肺癌患者14-3-3σ基因启动子甲基化与其mRNA表达水平的关系
[摘要] 目的:探讨肺癌患者14-3-3σ基因启动子CpG岛甲基化状况与其mRNA表达水平的关系。方法:用实时定量PCR检测14-3-3σ基因mRNA在肺癌组织、正常肺组织及肺癌细胞株A549中的表达；用甲基化特异性PCR检测这些组织、细胞中14-3-3σ启动子区CpG岛甲基化状态。结果：14-3-3σ基因启动子在肺癌组织和正常肺组织中发生甲基化的频率分别为51.11%(23/45)和17.39%(4/23)(χ2=7.229,P=0.007)。14-3-3σ mRNA在正常组织中全部表达，在肺癌组织中表达缺失率为15.56%(7/45)，且表达量低于正常肺组织(t=10.309,P<0.001)，不同肿瘤病理分型(SCLC、NSCLC)之间14-3-3σ mRNA有显著差异(t=5.256,P<0.023)，不同年龄、性别、肿瘤大小之间无显著差异(P>0.05)。14-3-3σ启动子甲基化与其表达量下降密切相关(r=0.48,P=0.04).结论：在肺癌中14-3-3σ启动子甲基化与其mRNA表达下调或缺失有密切关系，在肺癌发生中14-3-3σ异常甲基化起一定作用。
[关键词] 肺癌;14-3-3σ基因;启动子;甲基化;表达
The Relationship Between Promoter Hypermethylation of 14-3-3σ Gene and Transcription of 14-3-3σ in Lung Carcinoma
YU Zong-tao,YUAN Ya-li,FAN Li-xin,JIAO Hai-chun,QIN Yong
(Department of Science and Biological Technology,Nanhua University,Hengyang，Hunan 421001，China)
Abstract:Objective To investigate the relationship between the promoter methylation and the mRNA expression of 14-3-3σ gene in lung carcinoma.Methods The promoter methylation status of 14-3-3σ in 45 lung carcinoma tissues, 23 normal tissues and A549 cell lines was detected by methylation-specific PCR, its mRNA expression level was measured by real-time reverse transcription polymerase chain reaction.Results The frequency of promoter methylation of 14-3-3σ gene was 51.11%(23/45) in lung carcinoma and 17.39%(4/23) in normal tissues(χ2=7.229,P=0.007),respectively.14-3-3σ mRNA was all dectected in 23 normal tissues and there was no expression of 14-3-3σ in 15.56%(7/45) of lung carcinoma. The mRNA expression of 14-3-3σ was significantly lower in lung carcinoma tissues than in normal tissues(t=10.309,P<0.001). However, there was no correlation of 14-3-3σ mRNA expression with clinical data, such as sex, age, tumor size (P> 0.05),but there was a significant correlation between pathological type(SCLC、NSCLC,t=5.256,P＝0.023).In 23 patients with the aberrant promoter methylation,7 cases showed loss expression,13 cases with lower expression of 14-3-3σ mRNA than that in normal lung tissue. There are significant correlations between methylation 14-3-3σ and low expression of its mRNA(r=0.48,P=0.04).Conclusion Frequency of aberrant methylation of promoter of 14-3-3σ is apparently higher in lung carcinoma tissues than in normal tissues, its mRNA expression is either lost or lower in lung carcinoma tissues than that in normal tissues. It suggests that 14-3-3σ methylation may contribute to the development of lung carcinoma.
Key words:Lung carcinoma;14-3-3σ gene;Promoter;Methylation;Expression
基因组失去稳定性是癌症发生的关键因素之一。14-3-3σ是一类通过结合、分离磷酸化蛋白来调节细胞活性的蛋白家族中的一员，DNA 损伤后，14-3-3σ能促使细胞在有丝分裂前停止细胞周期进程；其功能丧失有助于恶性转化的发生。最近的研究表明乳腺癌、胃癌和口腔癌中存在14-3-3σ基因CpG岛的高甲基化和转录沉默，这进一步支持14-3-3σ功能丧失在肿瘤发生中的作用[1-3]。但在肺癌中14-3-3σ甲基化状态及与其基因表达的关系不明，有待于进一步研究。本文应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR)及逆转录实时定量PCR，检测了45例肺癌、23例正常肺组织中14-3-3σ基因启动子甲基化、14-3-3σ mRNA表达情况，以探讨其在肺癌发生中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本来源收集湖北省十堰市太和医院2005年3月-2006年2月手术切除肺癌新鲜标本45例,男28 例,女17例。年龄45～78 岁,平均55.3岁，其中小细胞肺癌(SLLC)8例、非小细胞肺癌(NSCLC)37例，全部标本均经病理证实。另取23 例距离肿瘤边缘2 cm 外正常组织作对照。
1.2 主要试剂与仪器Wizard DNA cleanup 纯化试剂盒、逆转录系统、RNA提取试剂(美国Promega公司)； PCR试剂(华美公司)；RPMI 1640培养基(GIBCO BRL公司)；二甲亚砜(DMSO)；对苯二酚和亚硫酸氢钠；5-Aza-CdR(美国Sigma公司)；GeneRuleTM100 bp DNA marker (MBI)。人肺癌细胞株A549购自武汉大学生物保藏中心。
1.3 A549细胞株培养及5-Aza-CdR药物处理将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5%CO2条件下培养24 h后，分别加入5×10-6 mol/L和5×10-5 mol/L 5-Aza-CdR，24 h后更换培养液液并加入同样浓度的5-Aza-CdR，连续3 d后用完全培养液继续培养4 d后进行实验；用同体积PBS处理的细胞作为对照组。
1.4 引物14-3-3σ甲基化引物[4]( 5'-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC-3'；5'-CCTCTAACCGCCCACCACG-3')扩增片段长度为105 bp;14-3-3σ非甲基化引物[1](5'-ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT-3'；5'-CCCTCTAACCACCCACCACA-3')片段长度为106 bp； 14-3-3σ-mRNA引物[5]( 5'-GTGTGTCCCCAGAGCCATGG-3'；5'-ACCTTCTCCCGGTACTCACG-3')片段长度为279 bp；GAPDH-mRNA引物[6] (5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'；5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3')片段长度为226 bp(北京赛百盛公司)。
1.5 方法
1.5.1 DNA及RNA提取以经典酚-氯仿抽提法提取正常组织、肺癌组织和A549细胞株DNA,经紫外光260 nm定量后即用或-40 ℃保存。用美国Promega公司RNA提取试剂盒(Trizol)提取组织及细胞RNA，根据说明书进行操作。提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即用试剂盒A3500逆转cDNA ，即用。
1.5.2 MS-PCR参照文献[7]基因组DNA进行磺化修饰：取4 μg(总体积为50 μl)基因组DNA，经变性、碱基修饰、脱盐后回收,再脱去磺化基团，用预冷酒精沉淀回收。离心干燥后重新溶于50 μl 去离子水中，即用或置-40℃保存。取磺化修饰后的基因组DNA 50～100 ng (3 μl) ，10×buffer 3 μl,2 mmol/ L dNTP 3 μl ,25 mmol/ L 氯化镁3 μl,Taq酶2 U (1μl),上下游引物各2 μl(12 pmol),20倍SYBR Green Ⅰ 0.75 μl，去离子水补齐至30 μl，组成PCR体系。置ABI 7 000仪进行扩增,95 ℃变性3 min；(95 ℃×60 s,58 ℃×30 s,72 ℃×60 s)×40，72 ℃读取荧光值；72 ℃延伸5 min，同时测定其熔点曲线。
1.5.3 SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR用无RNA酶的双蒸水稀释cDNA至100 μl，PCR反应体系如下：加入稀释的cDNA液5 μl，2 mmol/L dNTP混合液3 μl，25 mmol/L氯化镁3 μl，逆转录10倍缓冲液3 μl，上下游引物(50 pmol/L)各2 μl，Taq DNA聚合酶2 U，20倍SYBR Green Ⅰ 0.75 μl，加无核酸酶双蒸水至30 μl。置于PE7000扩增：95 ℃ 3 min；(95 ℃ 30 s 、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)×40，在72 ℃读取荧光值；72 ℃延伸5 min；同时测定其熔点曲线，然后产物进行电泳分析，进一步确认扩增的特异性。14-3-3σmRNA相对定量方法：用上述cDNA进行实时定量PCR，得到的Ct 值,通过计算得到扩增效率，以GAPDH mRNA 的量为参照，计算14-3-3σ mRNA的相对量。14-3-3σ mRNA/ GAPDH mRNA 用下述公式计算:(1+EGAPDH) Ct (GAPDH) / (1+E14-3-3σ) Ct(14-3-3σ)[8]。
1.6 统计学分析用SPSS10.0软件分析，mRNA表达水平定量测定用t检验，启动子甲基化状况用卡方检验。
2 结果
2.1 14-3-3σ甲基化检测在全部45例肺癌组织标本中，有8例(其中SCLC 5例)只存在甲基化PCR 产物，另外37例标本中都存在非甲基化PCR 产物，其中既有甲基化又有非甲基化产物的15例(其中SCLC 2例)，甲基化率51.11 %(图1)， 23例正常对照组织中检出甲基化4例，甲基化率17.39%(χ2=7.229,P=0.007)；不同年龄、性别、肿瘤大小之间无显著差异(P>0.05)，但SCLC和NSCLC之间差异显著(t=5.256,P＝0.023).
表1 肺癌患者14-3-3σ甲基化状况(略)
图1 肺癌中14-3-3σ 基因甲基化状态电泳图(略)
图2 GAPDH电泳图(226 bp)(略)
图3 14-3-3σ mRNA RT-PCR产物电泳图(279 bp)
M：甲基化；U：未甲基化；DW：蒸馏水对照；Blank：空白对照；Marker：分子量标准
2.2 14-3-3σ mRNA的相对定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳2 h证实了是一条特异的目的带(见图2、3)。正常组织中，14-3-3σ mRNA的Ct均值为24.86，而GAPDH mRNA的Ct均值为24.65，相对比值均值为0.86±0.13；23例甲基化阳性肺癌组织中,7例14-3-3σ mRNA低于检测下限(即在40个循环后还没有出现Ct值)，13例表达量低于正常肺组织，14-3-3σ mRNA的比值均值为0.39±0.20，与正常组织中检测的14-3-3σ mRNA结果差异显著(t=10.309,P<0.001)；A549细胞株中，14-3-3σ-mRNA相对定量为0.50，经5-Aza-CdR处理后，其14-3-3σ-mRNA相对定量增加，比值达到0.75。
2.3 14-3-3σ甲基化与其表达关系经相关分析14-3-3σ启动子甲基化与其表达量下降密切相关(r=0.48,P=0.04)。
3 讨论
所有14-3-3蛋白中14-3-3σ与肿瘤有着最直接的联系。14-3-3σ的主要调节基因是抑癌基因p53，它通过诱导p21介导的G1/S期阻断作用来调控细胞周期，另外p53通过诱导14-3-3σ的表达来调控G2/M期检查点。14-3-3σ的活化和表达增加，致使胞质中CDK1/cyclinB1复合物(促使细胞周期从G2期向M期过渡)分离，从而阻断CDC2和CDK1的相互作用并阻止细胞进入有丝分裂[9]，导致基因缺陷累积，诱发细胞恶性转化[10]。DNA甲基化是由甲基化酶介导的在DNA某些碱基上增加一个甲基的化学修饰过程。在肿瘤细胞中DNA甲基化主要发生在启动子区域的CpG 位点，基因由于启动子甲基化而失活，不仅抑制基因的表达，还改变蛋白和DNA的相互作用，导致染色质结构的改变，是抑制基因活性的一种重要机制[11]。最近研究显示5'-CpG岛的甲基化也被证明是肿瘤抑制基因失活的除突变和等位基因丢失外的第3种机制，而且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一机制[12]。由于甲基化可导致14-3-3σ 完全失活或部分失活，失去对细胞异常增殖的抑制调控，细胞异常增殖，可引起肿瘤形成。本试验结果显示肺癌组织和正常肺组织中14-3-3σ启动子甲基化率存在显著差异，表明在肺癌组织中14-3-3σ基因启动子区域确实存在CpG位点被甲基化的现象，且在肺癌形成中起一定的作用。用5-Aza-CdR处理A549细胞株后，其14-3-3σmRNA表达量增加，也进一步说明这一点。根据已被广泛证实的启动子区域的DNA甲基化胞嘧啶的密度和基因转录活性的相互关系[11]，可以认为启动子区域CpG位点甲基化是肺癌中14-3-3σ失活的主要机制之一，在肺癌的发生过程中发挥主要作用。14-3-3σ在正常组织中几乎全部正常表达，而在相对应的肺癌组织中呈现较高的表达缺失率，平均表达量显著降低，并且与肿瘤的病理类型、TNM 分期等因素不相关。说明14-3-3σ的表达缺失可能是肺癌的发生过程中早期事件。14-3-3σ启动子甲基化与其mRNA表达水平下降明显相关，提示启动子甲基化可能是肺癌中14-3-3σ表达下降的重要原因之一。通过检测肺癌组织中14-3-3σ基因启动子甲基化及其表达情况发现，肺癌中14-3-3σ基因启动子甲基化频率明显升高，其表达普遍下调或缺失，提示14-3-3σ启动子甲基化可能是其表达下降的重要原因之一，在肺癌的发生中起一定作用。
[参考文献]
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(南华大学生命科学与技术学院,湖南 衡阳 421001), http://www.100md.com(余宗涛, 袁亚莉, 范立新, 焦海春, 秦勇)
[关键词] 肺癌;14-3-3σ基因;启动子;甲基化;表达
The Relationship Between Promoter Hypermethylation of 14-3-3σ Gene and Transcription of 14-3-3σ in Lung Carcinoma
YU Zong-tao,YUAN Ya-li,FAN Li-xin,JIAO Hai-chun,QIN Yong
(Department of Science and Biological Technology,Nanhua University,Hengyang，Hunan 421001，China)
Abstract:Objective To investigate the relationship between the promoter methylation and the mRNA expression of 14-3-3σ gene in lung carcinoma.Methods The promoter methylation status of 14-3-3σ in 45 lung carcinoma tissues, 23 normal tissues and A549 cell lines was detected by methylation-specific PCR, its mRNA expression level was measured by real-time reverse transcription polymerase chain reaction.Results The frequency of promoter methylation of 14-3-3σ gene was 51.11%(23/45) in lung carcinoma and 17.39%(4/23) in normal tissues(χ2=7.229,P=0.007),respectively.14-3-3σ mRNA was all dectected in 23 normal tissues and there was no expression of 14-3-3σ in 15.56%(7/45) of lung carcinoma. The mRNA expression of 14-3-3σ was significantly lower in lung carcinoma tissues than in normal tissues(t=10.309,P<0.001). However, there was no correlation of 14-3-3σ mRNA expression with clinical data, such as sex, age, tumor size (P> 0.05),but there was a significant correlation between pathological type(SCLC、NSCLC,t=5.256,P＝0.023).In 23 patients with the aberrant promoter methylation,7 cases showed loss expression,13 cases with lower expression of 14-3-3σ mRNA than that in normal lung tissue. There are significant correlations between methylation 14-3-3σ and low expression of its mRNA(r=0.48,P=0.04).Conclusion Frequency of aberrant methylation of promoter of 14-3-3σ is apparently higher in lung carcinoma tissues than in normal tissues, its mRNA expression is either lost or lower in lung carcinoma tissues than that in normal tissues. It suggests that 14-3-3σ methylation may contribute to the development of lung carcinoma.
Key words:Lung carcinoma;14-3-3σ gene;Promoter;Methylation;Expression
基因组失去稳定性是癌症发生的关键因素之一。14-3-3σ是一类通过结合、分离磷酸化蛋白来调节细胞活性的蛋白家族中的一员，DNA 损伤后，14-3-3σ能促使细胞在有丝分裂前停止细胞周期进程；其功能丧失有助于恶性转化的发生。最近的研究表明乳腺癌、胃癌和口腔癌中存在14-3-3σ基因CpG岛的高甲基化和转录沉默，这进一步支持14-3-3σ功能丧失在肿瘤发生中的作用[1-3]。但在肺癌中14-3-3σ甲基化状态及与其基因表达的关系不明，有待于进一步研究。本文应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR)及逆转录实时定量PCR，检测了45例肺癌、23例正常肺组织中14-3-3σ基因启动子甲基化、14-3-3σ mRNA表达情况，以探讨其在肺癌发生中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本来源收集湖北省十堰市太和医院2005年3月-2006年2月手术切除肺癌新鲜标本45例,男28 例,女17例。年龄45～78 岁,平均55.3岁，其中小细胞肺癌(SLLC)8例、非小细胞肺癌(NSCLC)37例，全部标本均经病理证实。另取23 例距离肿瘤边缘2 cm 外正常组织作对照。
1.2 主要试剂与仪器Wizard DNA cleanup 纯化试剂盒、逆转录系统、RNA提取试剂(美国Promega公司)； PCR试剂(华美公司)；RPMI 1640培养基(GIBCO BRL公司)；二甲亚砜(DMSO)；对苯二酚和亚硫酸氢钠；5-Aza-CdR(美国Sigma公司)；GeneRuleTM100 bp DNA marker (MBI)。人肺癌细胞株A549购自武汉大学生物保藏中心。
1.3 A549细胞株培养及5-Aza-CdR药物处理将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5%CO2条件下培养24 h后，分别加入5×10-6 mol/L和5×10-5 mol/L 5-Aza-CdR，24 h后更换培养液液并加入同样浓度的5-Aza-CdR，连续3 d后用完全培养液继续培养4 d后进行实验；用同体积PBS处理的细胞作为对照组。
1.4 引物14-3-3σ甲基化引物[4]( 5'-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC-3'；5'-CCTCTAACCGCCCACCACG-3')扩增片段长度为105 bp;14-3-3σ非甲基化引物[1](5'-ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT-3'；5'-CCCTCTAACCACCCACCACA-3')片段长度为106 bp； 14-3-3σ-mRNA引物[5]( 5'-GTGTGTCCCCAGAGCCATGG-3'；5'-ACCTTCTCCCGGTACTCACG-3')片段长度为279 bp；GAPDH-mRNA引物[6] (5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'；5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3')片段长度为226 bp(北京赛百盛公司)。
1.5 方法
1.5.1 DNA及RNA提取以经典酚-氯仿抽提法提取正常组织、肺癌组织和A549细胞株DNA,经紫外光260 nm定量后即用或-40 ℃保存。用美国Promega公司RNA提取试剂盒(Trizol)提取组织及细胞RNA，根据说明书进行操作。提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即用试剂盒A3500逆转cDNA ，即用。
1.5.2 MS-PCR参照文献[7]基因组DNA进行磺化修饰：取4 μg(总体积为50 μl)基因组DNA，经变性、碱基修饰、脱盐后回收,再脱去磺化基团，用预冷酒精沉淀回收。离心干燥后重新溶于50 μl 去离子水中，即用或置-40℃保存。取磺化修饰后的基因组DNA 50～100 ng (3 μl) ，10×buffer 3 μl,2 mmol/ L dNTP 3 μl ,25 mmol/ L 氯化镁3 μl,Taq酶2 U (1μl),上下游引物各2 μl(12 pmol),20倍SYBR Green Ⅰ 0.75 μl，去离子水补齐至30 μl，组成PCR体系。置ABI 7 000仪进行扩增,95 ℃变性3 min；(95 ℃×60 s,58 ℃×30 s,72 ℃×60 s)×40，72 ℃读取荧光值；72 ℃延伸5 min，同时测定其熔点曲线。
1.5.3 SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR用无RNA酶的双蒸水稀释cDNA至100 μl，PCR反应体系如下：加入稀释的cDNA液5 μl，2 mmol/L dNTP混合液3 μl，25 mmol/L氯化镁3 μl，逆转录10倍缓冲液3 μl，上下游引物(50 pmol/L)各2 μl，Taq DNA聚合酶2 U，20倍SYBR Green Ⅰ 0.75 μl，加无核酸酶双蒸水至30 μl。置于PE7000扩增：95 ℃ 3 min；(95 ℃ 30 s 、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)×40，在72 ℃读取荧光值；72 ℃延伸5 min；同时测定其熔点曲线，然后产物进行电泳分析，进一步确认扩增的特异性。14-3-3σmRNA相对定量方法：用上述cDNA进行实时定量PCR，得到的Ct 值,通过计算得到扩增效率，以GAPDH mRNA 的量为参照，计算14-3-3σ mRNA的相对量。14-3-3σ mRNA/ GAPDH mRNA 用下述公式计算:(1+EGAPDH) Ct (GAPDH) / (1+E14-3-3σ) Ct(14-3-3σ)[8]。
1.6 统计学分析用SPSS10.0软件分析，mRNA表达水平定量测定用t检验，启动子甲基化状况用卡方检验。
2 结果
2.1 14-3-3σ甲基化检测在全部45例肺癌组织标本中，有8例(其中SCLC 5例)只存在甲基化PCR 产物，另外37例标本中都存在非甲基化PCR 产物，其中既有甲基化又有非甲基化产物的15例(其中SCLC 2例)，甲基化率51.11 %(图1)， 23例正常对照组织中检出甲基化4例，甲基化率17.39%(χ2=7.229,P=0.007)；不同年龄、性别、肿瘤大小之间无显著差异(P>0.05)，但SCLC和NSCLC之间差异显著(t=5.256,P＝0.023).
表1 肺癌患者14-3-3σ甲基化状况(略)
图1 肺癌中14-3-3σ 基因甲基化状态电泳图(略)
图2 GAPDH电泳图(226 bp)(略)
图3 14-3-3σ mRNA RT-PCR产物电泳图(279 bp)
M：甲基化；U：未甲基化；DW：蒸馏水对照；Blank：空白对照；Marker：分子量标准
2.2 14-3-3σ mRNA的相对定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳2 h证实了是一条特异的目的带(见图2、3)。正常组织中，14-3-3σ mRNA的Ct均值为24.86，而GAPDH mRNA的Ct均值为24.65，相对比值均值为0.86±0.13；23例甲基化阳性肺癌组织中,7例14-3-3σ mRNA低于检测下限(即在40个循环后还没有出现Ct值)，13例表达量低于正常肺组织，14-3-3σ mRNA的比值均值为0.39±0.20，与正常组织中检测的14-3-3σ mRNA结果差异显著(t=10.309,P<0.001)；A549细胞株中，14-3-3σ-mRNA相对定量为0.50，经5-Aza-CdR处理后，其14-3-3σ-mRNA相对定量增加，比值达到0.75。
2.3 14-3-3σ甲基化与其表达关系经相关分析14-3-3σ启动子甲基化与其表达量下降密切相关(r=0.48,P=0.04)。
3 讨论
所有14-3-3蛋白中14-3-3σ与肿瘤有着最直接的联系。14-3-3σ的主要调节基因是抑癌基因p53，它通过诱导p21介导的G1/S期阻断作用来调控细胞周期，另外p53通过诱导14-3-3σ的表达来调控G2/M期检查点。14-3-3σ的活化和表达增加，致使胞质中CDK1/cyclinB1复合物(促使细胞周期从G2期向M期过渡)分离，从而阻断CDC2和CDK1的相互作用并阻止细胞进入有丝分裂[9]，导致基因缺陷累积，诱发细胞恶性转化[10]。DNA甲基化是由甲基化酶介导的在DNA某些碱基上增加一个甲基的化学修饰过程。在肿瘤细胞中DNA甲基化主要发生在启动子区域的CpG 位点，基因由于启动子甲基化而失活，不仅抑制基因的表达，还改变蛋白和DNA的相互作用，导致染色质结构的改变，是抑制基因活性的一种重要机制[11]。最近研究显示5'-CpG岛的甲基化也被证明是肿瘤抑制基因失活的除突变和等位基因丢失外的第3种机制，而且在某些情况下是抑癌基因失活的唯一机制[12]。由于甲基化可导致14-3-3σ 完全失活或部分失活，失去对细胞异常增殖的抑制调控，细胞异常增殖，可引起肿瘤形成。本试验结果显示肺癌组织和正常肺组织中14-3-3σ启动子甲基化率存在显著差异，表明在肺癌组织中14-3-3σ基因启动子区域确实存在CpG位点被甲基化的现象，且在肺癌形成中起一定的作用。用5-Aza-CdR处理A549细胞株后，其14-3-3σmRNA表达量增加，也进一步说明这一点。根据已被广泛证实的启动子区域的DNA甲基化胞嘧啶的密度和基因转录活性的相互关系[11]，可以认为启动子区域CpG位点甲基化是肺癌中14-3-3σ失活的主要机制之一，在肺癌的发生过程中发挥主要作用。14-3-3σ在正常组织中几乎全部正常表达，而在相对应的肺癌组织中呈现较高的表达缺失率，平均表达量显著降低，并且与肿瘤的病理类型、TNM 分期等因素不相关。说明14-3-3σ的表达缺失可能是肺癌的发生过程中早期事件。14-3-3σ启动子甲基化与其mRNA表达水平下降明显相关，提示启动子甲基化可能是肺癌中14-3-3σ表达下降的重要原因之一。通过检测肺癌组织中14-3-3σ基因启动子甲基化及其表达情况发现，肺癌中14-3-3σ基因启动子甲基化频率明显升高，其表达普遍下调或缺失，提示14-3-3σ启动子甲基化可能是其表达下降的重要原因之一，在肺癌的发生中起一定作用。
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(南华大学生命科学与技术学院,湖南 衡阳 421001), http://www.100md.com(余宗涛, 袁亚莉, 范立新, 焦海春, 秦勇)