水平有关。
关键词：通络益肾汤； 糖尿病肾病； 一氧化氮； 糖尿病肾病大鼠模型
Experimental Research on the Effect of Tong-Luo-Yi-Shen-Tang on Nitric Oxide of Streptczotcin(STZ)-Induced Diabetic Nephropathy Rats
LI Xiaohui, DONG Zhenghua,CAO Guangshun,ZHAO Xin,JI Xiaohong,YANG Jingfeng
(Shanxi College of TCM,Xi'an 712046,China；Xi'an TCM Hospital,Xi'an 710001,China;Graduate Student of Grade 2002,Shanxi College of TCM,Xi'an 712046, China)
Abstract：ObjectiveTo observe the effects and the mechanism of Tong-Luo-Yi-Shen-Tang(TLYST) on the streptczotcin(STZ)-induced diabetic nephropathy rats. MethodsThe diabetic nephropathy animal model was induced by luing STZ.Rats were divided into normal group (A group),model group(B group),TLYST treatment group(C group),Gliquidon and Lotensin control guoup(D group).Blood glucose levels,blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr),triglyceride (TG),cholestrol(CHO),high-density liprotein(HDL) and nitric oxide were measured. ResultsCompared with model group ,blood glucose、BUN、Scr、TG、CHO decreased in C group (P<0.05 or P<0.01), nitric oxide、HDL were significantly improved (P<0.01) .ConclusionTLYST could relieve and retard the progress of DN, It's mechanism may be correlating with increased the content of NO.
Key words：TongLuoYiShenTang; Diabetic nephropathy; Nitric Oxide； Diabetic nephropathy animal model
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)，属糖尿病心、脑、肾三大严重并发症之一，为DM的主要死亡原因之一。若DN出现持续性蛋白尿，病情即呈进行性发展，平均7年即可致终末期肾脏病(ESRD)。因此如何有效的预防DN的发生或阻断病情的发展，延缓慢性肾衰的进程，已成为当今医学界亟待解决的重要课题。我们针对DN肾亏阴阳两虚、血络淤阻病机的认识，提出通络益肾法治疗DN的新思路，取得了较好的临床疗效。为进一步从实验学角度证实该疗法的疗效，并探讨其对链脲佐菌素DN大鼠血浆NO的影响，特设计本实验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物Wistar雄性大鼠41只，体重(180±20) g。由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2 用药通络益肾汤由桃仁、生地、山萸肉、山药、酒大黄、水蛭、黄芪等组成。大鼠用量按文献折算[1]，经常规煎煮、过滤、水浴蒸发至每毫升含生药材0.86 g，置于4 ℃冰箱保存备用；洛汀新：北京诺华制药有限公司生产，批号04025；糖适平：北京万辉双鹤药业有限责任公司生产，批号040202。
1.1.3 主要试剂链脲佐菌素(STZ)：sigma公司生产，批号040103；NO试剂盒：购自陕西宝泰克生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 模型复制及分组给药大鼠适应性喂养1周，称体重，经尿糖、尿蛋白定性检测为阴性后，随机抽取8只为正常对照组(A组)。其余33只按照文献法，用STZ缓冲液55 mg/kg(2.75 ml/kg)一次性腹腔注射造模，A组予以等量生理盐水腹腔注射(2.75 ml/kg)。造模后称体重，观察24 h尿量、饮食、饮水量，并每日检测血糖、尿糖，连续3 d尿糖定性+++以上，血糖>13.8 mmol/L，并持续上述标准不变者，确定糖尿病模型形成。再继续喂养一周，随机抽取两只测尿微量白蛋白。尿微量白蛋白>15 μg/ml，确定DN模型形成。造模成功后随机分为3组，以抽签方式确定为病理组13只(B组)，通络益肾汤治疗组10只(C组)，西药治疗组10只(D组)。A，B组分别给蒸馏水2 ml灌胃，C组给通络益肾汤煎液2 ml(28.7 g/kg)灌胃。D组给洛汀新(蒸馏水溶解1.5 mg/kg)及糖适平(蒸馏水溶解10 mg/kg)混悬液2 ml灌胃。以上给药1次/ d，共持续6周。
1.2.2 观测指标及方法
1.2.2.1 血糖、血脂、血浆蛋白生化自动分析仪测定。
1.2.2.2 尿糖定性、尿蛋白定性试纸条测定。
1.2.2.3 肾功能(BUN、Scr)测定二乙酰-肟法及苦味酸法测定。
1.2.2.4 血浆一氧化氮(NO)双缩脲法测定。
1.2.3 资料分析与统计各组数据以±s表示，组间比较采用多样本方差齐性检验及多个均数间两两比较的 t检验。
2 结果
2.1 治疗前后各组大鼠血糖的变化情况结果见表1。
2.2 治疗后各组大鼠血脂的比较 结果见表2。
表1 治疗前后各组大鼠血糖变化的情况(略)
★组内治疗前后比较P<0.05，△与A组比较 P<0.05 ， △△与A组比较 P<0.01，■与B组比较 P<0.05， ■■与B组比较P<0.01
表2 各组大鼠甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白的比较(略)
△与A组比较，P<0.05，△△与A组比较，P<0.01 ；■与B组比较，P<0.05，■■与B组比较，P<0.01 B组与A组比较，TG、TC升高(P<0.01 )，HDL降低(P<0.05)。C组与B组比较，TG，TC有所降低，HDL升高，差异均具有极显著性(P<0.01 或P<0.05)。D组与B组比较，TG，TC降低，HDL略升高，但差异不具有统计学意义。说明通络益肾汤在改善大鼠血脂方面的作用优于西药治疗组。
2.3 治疗后各组大鼠血浆总蛋白、白蛋白的比较 结果见表3。
表3 各组大鼠治疗后血浆总蛋白、白蛋白的比较(略)
△△与A组比较，P<0.01 ；■与B组比较，P<0.05B组大鼠血浆总蛋白及白蛋白含量较A组明显降低(P<0.01)；C组治疗后总蛋白及白蛋白较B组略有升高，但差异不具有统计学意义。D组总蛋白及白蛋白含量较B组高，差异具有显著性(P<0.05，P<0.05 )。说明在纠正低蛋白血症方面，西药治疗组强于通络益肾汤组。
2.4 治疗后各组大鼠BUN、Scr、NO的比较结果见表4。B组大鼠BUN、Scr较A组明显升高(P<0.01)；C组与B组比较，血BUN、Scr明显降低，具有极显著性差异(P<0.01)。D组与B组比较，BUN、Scr明显下降，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。说明通络益肾汤和西药治疗在改善大鼠肾功能方面都有一定作用，尤以通络益肾汤降低BUN作用明显，但无统计学意义。与A组比较，B组大鼠血浆NO含量明显降低(P<0.01)，提示在DN的中后期，存在明显的NO含量降低。C组、D组与B组比较，NO含量升高(P<0.01或P<0.05)。说明通络益肾汤与西药治疗后，都能明显升高血浆NO水平，似通络益肾汤较血浆NO明显，但无统计学意义。
表4 各组大鼠治疗后BUN、Scr、NO的比较(略)
△△与A组比较，P<0.01 ；■与B组比较，P<0.05，■■与B组比较，P<0.01
3 讨论
我们根据多年的临床实践，认为淤血阻络、肾亏阴阳两虚是DN的主要病机[2]，并提出“通络益肾法”，创立“通络益肾汤”治疗DN，取得了满意的疗效。该方以《伤寒论》“抵当汤”和《金匮要略》“肾气丸”为基础加减化裁组成。在《伤寒论》中“抵当汤”用于治疗下焦蓄血证，《金匮要略》中的“肾气丸”可治疗肾阴阳两虚之消渴。方中桃仁、水蛭活血逐淤通经，生地清热生津、滋阴补肾，共为君药；山萸肉、山药补益肝肾，酒大黄通络逐淤，兼以泄浊，共为臣药；更佐以黄芪益气，淫羊藿补肾助阳，葛根生津通络，泽泻、茯苓淡利水湿共为佐药；川牛膝补益肝肾，逐淤通经利水，且引药下行入肾兼具佐使之用。本实验结果显示通络益肾汤可改善DN大鼠的一般状况，降低血糖、血脂，改善肾功能，延缓DN的发展，对DN具有整体防治效应。在DN的整个病程中，NO表现为从初期的升高到代偿性的正常再到下降的趋势[3]。NO是一种具有强烈舒张血管作用的因子，DN早期时NO合成增加，NO对入球小动脉的舒张强于出球小动脉，导致DM早期的肾小球高滤过。随着DN病程的进展，NO产生减少。DN中晚期NO明显下降则促进了肾小球基底膜增厚和系膜基质增生，加剧了肾小球血管壁结构和功能的紊乱。当NO减少时它对肾脏的保护作用也随之减弱，从而加剧了糖尿病肾小球硬化的形成[4]。本实验发现病理组中晚期DN大鼠血浆NO含量明显降低，与文献报道一致[4，5]。应用通络益肾汤治疗后，大鼠血浆NO含量较病理组明显升高；观察肾脏病理变化发现，其肾小球硬化及系膜基质增生情况都比病理组轻，说明通络益肾汤可使NO合成增加保护肾组织，延缓DN的发展，对DN起到治疗作用。综上所述，通络益肾汤扶正祛邪、消补兼施，具有活血通络、滋阴助阳、利水泄浊之效，适用于DN之血淤阻络、肾亏阴阳两虚证。STZ诱导的DN大鼠，应用通络益肾汤后，能控制血糖升高的幅度，改善脂质代谢及肾功能，升高血浆NO含量。证实通络益肾汤具有延缓DN发展，对DN的防治具有整体效应。
参考文献：
[1] 孙敬方.实验动物方法学，第1版[M].北京：人民出版社，2001：478.
[2] 李小会，董正华，丁 辉.糖尿病肾病病因机探讨[J].陕西中医，2005，26(6)：552.
[3] 冕 梁.NO,NOS与糖尿病肾病的关系及黄芪对其水平影响的研究[J].中医药学刊，2004；22(2)：234.
[4] 朱禧星.现代糖尿病学，第1版[M].广州：第二军医大学出版社，2000：316.
[5] 陈雪梅，杜晓刚.一氧化氮与肾小球疾病[J].国外医学泌尿系统分册，2000，20(5)：201.
基金项目：陕西省中医管理局资助项目(NO.2003107)
(陕西中医学院，陕西 西安 712046； 西安市中医医院 710001；陕西中医学院2002级研究生，陕西 西安 712046), http://www.100md.com(李小会，董正华，曹广顺，赵鑫，冀晓红，杨景锋)
关键词：通络益肾汤； 糖尿病肾病； 一氧化氮； 糖尿病肾病大鼠模型
Experimental Research on the Effect of Tong-Luo-Yi-Shen-Tang on Nitric Oxide of Streptczotcin(STZ)-Induced Diabetic Nephropathy Rats
LI Xiaohui, DONG Zhenghua,CAO Guangshun,ZHAO Xin,JI Xiaohong,YANG Jingfeng
(Shanxi College of TCM,Xi'an 712046,China；Xi'an TCM Hospital,Xi'an 710001,China;Graduate Student of Grade 2002,Shanxi College of TCM,Xi'an 712046, China)
Abstract：ObjectiveTo observe the effects and the mechanism of Tong-Luo-Yi-Shen-Tang(TLYST) on the streptczotcin(STZ)-induced diabetic nephropathy rats. MethodsThe diabetic nephropathy animal model was induced by luing STZ.Rats were divided into normal group (A group),model group(B group),TLYST treatment group(C group),Gliquidon and Lotensin control guoup(D group).Blood glucose levels,blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr),triglyceride (TG),cholestrol(CHO),high-density liprotein(HDL) and nitric oxide were measured. ResultsCompared with model group ,blood glucose、BUN、Scr、TG、CHO decreased in C group (P<0.05 or P<0.01), nitric oxide、HDL were significantly improved (P<0.01) .ConclusionTLYST could relieve and retard the progress of DN, It's mechanism may be correlating with increased the content of NO.
Key words：TongLuoYiShenTang; Diabetic nephropathy; Nitric Oxide； Diabetic nephropathy animal model
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)，属糖尿病心、脑、肾三大严重并发症之一，为DM的主要死亡原因之一。若DN出现持续性蛋白尿，病情即呈进行性发展，平均7年即可致终末期肾脏病(ESRD)。因此如何有效的预防DN的发生或阻断病情的发展，延缓慢性肾衰的进程，已成为当今医学界亟待解决的重要课题。我们针对DN肾亏阴阳两虚、血络淤阻病机的认识，提出通络益肾法治疗DN的新思路，取得了较好的临床疗效。为进一步从实验学角度证实该疗法的疗效，并探讨其对链脲佐菌素DN大鼠血浆NO的影响，特设计本实验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物Wistar雄性大鼠41只，体重(180±20) g。由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2 用药通络益肾汤由桃仁、生地、山萸肉、山药、酒大黄、水蛭、黄芪等组成。大鼠用量按文献折算[1]，经常规煎煮、过滤、水浴蒸发至每毫升含生药材0.86 g，置于4 ℃冰箱保存备用；洛汀新：北京诺华制药有限公司生产，批号04025；糖适平：北京万辉双鹤药业有限责任公司生产，批号040202。
1.1.3 主要试剂链脲佐菌素(STZ)：sigma公司生产，批号040103；NO试剂盒：购自陕西宝泰克生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 模型复制及分组给药大鼠适应性喂养1周，称体重，经尿糖、尿蛋白定性检测为阴性后，随机抽取8只为正常对照组(A组)。其余33只按照文献法，用STZ缓冲液55 mg/kg(2.75 ml/kg)一次性腹腔注射造模，A组予以等量生理盐水腹腔注射(2.75 ml/kg)。造模后称体重，观察24 h尿量、饮食、饮水量，并每日检测血糖、尿糖，连续3 d尿糖定性+++以上，血糖>13.8 mmol/L，并持续上述标准不变者，确定糖尿病模型形成。再继续喂养一周，随机抽取两只测尿微量白蛋白。尿微量白蛋白>15 μg/ml，确定DN模型形成。造模成功后随机分为3组，以抽签方式确定为病理组13只(B组)，通络益肾汤治疗组10只(C组)，西药治疗组10只(D组)。A，B组分别给蒸馏水2 ml灌胃，C组给通络益肾汤煎液2 ml(28.7 g/kg)灌胃。D组给洛汀新(蒸馏水溶解1.5 mg/kg)及糖适平(蒸馏水溶解10 mg/kg)混悬液2 ml灌胃。以上给药1次/ d，共持续6周。
1.2.2 观测指标及方法
1.2.2.1 血糖、血脂、血浆蛋白生化自动分析仪测定。
1.2.2.2 尿糖定性、尿蛋白定性试纸条测定。
1.2.2.3 肾功能(BUN、Scr)测定二乙酰-肟法及苦味酸法测定。
1.2.2.4 血浆一氧化氮(NO)双缩脲法测定。
1.2.3 资料分析与统计各组数据以±s表示，组间比较采用多样本方差齐性检验及多个均数间两两比较的 t检验。
2 结果
2.1 治疗前后各组大鼠血糖的变化情况结果见表1。
2.2 治疗后各组大鼠血脂的比较 结果见表2。
表1 治疗前后各组大鼠血糖变化的情况(略)
★组内治疗前后比较P<0.05，△与A组比较 P<0.05 ， △△与A组比较 P<0.01，■与B组比较 P<0.05， ■■与B组比较P<0.01
表2 各组大鼠甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白的比较(略)
△与A组比较，P<0.05，△△与A组比较，P<0.01 ；■与B组比较，P<0.05，■■与B组比较，P<0.01 B组与A组比较，TG、TC升高(P<0.01 )，HDL降低(P<0.05)。C组与B组比较，TG，TC有所降低，HDL升高，差异均具有极显著性(P<0.01 或P<0.05)。D组与B组比较，TG，TC降低，HDL略升高，但差异不具有统计学意义。说明通络益肾汤在改善大鼠血脂方面的作用优于西药治疗组。
2.3 治疗后各组大鼠血浆总蛋白、白蛋白的比较 结果见表3。
表3 各组大鼠治疗后血浆总蛋白、白蛋白的比较(略)
△△与A组比较，P<0.01 ；■与B组比较，P<0.05B组大鼠血浆总蛋白及白蛋白含量较A组明显降低(P<0.01)；C组治疗后总蛋白及白蛋白较B组略有升高，但差异不具有统计学意义。D组总蛋白及白蛋白含量较B组高，差异具有显著性(P<0.05，P<0.05 )。说明在纠正低蛋白血症方面，西药治疗组强于通络益肾汤组。
2.4 治疗后各组大鼠BUN、Scr、NO的比较结果见表4。B组大鼠BUN、Scr较A组明显升高(P<0.01)；C组与B组比较，血BUN、Scr明显降低，具有极显著性差异(P<0.01)。D组与B组比较，BUN、Scr明显下降，差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。说明通络益肾汤和西药治疗在改善大鼠肾功能方面都有一定作用，尤以通络益肾汤降低BUN作用明显，但无统计学意义。与A组比较，B组大鼠血浆NO含量明显降低(P<0.01)，提示在DN的中后期，存在明显的NO含量降低。C组、D组与B组比较，NO含量升高(P<0.01或P<0.05)。说明通络益肾汤与西药治疗后，都能明显升高血浆NO水平，似通络益肾汤较血浆NO明显，但无统计学意义。
表4 各组大鼠治疗后BUN、Scr、NO的比较(略)
△△与A组比较，P<0.01 ；■与B组比较，P<0.05，■■与B组比较，P<0.01
3 讨论
我们根据多年的临床实践，认为淤血阻络、肾亏阴阳两虚是DN的主要病机[2]，并提出“通络益肾法”，创立“通络益肾汤”治疗DN，取得了满意的疗效。该方以《伤寒论》“抵当汤”和《金匮要略》“肾气丸”为基础加减化裁组成。在《伤寒论》中“抵当汤”用于治疗下焦蓄血证，《金匮要略》中的“肾气丸”可治疗肾阴阳两虚之消渴。方中桃仁、水蛭活血逐淤通经，生地清热生津、滋阴补肾，共为君药；山萸肉、山药补益肝肾，酒大黄通络逐淤，兼以泄浊，共为臣药；更佐以黄芪益气，淫羊藿补肾助阳，葛根生津通络，泽泻、茯苓淡利水湿共为佐药；川牛膝补益肝肾，逐淤通经利水，且引药下行入肾兼具佐使之用。本实验结果显示通络益肾汤可改善DN大鼠的一般状况，降低血糖、血脂，改善肾功能，延缓DN的发展，对DN具有整体防治效应。在DN的整个病程中，NO表现为从初期的升高到代偿性的正常再到下降的趋势[3]。NO是一种具有强烈舒张血管作用的因子，DN早期时NO合成增加，NO对入球小动脉的舒张强于出球小动脉，导致DM早期的肾小球高滤过。随着DN病程的进展，NO产生减少。DN中晚期NO明显下降则促进了肾小球基底膜增厚和系膜基质增生，加剧了肾小球血管壁结构和功能的紊乱。当NO减少时它对肾脏的保护作用也随之减弱，从而加剧了糖尿病肾小球硬化的形成[4]。本实验发现病理组中晚期DN大鼠血浆NO含量明显降低，与文献报道一致[4，5]。应用通络益肾汤治疗后，大鼠血浆NO含量较病理组明显升高；观察肾脏病理变化发现，其肾小球硬化及系膜基质增生情况都比病理组轻，说明通络益肾汤可使NO合成增加保护肾组织，延缓DN的发展，对DN起到治疗作用。综上所述，通络益肾汤扶正祛邪、消补兼施，具有活血通络、滋阴助阳、利水泄浊之效，适用于DN之血淤阻络、肾亏阴阳两虚证。STZ诱导的DN大鼠，应用通络益肾汤后，能控制血糖升高的幅度，改善脂质代谢及肾功能，升高血浆NO含量。证实通络益肾汤具有延缓DN发展，对DN的防治具有整体效应。
参考文献：
[1] 孙敬方.实验动物方法学，第1版[M].北京：人民出版社，2001：478.
[2] 李小会，董正华，丁 辉.糖尿病肾病病因机探讨[J].陕西中医，2005，26(6)：552.
[3] 冕 梁.NO,NOS与糖尿病肾病的关系及黄芪对其水平影响的研究[J].中医药学刊，2004；22(2)：234.
[4] 朱禧星.现代糖尿病学，第1版[M].广州：第二军医大学出版社，2000：316.
[5] 陈雪梅，杜晓刚.一氧化氮与肾小球疾病[J].国外医学泌尿系统分册，2000，20(5)：201.
基金项目：陕西省中医管理局资助项目(NO.2003107)
(陕西中医学院，陕西 西安 712046； 西安市中医医院 710001；陕西中医学院2002级研究生，陕西 西安 712046), http://www.100md.com(李小会，董正华，曹广顺，赵鑫，冀晓红，杨景锋)