中药对原发性肝癌细胞凋亡的影响的研究进展
关键词：原发性肝癌/中药实验研究； 细胞凋亡
凋亡(apoptosis)一词由Kerr于1972年首先提出。细胞凋亡是指在特定时空发生的、受机体严密调控的细胞自杀现象，它呈现其独特的、有别于细胞坏死的形态学和生物化学特点，被普遍认为是有机体维持个体内稳态恒定的极其重要的机制之一。它与有丝分裂相反而又互补，并共同参与调控细胞群落，细胞数量的恒定，其调控机制的失常是包括肿瘤在内的一系列疾病的产生根源。因此细胞凋亡已成为当今细胞生物学尤其是肿瘤学基础与临床研究的前沿与热点。近年来，有关中药诱导肝癌细胞凋亡的研究报道逐年增多。1994年，日本的Yano等[1]首先报道中药小柴胡汤具有诱导人肝细胞癌细胞系KIMI1凋亡的作用，此后，国内也陆续开展此类研究，其中既有使用中药有效成分，也有使用中药复方诱导肝癌细胞凋亡的报道。
1 对细胞形态的影响
凋亡一词描述的是伴随细胞死亡出现的一系列特征性的形态学改变，即是一个形态学改变，迄今，形态学特征依然是凋亡最可靠的指标，同时在凋亡细胞，由于凋亡性核酸内切酶的活化，常可见到双链DNA的于核小体之间断裂，形成小到180~200 bp的碎片，并在凝胶电泳带上呈现典型的梯形改变，绝大多数发生凋亡的细胞都能检测到这一特征性改变，因此DNA梯被广泛作为区别坏死和凋亡的有效指标。孙震晓等[2]研究去甲斑蝥素作用细胞24 h后，部分细胞出现固缩，细胞质膜突起，核染色质异常凝集等，并伴有膜包被的凋亡小体的形成；DNA琼脂糖凝胶电泳显示，处理部分细胞的DNA降解成200 bp为基数的DNA片段，呈现典型的“梯状”带纹，邸雅南等[3]采用透射电镜及琼脂糖凝胶电泳观察刺五加叶皂苷作用肝资细胞凋亡的形态学改变和DNA电泳，见肝癌细胞出现异染色体边集，线粒体肿胀等凋亡改变，DNA出现典型梯状改变，刺五加叶皂苷促进体外培养肝癌细胞凋亡的程度随着时间的增加和剂量加大而增高[3]。赵建高等采用透射电子显微镜观察华蟾精作用后培养的SMMC7721及HL60细胞超微结构的改变，观察显示华谵毒精作用后，可见成片的细胞坏死，细胞凋亡，内质网肿胀，线粒体肿大呈空泡样，溶酶体增多等细胞结构改变[4]。电镜观察榄香烯、康莱特、大蒜素等透导人肝癌细胞凋亡作用，也可见典型的凋亡形态学变化[5~7]。当归、川芎的有效成分阿魏酸钠作用与人EBL7404肝癌细胞后，肝癌细胞DNA琼脂糖凝胶电脉呈梯形表达[8]。在对中药复方的研究中，通过血清药理学方法，动物实验等手段证实多种中药复方具有诱导肝癌细胞凋亡的作用，张天娥等[9]以中药复方鹤莲克癌灵(仙鹤草、半枝莲等)灌胃荷H22肝癌小鼠，然后对肿瘤细胞进行流式细胞术分析，结果灌胃鹤莲克癌灵组S期细胞明显减少，百分离下降，而G1期细胞显著增加，在DNA直方图上G1峰前出现明显的细胞凋亡峰。韩克起等[10]用大鼠移植性肝癌模型研究扶正抗癌方(西洋参、穿山甲、石见穿、龙葵等)对瘤组织的影响，使用扶正抗癌方后，透射电镜下见瘤呈现凋亡征象。
2 对细胞周期的影响
左云飞等[11]利用流式细胞术研究榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系HcaF25/CL16A3的抗肿瘤作用，发现榄香烯对HcaF25/CL16A3的G0/G1期细胞无明显作用，主要作用于S期，阻止由S期进入G3/M期从而抑制肿瘤生长，并在G0/G1S期进入S期[5]。冯学梅等[12]探讨了刺五加叶皂苷诱导肝癌细胞凋亡的作用，给BABL/C小鼠腹腔内注射HepG2肝癌细胞，10 d后给予刺五加叶皂苷腹腔注射，8周后处死实验动物，流式细胞仪检测，移植肝癌组织凋亡小体百分率，结果当刺五加叶皂苷剂量为0.25 mg/kg时，凋亡小体百分率分别为(20.6±3.9)%、(31.1±7.8)%，提示刺五加叶皂苷促进肝癌细胞凋亡。司维柯等[13]观察了苦参碱诱导人肝癌细胞凋亡时G1细胞周围调节因子的变化，结果发现用药后细胞周期负调控因子P53，Rb，P27，P16表达增强，正调控因子细胞周期数(cyclin)D1表达减弱，说明苦参碱诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的机制可能与苦参碱上调G1细胞周期负调节因子的表达，下调G1期正调节因子cyclinD1表达有关。
3 对癌基因的影响
自Vaux于1988年发现原癌基因bc1-2与细胞凋亡密切相关以来，资基因与凋亡的关系成为近年来研究的一大热点，几种癌基因和抑制基因产物，如：bcl-2，C-myc，p53，H-ras等已证实参与对细胞凋亡的调控，其中bcl-2是迄今研究的最深入、广泛的调控基因之一。陈洪等[14]研究了三氧化二砷的抗癌作用，发现三氧化二砷对肝癌荷瘤具有抑制和生命延长作用，其机制主要是诱导肝癌BEL7402细胞凋亡的机制，显示诱导凋亡过程伴随bcl-2表达的减弱[2]。其他诱导凋亡机制发现，大蒜素抑制肝癌抑制肝癌细胞生长，促使其凋亡的途径之一是通过抑制肝癌细胞上皮生长因子受体(EGRF)表达作用而实现的[15]。目前认为，p53在基因组监控和DNA修复系统中具有重要作用。在基因组损伤是p53阻止细胞进入S期，并上调p53蛋白的表达，提示上调p53蛋白表达可能为健脾理气药诱导肝癌细胞凋亡的分子机制之一[16]。中药复方AC960(莪术、白术、苦参、白花蛇舌草等)具有显著抑制SMMC77721细胞增殖和促进细胞凋亡作用，AC960处理后p53蛋白的表达增强，bcl-2蛋白表达降低[17]。当归补血汤(黄芪、当归则是通过抑制脾细胞凋亡、增加淋巴细胞免疫活性抑制小鼠肝癌HcaF25/CL16A3淋巴结转移率和淋巴转移程度[18]。
4 展望
近年来，随着研究工作的不断深入，对细胞凋亡的认识取得了令人瞩目的进展，细胞凋亡的研究为肿瘤的治疗提供了新的思路和靶点，人们已经认识到诱导肿瘤细胞很可能是肿瘤治疗的一个新策略。但是目前人们对细胞凋亡的概念，生化机制、生理病理意义乃至生命科学中的应用等诸多方面的认识尚处于初级阶段，不仅尚有许多有待开拓的领域，而且在已涉及的领域中还有很多问题没有得到很好的解决。如对细胞凋亡发生的确切机制尚不完全清楚等。从细胞凋亡这一新视觉来看中医药作用，对于从分子水平揭示中药的作用机制，筛选新的抗癌中药具有十分重要意义。重要与细胞凋亡关系的研究已经取得了一些成绩，含砷类中药治疗恶性血液病的成功经验为应用凋亡关系研究领域，相关中医基础理论研究明显滞后与中药作用机制研究，目前主要限于运用现代医学手段检测某些中药或方剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，而缺乏对相应中医理论的探讨。因此如何将传统中医基础理论与现代分子生物学有机的结合，把握好抽象与具体、宏观与微观、整体与局部的关系，开展中药分子生物学的研究对中医要现代化研究具有十分重要的意义。例如，肝癌患者的证型、体质特征与肝癌细胞凋亡之间有何联系？与肝癌细胞增殖、转移等又有何联系？如何以中医理论为指导，实现对这些环节的干预，从而有效的防治肝癌将是中医药防治肝癌研究的重要方向之一，我们有理由相信随着研究的进一步深化，中医药在诱导肿瘤细胞凋亡领域，不仅在血液病，而且在实体瘤治疗以及其它方面都具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1] YanoH,MizoguchiA,FukudaK.etal.The herbel medicine sho saikoto inbibit sprolifertion of cancer celline by inducing apoplosis and arrest at the G0/G1 phase[J].cancer Res .1994,54(2):448.
[2] 孙霞晓，赵天得，魏育林，等.去甲斑蝥素诱导人肝癌细胞的影响[J].临床肝胆病杂志，1999，30(1)：65.
[3] 邸雅南，叶红军，王陆黎，等.刺五加叶皂苷对肝癌细胞的影响[J].临床肝胆病杂志，2000，6(2)：104.
[4] 赵建斌，崔 勤，张 雪，等.华蟾毒精抗癌作用的体外研究[J].第四军医大学学报，2001，22(16)：1504.
[5] 徐学军，周子成，罗元辉，等.β-榄香烯诱导人肝癌细胞珠SMMC7721凋亡的研究[J].第三军医大学学报，1999，21(4)：268.
[6] 刘剑伦，埃高莫·比佐，韦长元，等.康莱注射液诱导人肝癌细胞凋亡的研究[J].实用癌症杂志，2001，16(4)：343.
[7] 邵红莲，辛 华，翟玉梅，等.大蒜素诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡[J].解剖学报，2001，32(3)：290.
[8] 朱秀琴，王国申，张学军，等.中药阿魏酸钠对人肝癌细胞生存性及凋亡的影响[J].世界华人消化杂志，1999，7(8)：715.
[9] 张天娥，骆永珍，闫志勇.鹤莲克癌灵对肝癌H22细胞周期及细胞凋亡的影响[J].成都中医药大学学报，1999，9(5)：25.
[10] 韩克起，黄传继.扶正抗癌方对大鼠移植性肝癌病理形态及超微结构的影响[J].中西医结合肝病杂志，1999，9(5)：25.
[11] 左云飞，张耀铮，郑 军.利用流式细胞术研究缆香烯对肝癌腹水瘤细胞系HcaF25/GL16A3的抗肿瘤作用[J].大连医科大学学报，2000，22(1)：46.
[12] 冯雪梅，叶红军，韩登春，等.刺五加叶皂苷对动物实验性肝癌抑制作用的研究[J].中国老年学杂志，1999，19(5)：298.
[13] 司维柯，高利红，刘 斌，等.苦参碱诱导人肝癌细胞分化、凋亡时对G2细胞周期调节因子的调控[J].癌症，2001，20(8)：848.
[14] 陈 洪，秦叔逵，潘麒声，等.三氧化二砷抗肝癌作用的实验研究[J].中华肝脏病杂志，2000，8(1)：27.
[15] 高艳景，袁孟彪，辛 华，等.大蒜素抑制EGF上调人肝癌细胞中EGFR表达的研究[J].中华肝脏病杂志，2000，24(3)：231.
[16] 杨 雁，陈敏珠.黄芪总苷对肝癌细胞wt p53基因表达的影响[J].中国药理学通报，2001，17(4)：447.
[17] 郭伟剑，于尔辛，郑颂国，等.健脾不景气药诱导人肝癌细胞p21ras、bcl-2、p53基因表达调控作用的研究[J].中国中医药科技，2000，8(1)：52.
[18] 王昌俊，陈 伟，钱伯文.中药复方AC960对人肝癌细胞p21ras、bcl-2、 p53基因表达调控作用的研究[J].中国中医药科技，2000，7(1)：10
(湖北民族学院医学院附属医院，湖北 恩施 445000), 百拇医药(赵明敬)
凋亡(apoptosis)一词由Kerr于1972年首先提出。细胞凋亡是指在特定时空发生的、受机体严密调控的细胞自杀现象，它呈现其独特的、有别于细胞坏死的形态学和生物化学特点，被普遍认为是有机体维持个体内稳态恒定的极其重要的机制之一。它与有丝分裂相反而又互补，并共同参与调控细胞群落，细胞数量的恒定，其调控机制的失常是包括肿瘤在内的一系列疾病的产生根源。因此细胞凋亡已成为当今细胞生物学尤其是肿瘤学基础与临床研究的前沿与热点。近年来，有关中药诱导肝癌细胞凋亡的研究报道逐年增多。1994年，日本的Yano等[1]首先报道中药小柴胡汤具有诱导人肝细胞癌细胞系KIMI1凋亡的作用，此后，国内也陆续开展此类研究，其中既有使用中药有效成分，也有使用中药复方诱导肝癌细胞凋亡的报道。
1 对细胞形态的影响
凋亡一词描述的是伴随细胞死亡出现的一系列特征性的形态学改变，即是一个形态学改变，迄今，形态学特征依然是凋亡最可靠的指标，同时在凋亡细胞，由于凋亡性核酸内切酶的活化，常可见到双链DNA的于核小体之间断裂，形成小到180~200 bp的碎片，并在凝胶电泳带上呈现典型的梯形改变，绝大多数发生凋亡的细胞都能检测到这一特征性改变，因此DNA梯被广泛作为区别坏死和凋亡的有效指标。孙震晓等[2]研究去甲斑蝥素作用细胞24 h后，部分细胞出现固缩，细胞质膜突起，核染色质异常凝集等，并伴有膜包被的凋亡小体的形成；DNA琼脂糖凝胶电泳显示，处理部分细胞的DNA降解成200 bp为基数的DNA片段，呈现典型的“梯状”带纹，邸雅南等[3]采用透射电镜及琼脂糖凝胶电泳观察刺五加叶皂苷作用肝资细胞凋亡的形态学改变和DNA电泳，见肝癌细胞出现异染色体边集，线粒体肿胀等凋亡改变，DNA出现典型梯状改变，刺五加叶皂苷促进体外培养肝癌细胞凋亡的程度随着时间的增加和剂量加大而增高[3]。赵建高等采用透射电子显微镜观察华蟾精作用后培养的SMMC7721及HL60细胞超微结构的改变，观察显示华谵毒精作用后，可见成片的细胞坏死，细胞凋亡，内质网肿胀，线粒体肿大呈空泡样，溶酶体增多等细胞结构改变[4]。电镜观察榄香烯、康莱特、大蒜素等透导人肝癌细胞凋亡作用，也可见典型的凋亡形态学变化[5~7]。当归、川芎的有效成分阿魏酸钠作用与人EBL7404肝癌细胞后，肝癌细胞DNA琼脂糖凝胶电脉呈梯形表达[8]。在对中药复方的研究中，通过血清药理学方法，动物实验等手段证实多种中药复方具有诱导肝癌细胞凋亡的作用，张天娥等[9]以中药复方鹤莲克癌灵(仙鹤草、半枝莲等)灌胃荷H22肝癌小鼠，然后对肿瘤细胞进行流式细胞术分析，结果灌胃鹤莲克癌灵组S期细胞明显减少，百分离下降，而G1期细胞显著增加，在DNA直方图上G1峰前出现明显的细胞凋亡峰。韩克起等[10]用大鼠移植性肝癌模型研究扶正抗癌方(西洋参、穿山甲、石见穿、龙葵等)对瘤组织的影响，使用扶正抗癌方后，透射电镜下见瘤呈现凋亡征象。
2 对细胞周期的影响
左云飞等[11]利用流式细胞术研究榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系HcaF25/CL16A3的抗肿瘤作用，发现榄香烯对HcaF25/CL16A3的G0/G1期细胞无明显作用，主要作用于S期，阻止由S期进入G3/M期从而抑制肿瘤生长，并在G0/G1S期进入S期[5]。冯学梅等[12]探讨了刺五加叶皂苷诱导肝癌细胞凋亡的作用，给BABL/C小鼠腹腔内注射HepG2肝癌细胞，10 d后给予刺五加叶皂苷腹腔注射，8周后处死实验动物，流式细胞仪检测，移植肝癌组织凋亡小体百分率，结果当刺五加叶皂苷剂量为0.25 mg/kg时，凋亡小体百分率分别为(20.6±3.9)%、(31.1±7.8)%，提示刺五加叶皂苷促进肝癌细胞凋亡。司维柯等[13]观察了苦参碱诱导人肝癌细胞凋亡时G1细胞周围调节因子的变化，结果发现用药后细胞周期负调控因子P53，Rb，P27，P16表达增强，正调控因子细胞周期数(cyclin)D1表达减弱，说明苦参碱诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的机制可能与苦参碱上调G1细胞周期负调节因子的表达，下调G1期正调节因子cyclinD1表达有关。
3 对癌基因的影响
自Vaux于1988年发现原癌基因bc1-2与细胞凋亡密切相关以来，资基因与凋亡的关系成为近年来研究的一大热点，几种癌基因和抑制基因产物，如：bcl-2，C-myc，p53，H-ras等已证实参与对细胞凋亡的调控，其中bcl-2是迄今研究的最深入、广泛的调控基因之一。陈洪等[14]研究了三氧化二砷的抗癌作用，发现三氧化二砷对肝癌荷瘤具有抑制和生命延长作用，其机制主要是诱导肝癌BEL7402细胞凋亡的机制，显示诱导凋亡过程伴随bcl-2表达的减弱[2]。其他诱导凋亡机制发现，大蒜素抑制肝癌抑制肝癌细胞生长，促使其凋亡的途径之一是通过抑制肝癌细胞上皮生长因子受体(EGRF)表达作用而实现的[15]。目前认为，p53在基因组监控和DNA修复系统中具有重要作用。在基因组损伤是p53阻止细胞进入S期，并上调p53蛋白的表达，提示上调p53蛋白表达可能为健脾理气药诱导肝癌细胞凋亡的分子机制之一[16]。中药复方AC960(莪术、白术、苦参、白花蛇舌草等)具有显著抑制SMMC77721细胞增殖和促进细胞凋亡作用，AC960处理后p53蛋白的表达增强，bcl-2蛋白表达降低[17]。当归补血汤(黄芪、当归则是通过抑制脾细胞凋亡、增加淋巴细胞免疫活性抑制小鼠肝癌HcaF25/CL16A3淋巴结转移率和淋巴转移程度[18]。
4 展望
近年来，随着研究工作的不断深入，对细胞凋亡的认识取得了令人瞩目的进展，细胞凋亡的研究为肿瘤的治疗提供了新的思路和靶点，人们已经认识到诱导肿瘤细胞很可能是肿瘤治疗的一个新策略。但是目前人们对细胞凋亡的概念，生化机制、生理病理意义乃至生命科学中的应用等诸多方面的认识尚处于初级阶段，不仅尚有许多有待开拓的领域，而且在已涉及的领域中还有很多问题没有得到很好的解决。如对细胞凋亡发生的确切机制尚不完全清楚等。从细胞凋亡这一新视觉来看中医药作用，对于从分子水平揭示中药的作用机制，筛选新的抗癌中药具有十分重要意义。重要与细胞凋亡关系的研究已经取得了一些成绩，含砷类中药治疗恶性血液病的成功经验为应用凋亡关系研究领域，相关中医基础理论研究明显滞后与中药作用机制研究，目前主要限于运用现代医学手段检测某些中药或方剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，而缺乏对相应中医理论的探讨。因此如何将传统中医基础理论与现代分子生物学有机的结合，把握好抽象与具体、宏观与微观、整体与局部的关系，开展中药分子生物学的研究对中医要现代化研究具有十分重要的意义。例如，肝癌患者的证型、体质特征与肝癌细胞凋亡之间有何联系？与肝癌细胞增殖、转移等又有何联系？如何以中医理论为指导，实现对这些环节的干预，从而有效的防治肝癌将是中医药防治肝癌研究的重要方向之一，我们有理由相信随着研究的进一步深化，中医药在诱导肿瘤细胞凋亡领域，不仅在血液病，而且在实体瘤治疗以及其它方面都具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1] YanoH,MizoguchiA,FukudaK.etal.The herbel medicine sho saikoto inbibit sprolifertion of cancer celline by inducing apoplosis and arrest at the G0/G1 phase[J].cancer Res .1994,54(2):448.
[2] 孙霞晓，赵天得，魏育林，等.去甲斑蝥素诱导人肝癌细胞的影响[J].临床肝胆病杂志，1999，30(1)：65.
[3] 邸雅南，叶红军，王陆黎，等.刺五加叶皂苷对肝癌细胞的影响[J].临床肝胆病杂志，2000，6(2)：104.
[4] 赵建斌，崔 勤，张 雪，等.华蟾毒精抗癌作用的体外研究[J].第四军医大学学报，2001，22(16)：1504.
[5] 徐学军，周子成，罗元辉，等.β-榄香烯诱导人肝癌细胞珠SMMC7721凋亡的研究[J].第三军医大学学报，1999，21(4)：268.
[6] 刘剑伦，埃高莫·比佐，韦长元，等.康莱注射液诱导人肝癌细胞凋亡的研究[J].实用癌症杂志，2001，16(4)：343.
[7] 邵红莲，辛 华，翟玉梅，等.大蒜素诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡[J].解剖学报，2001，32(3)：290.
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[9] 张天娥，骆永珍，闫志勇.鹤莲克癌灵对肝癌H22细胞周期及细胞凋亡的影响[J].成都中医药大学学报，1999，9(5)：25.
[10] 韩克起，黄传继.扶正抗癌方对大鼠移植性肝癌病理形态及超微结构的影响[J].中西医结合肝病杂志，1999，9(5)：25.
[11] 左云飞，张耀铮，郑 军.利用流式细胞术研究缆香烯对肝癌腹水瘤细胞系HcaF25/GL16A3的抗肿瘤作用[J].大连医科大学学报，2000，22(1)：46.
[12] 冯雪梅，叶红军，韩登春，等.刺五加叶皂苷对动物实验性肝癌抑制作用的研究[J].中国老年学杂志，1999，19(5)：298.
[13] 司维柯，高利红，刘 斌，等.苦参碱诱导人肝癌细胞分化、凋亡时对G2细胞周期调节因子的调控[J].癌症，2001，20(8)：848.
[14] 陈 洪，秦叔逵，潘麒声，等.三氧化二砷抗肝癌作用的实验研究[J].中华肝脏病杂志，2000，8(1)：27.
[15] 高艳景，袁孟彪，辛 华，等.大蒜素抑制EGF上调人肝癌细胞中EGFR表达的研究[J].中华肝脏病杂志，2000，24(3)：231.
[16] 杨 雁，陈敏珠.黄芪总苷对肝癌细胞wt p53基因表达的影响[J].中国药理学通报，2001，17(4)：447.
[17] 郭伟剑，于尔辛，郑颂国，等.健脾不景气药诱导人肝癌细胞p21ras、bcl-2、p53基因表达调控作用的研究[J].中国中医药科技，2000，8(1)：52.
[18] 王昌俊，陈 伟，钱伯文.中药复方AC960对人肝癌细胞p21ras、bcl-2、 p53基因表达调控作用的研究[J].中国中医药科技，2000，7(1)：10
(湖北民族学院医学院附属医院，湖北 恩施 445000), 百拇医药(赵明敬)