AgNOR计数DNA含量P53基因蛋白和PCNA表达在甲状腺滤泡性肿瘤诊断中的研究
[摘 要] 目的：探讨AgNOR个数、DNA含量、P53、PCNA表达在甲状腺滤泡性肿瘤诊断中的意义。方法：应用胶银染色法行AgNOR计数、FCM行细胞核DNA含量测定，间接免疫荧光标记通过FCM行P53的定性和定量检测，免疫组化方法检测PCNA在甲状腺滤泡性肿瘤中的表达，分析AgNOR个数、DNA含量及P53基因蛋白和PCNA表达与滤泡性肿瘤的组织学类型的关系。结果：AgNOR计数在正常甲状腺上皮、腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.05)。腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌间差异无显著性(P>0.05)。DNA含量在正常甲状腺与腺瘤之间差异无显著性(P>0.05)。而正常甲状腺上皮、腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.01),而腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌之间差异无显著性(P>0.05)。P53基因蛋白表达在正常上皮与腺瘤间差异无显著性(P>0.05)；与腺瘤伴上皮增生活跃、腺癌间差异有显著性(P<0.01)。腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.05)。而腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌间差异无显著性(P>0.05)。PCNA表达在正常上皮与腺瘤间差异无显著性(P>0.05)；与腺瘤伴上皮增生活跃、腺癌间差异有显著性(P<0.01)。腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.05)。而腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌间差异无显著性(P>0.05)。结论：在甲状腺滤泡性肿瘤的鉴别中行AgNOR计数意义不大，而行DNA含量测定及P53基因蛋白的定量和PCNA检测有一定的意义。
[关键词] 甲状腺肿瘤；AgNOR计数；DNA含量；P53基因蛋白；PCNA
AgNOR DNA Content Protein P53 and PCNA in the Thyroid Neoplosm Diagnose of Investigation
JIANG Xunzhong, CHEN Lanting, CHU Xiaoli, ZHAO Guirong, ZHANG Xiangsheng
(Linzi Qidou Hospital of Zibo, Zibo, Shandong 255036, China;Medicine couege of Binzhou, Binzhou, Shandong 256618, China)
Abstract：Objective To study the diagnostic significance of AgNOR,DNA contentand P53 protein in the follicular neoplasms of the thyroid gland.Methods AgNORs were counted and DNA content and P53 protein were investigated by FCM.Relation between AgNOR,DNA content,P53 protein and the histologic types of the thyroid tumors was analysed.Results No relationship was found bet weenⅠ(normal thyroid) and Ⅱ(adenoma)group as well as Ⅲ(adenoma with epithelialum actively proliferating) and Ⅳ group (follicular carcinoma) inAgNOR,DNA content and P53 protein and PCNA(P> 0.05).It was statistically significance to compareⅠorⅡgroup with Ⅲor Ⅳ group(P<0.05).Conclusion Adenoma with epithelialum actively proliferating is a borderline lesion.It is valuable to study the AgNOR,DNA content and P53 protein and PCNA in the differential diagnosis of the follicular neoplasms of the thyroid.
Key words：Thyroid neoplasm;AgNOR;DNA content;Protein P53； PCNA differential diagnosis
甲状腺肿瘤种类繁多，尤其是滤泡性肿瘤的良恶性鉴别是病理医生的诊断难点之一。国内外不少学者对其作过探讨。本文应用AgNOR染色计数、DNA含量及P53基因蛋白的测定和PCNA表达进行分析，探讨其在此类肿瘤中的诊断和鉴别诊断中的意义。
1 材料和方法
1.1 材料来源与分组 选用我院1978年至2000年存档中甲状腺手术切除标本87例，简要复习病史，重检全部常规切片。I组：瘤周正常甲状腺组织9例;Ⅱ组：腺瘤22例,滤泡上皮无明显增生，包括胚胎型腺瘤10例，胎儿型腺瘤12例。Ⅲ组：腺瘤伴上皮活跃增生20例，肿瘤有包膜，上皮活跃增生，可见腺体密集，背靠背现象，核有中度、重度不典型性，无肯定的包膜、脉管及周边甲状腺侵犯。Ⅳ组：滤泡性癌16例，其中高分化型10例，低分化型6例。Ⅴ组：乳头状甲状腺癌20例，组织学分级为Ⅰ级6例，Ⅱ级8例，Ⅲ级6例；其中具有典型包膜侵犯者13例。
1.2 方法 每例选取有代表性蜡块1个，以Leica切片机连续切片3张，标本经10%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、常规制片HE染色、行AgNOR染色和PCNA免疫组化染色[试剂为抗人PCNA单克隆抗体及LSAB试剂盒(DAKO)，选用免疫组化染色LSAB法]及DNA含量测定和P53基因蛋白检测(使用美国BD公司生产的FACS-420型流式细胞仪进行探测)，应用PEMS软件包(华西医科大学研制)进行统计学处理。
2 结果
2.1 AgNOR计数 胶银染色切片背景呈淡黄色，AgNOR颗粒呈棕黑色。正常甲状腺和腺瘤中，颗粒大小较一致，多散在分布，形态较规则，界清。而在腺瘤伴上皮活跃增生、滤泡性癌和乳头状癌中,颗粒大小不一致，有些核内散在较多颗粒，有些聚集，呈大小颗粒混合状分布。各组之间比较见表1。
表1 AgNOR个数比较(略)
2.2 DNA含量 Ⅰ组和Ⅱ组，G0/1期峰均为DNA二倍体；Ⅳ组中9例为近二倍体，7例为异倍体。Ⅲ组20例中18例为DNA二倍体和近二倍体，仅2例为异倍体，此2例后经连续多切片，1例见到包膜浸润(实为滤泡性癌)。详见表2、表3。
表2 DNA倍体比较(略)
表3 DI比较(略)
2.3 P53基因蛋白检测 P53基因蛋白表达阳性率分别为I组1/9，11.1%；Ⅱ组为11/22，50%；Ⅲ组14/20，70%，Ⅳ组13/16，81%，统计学处理，差异无显著意义(P>0.05)。FI值比较见表4。
表4 P53 FI比较(略)
2.4 PCNA免疫组化染色结果 PCNA的表达在正常上皮与腺瘤间差异无显著性(P>0.05)；与腺瘤伴上皮增生活跃、腺癌间差异有显著性(P<0.01)。腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.05)，而腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌间差异无显著性(P>0.05)。
表5 PCNA免疫组化染色结果(略)
3 讨论
甲状腺滤泡性肿瘤的病理诊断，特别是腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌的鉴别是病理医生棘手的问题之一。Rosai等[1]对696例滤泡性肿瘤重新复习，由5名病理学专家分别阅片，完全统一者仅占25%。Anderson等[2]报告1 105例滤泡性腺瘤，5 a转移率为15%，10 a死亡率为10%。腺瘤伴上皮增生活跃是指滤泡上皮活跃增生,腺体排列密集，可见背靠背及共壁现象，核呈中度至重度异型性，可见分裂相，无肯定的包膜、脉管及周边甲状腺的侵犯，很难与滤泡性癌进行区别。另外，此类病变是甲状腺早期癌、交界性病变、还是良性肿瘤仍不统一。有人称此种病变为有包膜的滤泡性癌(encapsulated follicular carcinoma)[2]，可见探讨滤泡性肿瘤的诊断依据及鉴别要点是非常重要的。AgNOR所处的DNA位点具有转录rDNA并参与核仁合成的功能。体细胞一旦发生恶化，可表现为AgNOR数量及结构和DNA含量的异常[3]，行AgNOR计数及DNA含量测定有助于良恶性病变的鉴别。本组病例显示，AgNOR计数，正常上皮和腺瘤之间差异无显著性意义，而与腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌比较，差异有显著性意义，后两者比较，差异无显著性意义。DNA含量分析表明，正常上皮和腺瘤之间差异无显著性意义，而与腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌比较，差异有显著性意义，而后两者比较，差异无显著性意义。可见腺瘤伴上皮活跃增生是一种交界性病变，仅行AgNOR颗粒计数，对良恶性鉴别有一定困难，应结合颗粒的形状及分布情况作综合分析。DNA含量异常是恶性肿瘤的重要标志，AgNOR计数结合DNA含量测定对腺瘤伴上皮增生活跃及滤泡性癌的鉴别诊断具有一定意义。P53是一种抑癌基因，参与细胞生长的负调节。正常细胞一旦发生恶化,P53突变,失去间接性抑制细胞增殖的作用,细胞无限制性增生而发生肿瘤[4]。研究结果表明,在良性、恶性肿瘤中,分化程度低者,阳性率也较高,提示P53基因蛋白表达与肿瘤的生物学行为关系密切。本研究表明,P53基因蛋白的表达率自正常上皮、腺瘤、腺瘤伴上皮增生活跃、滤泡性癌逐渐升高，而定量分析，正常上皮和腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌比较，差异均有显著性意义，而腺瘤伴上皮增生活跃与滤泡性癌比较，差异无显著性意义。可见，检测P53对腺瘤伴上皮增生活跃与滤泡性癌的区别有一定的意义。PCNA又称周期素，其本质是DNA聚合酶δ辅助蛋白，故PCNA与细胞周期密切相关。多种肿瘤中PCNA的表达结果显示，PCNA与肿瘤分级、分期、预后有密切关系。本实验结果显示正常上皮与腺瘤间差异无显著性(P>0.05)；与腺瘤伴上皮增生活跃、腺癌间差异有显著性(P<0.01)。腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.05)，而腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌间差异无显著性(P>0.05)。由此可见，行PCNA检测并进行定量分析，对甲状腺滤泡性肿瘤良恶性鉴别有一定价值。
4 体会
通过本研究结果，我们认为伴有不典型增生的甲状腺肿瘤有3种情况：结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤伴有不典型增生、甲状腺早期滤泡癌。结节性甲状腺肿是一种代谢性疾病，尽管增生较重，核有明显异型性，甚至有假浸润，实为代偿性增生，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测为良性特点。早期滤泡癌是恶性增生，有包膜、血管的浸润，核有异型性，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测具有恶性特征。本研究中复发的2例，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测显示恶性特征，这2例可能就是早期癌。甲状腺腺瘤伴有不典型增生从理论上讲与其他器官的不典型增生一样，有低级别和高级别，此类病变是甲状腺早期癌、交界性病变，还是良性肿瘤难以确定，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测有些呈良性特点，而另一些呈恶性特点。因此，我们认为，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测对伴有增生活跃的甲状腺的病变有一定价值。
参考文献：
[1] Rosai J,Carcangiu ML.Pathology of thyroid gland Some resentand oldquestion[J].Human Pathol,1984,15:10081012.
[2] Evans HL.Follicular neoplasms of the thyroid A study of 44 cases followed for a mininum of 10 years with emphasis on differentiated diagnosis[J].Cancer,1984,54:535540.
[3] 左连富,郭建文,甄艳军.甲状腺癌细胞DNA含量流式细胞仪分析[J].中华肿瘤杂志,1991,13:106108.
[4] 郑杰,吴秉铨.P53研究的新进展[J].中华病理学杂志,1997,28:251254.
[5] 罗泊涛，郑洪，李德祥.细胞增殖活性及形态计量学在甲状腺肿瘤中的诊断意义[J].贵州医药，2003，27：57.
[6] 杨亦萍，韦敏怡.增值细胞核抗原在甲状腺肿瘤中的表达及其意义[J].中国肿瘤临床，1999，26：753755.
[7] Almendral JM,HUEBSCH K,Blundell PA,et al.Cloning of sequence of the human nuclear cyclin homology with DNA binding proteins[J].Proc Acad Sci USA，1987,84:15751579.
[8] Tateiama H,Yang YP,EimotoT,et al.Prolfeative cell nuclear antigen expression in follicular tumors of the thyroid with special reference to oxyphilic cell lession[J].Virchows Arch,1994,424:533537.
(淄博市临淄区齐都医院，山东 淄博 255036；滨州医学院，山东 滨州 256618), http://www.100md.com(姜训忠，陈兰亭，初晓丽，赵桂荣，张祥盛)
[关键词] 甲状腺肿瘤；AgNOR计数；DNA含量；P53基因蛋白；PCNA
AgNOR DNA Content Protein P53 and PCNA in the Thyroid Neoplosm Diagnose of Investigation
JIANG Xunzhong, CHEN Lanting, CHU Xiaoli, ZHAO Guirong, ZHANG Xiangsheng
(Linzi Qidou Hospital of Zibo, Zibo, Shandong 255036, China;Medicine couege of Binzhou, Binzhou, Shandong 256618, China)
Abstract：Objective To study the diagnostic significance of AgNOR,DNA contentand P53 protein in the follicular neoplasms of the thyroid gland.Methods AgNORs were counted and DNA content and P53 protein were investigated by FCM.Relation between AgNOR,DNA content,P53 protein and the histologic types of the thyroid tumors was analysed.Results No relationship was found bet weenⅠ(normal thyroid) and Ⅱ(adenoma)group as well as Ⅲ(adenoma with epithelialum actively proliferating) and Ⅳ group (follicular carcinoma) inAgNOR,DNA content and P53 protein and PCNA(P> 0.05).It was statistically significance to compareⅠorⅡgroup with Ⅲor Ⅳ group(P<0.05).Conclusion Adenoma with epithelialum actively proliferating is a borderline lesion.It is valuable to study the AgNOR,DNA content and P53 protein and PCNA in the differential diagnosis of the follicular neoplasms of the thyroid.
Key words：Thyroid neoplasm;AgNOR;DNA content;Protein P53； PCNA differential diagnosis
甲状腺肿瘤种类繁多，尤其是滤泡性肿瘤的良恶性鉴别是病理医生的诊断难点之一。国内外不少学者对其作过探讨。本文应用AgNOR染色计数、DNA含量及P53基因蛋白的测定和PCNA表达进行分析，探讨其在此类肿瘤中的诊断和鉴别诊断中的意义。
1 材料和方法
1.1 材料来源与分组 选用我院1978年至2000年存档中甲状腺手术切除标本87例，简要复习病史，重检全部常规切片。I组：瘤周正常甲状腺组织9例;Ⅱ组：腺瘤22例,滤泡上皮无明显增生，包括胚胎型腺瘤10例，胎儿型腺瘤12例。Ⅲ组：腺瘤伴上皮活跃增生20例，肿瘤有包膜，上皮活跃增生，可见腺体密集，背靠背现象，核有中度、重度不典型性，无肯定的包膜、脉管及周边甲状腺侵犯。Ⅳ组：滤泡性癌16例，其中高分化型10例，低分化型6例。Ⅴ组：乳头状甲状腺癌20例，组织学分级为Ⅰ级6例，Ⅱ级8例，Ⅲ级6例；其中具有典型包膜侵犯者13例。
1.2 方法 每例选取有代表性蜡块1个，以Leica切片机连续切片3张，标本经10%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、常规制片HE染色、行AgNOR染色和PCNA免疫组化染色[试剂为抗人PCNA单克隆抗体及LSAB试剂盒(DAKO)，选用免疫组化染色LSAB法]及DNA含量测定和P53基因蛋白检测(使用美国BD公司生产的FACS-420型流式细胞仪进行探测)，应用PEMS软件包(华西医科大学研制)进行统计学处理。
2 结果
2.1 AgNOR计数 胶银染色切片背景呈淡黄色，AgNOR颗粒呈棕黑色。正常甲状腺和腺瘤中，颗粒大小较一致，多散在分布，形态较规则，界清。而在腺瘤伴上皮活跃增生、滤泡性癌和乳头状癌中,颗粒大小不一致，有些核内散在较多颗粒，有些聚集，呈大小颗粒混合状分布。各组之间比较见表1。
表1 AgNOR个数比较(略)
2.2 DNA含量 Ⅰ组和Ⅱ组，G0/1期峰均为DNA二倍体；Ⅳ组中9例为近二倍体，7例为异倍体。Ⅲ组20例中18例为DNA二倍体和近二倍体，仅2例为异倍体，此2例后经连续多切片，1例见到包膜浸润(实为滤泡性癌)。详见表2、表3。
表2 DNA倍体比较(略)
表3 DI比较(略)
2.3 P53基因蛋白检测 P53基因蛋白表达阳性率分别为I组1/9，11.1%；Ⅱ组为11/22，50%；Ⅲ组14/20，70%，Ⅳ组13/16，81%，统计学处理，差异无显著意义(P>0.05)。FI值比较见表4。
表4 P53 FI比较(略)
2.4 PCNA免疫组化染色结果 PCNA的表达在正常上皮与腺瘤间差异无显著性(P>0.05)；与腺瘤伴上皮增生活跃、腺癌间差异有显著性(P<0.01)。腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.05)，而腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌间差异无显著性(P>0.05)。
表5 PCNA免疫组化染色结果(略)
3 讨论
甲状腺滤泡性肿瘤的病理诊断，特别是腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌的鉴别是病理医生棘手的问题之一。Rosai等[1]对696例滤泡性肿瘤重新复习，由5名病理学专家分别阅片，完全统一者仅占25%。Anderson等[2]报告1 105例滤泡性腺瘤，5 a转移率为15%，10 a死亡率为10%。腺瘤伴上皮增生活跃是指滤泡上皮活跃增生,腺体排列密集，可见背靠背及共壁现象，核呈中度至重度异型性，可见分裂相，无肯定的包膜、脉管及周边甲状腺的侵犯，很难与滤泡性癌进行区别。另外，此类病变是甲状腺早期癌、交界性病变、还是良性肿瘤仍不统一。有人称此种病变为有包膜的滤泡性癌(encapsulated follicular carcinoma)[2]，可见探讨滤泡性肿瘤的诊断依据及鉴别要点是非常重要的。AgNOR所处的DNA位点具有转录rDNA并参与核仁合成的功能。体细胞一旦发生恶化，可表现为AgNOR数量及结构和DNA含量的异常[3]，行AgNOR计数及DNA含量测定有助于良恶性病变的鉴别。本组病例显示，AgNOR计数，正常上皮和腺瘤之间差异无显著性意义，而与腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌比较，差异有显著性意义，后两者比较，差异无显著性意义。DNA含量分析表明，正常上皮和腺瘤之间差异无显著性意义，而与腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌比较，差异有显著性意义，而后两者比较，差异无显著性意义。可见腺瘤伴上皮活跃增生是一种交界性病变，仅行AgNOR颗粒计数，对良恶性鉴别有一定困难，应结合颗粒的形状及分布情况作综合分析。DNA含量异常是恶性肿瘤的重要标志，AgNOR计数结合DNA含量测定对腺瘤伴上皮增生活跃及滤泡性癌的鉴别诊断具有一定意义。P53是一种抑癌基因，参与细胞生长的负调节。正常细胞一旦发生恶化,P53突变,失去间接性抑制细胞增殖的作用,细胞无限制性增生而发生肿瘤[4]。研究结果表明,在良性、恶性肿瘤中,分化程度低者,阳性率也较高,提示P53基因蛋白表达与肿瘤的生物学行为关系密切。本研究表明,P53基因蛋白的表达率自正常上皮、腺瘤、腺瘤伴上皮增生活跃、滤泡性癌逐渐升高，而定量分析，正常上皮和腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和滤泡性癌比较，差异均有显著性意义，而腺瘤伴上皮增生活跃与滤泡性癌比较，差异无显著性意义。可见，检测P53对腺瘤伴上皮增生活跃与滤泡性癌的区别有一定的意义。PCNA又称周期素，其本质是DNA聚合酶δ辅助蛋白，故PCNA与细胞周期密切相关。多种肿瘤中PCNA的表达结果显示，PCNA与肿瘤分级、分期、预后有密切关系。本实验结果显示正常上皮与腺瘤间差异无显著性(P>0.05)；与腺瘤伴上皮增生活跃、腺癌间差异有显著性(P<0.01)。腺瘤与腺瘤伴上皮增生活跃和腺癌间差异有显著性(P<0.05)，而腺瘤伴上皮增生活跃与腺癌间差异无显著性(P>0.05)。由此可见，行PCNA检测并进行定量分析，对甲状腺滤泡性肿瘤良恶性鉴别有一定价值。
4 体会
通过本研究结果，我们认为伴有不典型增生的甲状腺肿瘤有3种情况：结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤伴有不典型增生、甲状腺早期滤泡癌。结节性甲状腺肿是一种代谢性疾病，尽管增生较重，核有明显异型性，甚至有假浸润，实为代偿性增生，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测为良性特点。早期滤泡癌是恶性增生，有包膜、血管的浸润，核有异型性，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测具有恶性特征。本研究中复发的2例，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测显示恶性特征，这2例可能就是早期癌。甲状腺腺瘤伴有不典型增生从理论上讲与其他器官的不典型增生一样，有低级别和高级别，此类病变是甲状腺早期癌、交界性病变，还是良性肿瘤难以确定，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测有些呈良性特点，而另一些呈恶性特点。因此，我们认为，行AgNOR计数、DNA倍体分析、P53基因蛋白表达和PCNA检测对伴有增生活跃的甲状腺的病变有一定价值。
参考文献：
[1] Rosai J,Carcangiu ML.Pathology of thyroid gland Some resentand oldquestion[J].Human Pathol,1984,15:10081012.
[2] Evans HL.Follicular neoplasms of the thyroid A study of 44 cases followed for a mininum of 10 years with emphasis on differentiated diagnosis[J].Cancer,1984,54:535540.
[3] 左连富,郭建文,甄艳军.甲状腺癌细胞DNA含量流式细胞仪分析[J].中华肿瘤杂志,1991,13:106108.
[4] 郑杰,吴秉铨.P53研究的新进展[J].中华病理学杂志,1997,28:251254.
[5] 罗泊涛，郑洪，李德祥.细胞增殖活性及形态计量学在甲状腺肿瘤中的诊断意义[J].贵州医药，2003，27：57.
[6] 杨亦萍，韦敏怡.增值细胞核抗原在甲状腺肿瘤中的表达及其意义[J].中国肿瘤临床，1999，26：753755.
[7] Almendral JM,HUEBSCH K,Blundell PA,et al.Cloning of sequence of the human nuclear cyclin homology with DNA binding proteins[J].Proc Acad Sci USA，1987,84:15751579.
[8] Tateiama H,Yang YP,EimotoT,et al.Prolfeative cell nuclear antigen expression in follicular tumors of the thyroid with special reference to oxyphilic cell lession[J].Virchows Arch,1994,424:533537.
(淄博市临淄区齐都医院，山东 淄博 255036；滨州医学院，山东 滨州 256618), http://www.100md.com(姜训忠，陈兰亭，初晓丽，赵桂荣，张祥盛)