视网膜神经节细胞体外培养研究进展
视网膜神经节细胞;,细胞,培养的,,视网膜神经节细胞;,细胞,培养的,1材料来源,2RGC备方法细胞悬液的制备方法,3培养板、培养皿的处理,4培养基,5培养方法,6RGC的鉴定方法,7RGC的纯化,8展望,参考文献:
关键词: 视网膜神经节细胞; 细胞,培养的视网膜神经节细胞(RGC)是视网膜的第三级神经元,在视觉通路中起着重要的传导作用。许多眼科疾病(如视神经病、青光眼等)可导致RGC损伤、变性和凋亡,最终引起视功能丧失,因此保持或促进RGC存活及轴突生长对视功能的维持至关重要，目前国内外学者都在努力探寻体外培养RGC的最有效方法。笔者就RGC的培养、分离、鉴定、纯化等方法的研究进展作一综述。
1 材料来源
由于成年RGC体外培养不易存活,目前多数学者采用胚胎期或生后<1周的大鼠进行RGC培养[13],来源方便且经济。Sernagor等发现,采用生后3～5 d大鼠的RGC培养成活率低,因此建议用胚胎期、生后早期或成年动物来进行RGC培养[4]。另外，有色素鼠在分离时因有色素背景而使视网膜容易辨认;相反，白化鼠则较难分辨且有视觉缺陷,因此有学者建议以有色素鼠作为RGC材料来源更佳[5]。最近有报道以大鼠RGC细胞株(RGC5)进行神经毒理学方面研究,但RTPCR分析表明,该细胞株源于整个视网膜而非单独的RGC,进一步研究发现此细胞株无法产生正常RGC的电压门控电流[68]。因此，RGC5作为RGC的代用品尚需进一步研究证实。
2 RGC备方法细胞悬液的制备方法
将视网膜结缔组织分散成细胞团或单个细胞,有以下方法:(1)机械分散法：剪刀剪切后用吸管反复吹打分散组织细胞,或将组织放在注射器内通过针头压出。具体操作如下：首先将组织用Hank’s液或无血清培养液漂洗,然后将其剪成5～10 mm×5～10 mm×5～10 mm小块,置入50目孔径不锈钢筛中，把筛网放在培养皿中，再用注射器针芯轻轻压挤组织,使之穿过纱网,然后用吸管从培养皿中吸出组织悬液,置入200目筛中重复上述操作。最后将上述细胞悬液置于显微镜下计算细胞数,再接种培养,如细胞团块过大,可用400目筛再过滤一次。该方法对组织损伤较大。Hayashida等在不用蛋白水解酶的条件下,先在低Ca2+溶液中孵育眼球壁，后用滤膜剥或刀片切,再置于低Ca2+溶液中孵育一次,最后经研磨,可将鱼和鼠的视网膜细胞离解[9]。(2)酶消化法：目前较常采用该法。它是将视网膜结缔组织完全消化成为细胞悬液。具体操作如下:组织剪碎后加008%胰蛋白酶消化15～20 min,然后加含小牛血清的DMEM培养液终止消化,后离心、弃上清,加完全培养液充分吹打成单细胞悬液即可[2]。Yasumasa等用15 U/mL木瓜蛋白酶和70 U/mL胶原酶37 ℃消化30 min,证实效果良好[10] ......
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