艰难梭菌细胞毒素B功能区的表达
【关键词】 艰难梭菌，细胞毒素B；克隆，分子；基因表达
1材料和方法
1.1材料限制性核酸内切酶，T4DNAligase购自New England Biolab公司. 厌氧发生剂、脑心浸液(干粉)购自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他试剂为国产分析纯. 艰难梭菌(clostridium difficile, C.d VPI10463)从兰州生物制品研究所购买. 大肠杆菌菌株BL21(DE3)及质粒PET22b(+)系南方医科大学消化研究所存.
1.2方法
1.2.1目的基因的获得C.d VPI 10463接种于脑心浸液(BHI)培养基中，37℃厌氧环境中透析培养72 h. 碱裂解法提取C.d基因组DNA. 参考Gene bank收录的C.d VPI 10463基因序列，设计引物如：sense: 5′TCCGAATTCG CTTATGTCAACTAGTGAA3′ EcoRI, antisense: 5′GCACTCGAGTTCACTAATCACTAATTG3′， XhoI. 反应条件：50 μL反应体系，热启动法，94℃变性45 s, 60℃退火60 s, 72℃延伸150 s, 39个循环后再延伸10 min. 10 g/L糖凝胶电泳观察扩增结果.
1.2.2重组质粒的构建与鉴定将酶切、纯化的目的基因、质粒PET22b(+)按10∶1(摩尔数) 在T4DNAligase作用下16℃连接12 h. 热休克法转化. 挑单个菌落，接种在选择性LB液体培养基中，A600 nm值达0.6，提取重组质粒. 重组质粒的鉴定：用EcoRI与XhoI双酶切鉴定；以重组质粒为模板，进行PCR反应，送上海博亚公司测序.
1.2.3目的基因表达阳性克隆菌落接种到2 mL选择性LB培养液37℃, 180 r摇菌致A600 nm为0.6，4℃过夜，然后2%转接LB培养液中，培养3 h至A600 nm值为0.8，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导后取样. 产物进行SDSPAGE分析.
2结果
2.1PCR扩增的目的基因电泳分析发现在1800 bp左右有一条带，大小与预计相符(图1).
图1琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物 略
2.2重组质粒的鉴定将获得重组质粒命名为PET22b(+)CDB3，电泳初步鉴定结果与预期相符(图2). 直接以PET22b(+)CDB3为模板进行测序,得到的DNA序列，与Gene bank记录的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%.
图2目的基因的PCR产物、重组质粒和PET22b(+)载体用EcoRI单酶切的图谱 略
2.3重组蛋白的诱导表达经IPTG诱导后,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有PET22b(+)CDB3宿主菌表达出Mr约为71.3×103，与预期的蛋白大小相符，含质粒pET 22b(+)及无质粒的细菌则无此特异条带. 在A600 nm值为0.8，IPTG终浓度为1 mmol/L，诱导4 h时，重组蛋白的表达量最大，以可溶性蛋白为主，便于纯化. 凝胶自动扫描分析,其PET22b(+)CDB3重组蛋白占细菌周质总蛋白的34%,可溶性表达占上清的22.7%，包涵体占沉淀的25.7% (图3).
图3CDB3基因诱导表达产物的SDSPAGE分析 略
3讨论
C.d是肠道感染中仅次于弯曲杆菌的常见致病菌，产生的毒素A与毒素B对人体造成危害，被公认为发达国家中最重要的院内感染源之一[1]. 虽然口服甲硝唑或万古霉素治疗可取得较好的疗效，但目前已存在耐药及停药后复发等问题. 疫苗接种可使高危人群获得持久和较强的免疫力，是预防与控制感染的有效措施[2]. C.d重组抗原的研究已见较多的报道，但多数是集中在毒素A上[3]，而对毒素B的研究则相对较少. Genth等[4]的研究将毒素B分成3个氨基酸片段：CDB1(氨基酸1546)，CDB2(氨基酸 9011750)，CDB3(氨基酸17512366)，发现抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应，抗C.d抗体既与CDB1又能与CDB3 反应，CDB2则与两抗体均不反应. 说明CDB3是良好的抗原. 进一步实验发现，只有抗CDB3抗体才能保护完整细胞免受毒素B的细胞毒性，而抗CDB1抗体只有进入细胞内才能起保护作用 . 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白. 故选取了毒素B羧基末端CDB3 (氨基酸17512366)进行表达，为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础.
本研究参考C.d国际标准株VPI 10463基因序列，用自行设计的CDB3引物在PCR反应中表现出较高的特异性，为理想的引物序列. 在上、下游引物中分别加入EcoRI与XhoI酶切位点，保证了读码方向的正确性. 为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了末端带有His标签的融合表达载体，酶切鉴定和测序结果显示获得了带有特异的CDB3基因. 蛋白电泳分析表明获得了高效表达的C.d ToxinB3克隆株，本实验所表达的蛋白，与该基因编码的蛋白的分子质量大小是一致的，更进一步验证了克隆的目的基因的正确性. 因此,本研究为研制C.d重组疫苗及制备诊断试剂 奠定了一定的基础.
【参考文献】
[1]Bartlett JG. Clinical practice. Antibioticassociated diarrhea[J]. N Engl J Med, 2002,346(5):334-339.
[2]SougiltzisS, KyneL, DrudyD, et al. Clostridium difficile toxoid vaccine in recurrent C.difficile associated diarrhea[J].Gastroeterology,2005,128(3):764-770.
[3]Ward SJ, Douce G, Figueiredo D, et al. Immunogenicity of a salmonella typhimurium aroA aroD vaccine expressing a nontoxic domain of Clostridium difficile toxin A[J]. Infect Immun, 1999, 67(5):2145-2152.
[4]Genth H, Selzer J, Busch C, et al. New method to generate enzymatically deficient clostridium difficile toxin B as an antigen for immunization[J]. Infect Immun, 2000, 68(3): 1094-1101.
通讯作者：姜泊.Tel:(020)61641541Email: Drjiang@163.com
作者简介：刘红升. 博士生(导师张清华),主治医师. Tel: (010)66799159Email:liuhs325@163.com
1解放军305医院老年病中心，北京 100017， 2南方医科大学南方医院消化病研究所，广东 广州 510515
编辑井晓梅, http://www.100md.com(刘红升1，张清华1，姜泊2，蒋知新1)
1材料和方法
1.1材料限制性核酸内切酶，T4DNAligase购自New England Biolab公司. 厌氧发生剂、脑心浸液(干粉)购自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他试剂为国产分析纯. 艰难梭菌(clostridium difficile, C.d VPI10463)从兰州生物制品研究所购买. 大肠杆菌菌株BL21(DE3)及质粒PET22b(+)系南方医科大学消化研究所存.
1.2方法
1.2.1目的基因的获得C.d VPI 10463接种于脑心浸液(BHI)培养基中，37℃厌氧环境中透析培养72 h. 碱裂解法提取C.d基因组DNA. 参考Gene bank收录的C.d VPI 10463基因序列，设计引物如：sense: 5′TCCGAATTCG CTTATGTCAACTAGTGAA3′ EcoRI, antisense: 5′GCACTCGAGTTCACTAATCACTAATTG3′， XhoI. 反应条件：50 μL反应体系，热启动法，94℃变性45 s, 60℃退火60 s, 72℃延伸150 s, 39个循环后再延伸10 min. 10 g/L糖凝胶电泳观察扩增结果.
1.2.2重组质粒的构建与鉴定将酶切、纯化的目的基因、质粒PET22b(+)按10∶1(摩尔数) 在T4DNAligase作用下16℃连接12 h. 热休克法转化. 挑单个菌落，接种在选择性LB液体培养基中，A600 nm值达0.6，提取重组质粒. 重组质粒的鉴定：用EcoRI与XhoI双酶切鉴定；以重组质粒为模板，进行PCR反应，送上海博亚公司测序.
1.2.3目的基因表达阳性克隆菌落接种到2 mL选择性LB培养液37℃, 180 r摇菌致A600 nm为0.6，4℃过夜，然后2%转接LB培养液中，培养3 h至A600 nm值为0.8，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导后取样. 产物进行SDSPAGE分析.
2结果
2.1PCR扩增的目的基因电泳分析发现在1800 bp左右有一条带，大小与预计相符(图1).
图1琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物 略
2.2重组质粒的鉴定将获得重组质粒命名为PET22b(+)CDB3，电泳初步鉴定结果与预期相符(图2). 直接以PET22b(+)CDB3为模板进行测序,得到的DNA序列，与Gene bank记录的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%.
图2目的基因的PCR产物、重组质粒和PET22b(+)载体用EcoRI单酶切的图谱 略
2.3重组蛋白的诱导表达经IPTG诱导后,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有PET22b(+)CDB3宿主菌表达出Mr约为71.3×103，与预期的蛋白大小相符，含质粒pET 22b(+)及无质粒的细菌则无此特异条带. 在A600 nm值为0.8，IPTG终浓度为1 mmol/L，诱导4 h时，重组蛋白的表达量最大，以可溶性蛋白为主，便于纯化. 凝胶自动扫描分析,其PET22b(+)CDB3重组蛋白占细菌周质总蛋白的34%,可溶性表达占上清的22.7%，包涵体占沉淀的25.7% (图3).
图3CDB3基因诱导表达产物的SDSPAGE分析 略
3讨论
C.d是肠道感染中仅次于弯曲杆菌的常见致病菌，产生的毒素A与毒素B对人体造成危害，被公认为发达国家中最重要的院内感染源之一[1]. 虽然口服甲硝唑或万古霉素治疗可取得较好的疗效，但目前已存在耐药及停药后复发等问题. 疫苗接种可使高危人群获得持久和较强的免疫力，是预防与控制感染的有效措施[2]. C.d重组抗原的研究已见较多的报道，但多数是集中在毒素A上[3]，而对毒素B的研究则相对较少. Genth等[4]的研究将毒素B分成3个氨基酸片段：CDB1(氨基酸1546)，CDB2(氨基酸 9011750)，CDB3(氨基酸17512366)，发现抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应，抗C.d抗体既与CDB1又能与CDB3 反应，CDB2则与两抗体均不反应. 说明CDB3是良好的抗原. 进一步实验发现，只有抗CDB3抗体才能保护完整细胞免受毒素B的细胞毒性，而抗CDB1抗体只有进入细胞内才能起保护作用 . 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白. 故选取了毒素B羧基末端CDB3 (氨基酸17512366)进行表达，为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础.
本研究参考C.d国际标准株VPI 10463基因序列，用自行设计的CDB3引物在PCR反应中表现出较高的特异性，为理想的引物序列. 在上、下游引物中分别加入EcoRI与XhoI酶切位点，保证了读码方向的正确性. 为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了末端带有His标签的融合表达载体，酶切鉴定和测序结果显示获得了带有特异的CDB3基因. 蛋白电泳分析表明获得了高效表达的C.d ToxinB3克隆株，本实验所表达的蛋白，与该基因编码的蛋白的分子质量大小是一致的，更进一步验证了克隆的目的基因的正确性. 因此,本研究为研制C.d重组疫苗及制备诊断试剂 奠定了一定的基础.
【参考文献】
[1]Bartlett JG. Clinical practice. Antibioticassociated diarrhea[J]. N Engl J Med, 2002,346(5):334-339.
[2]SougiltzisS, KyneL, DrudyD, et al. Clostridium difficile toxoid vaccine in recurrent C.difficile associated diarrhea[J].Gastroeterology,2005,128(3):764-770.
[3]Ward SJ, Douce G, Figueiredo D, et al. Immunogenicity of a salmonella typhimurium aroA aroD vaccine expressing a nontoxic domain of Clostridium difficile toxin A[J]. Infect Immun, 1999, 67(5):2145-2152.
[4]Genth H, Selzer J, Busch C, et al. New method to generate enzymatically deficient clostridium difficile toxin B as an antigen for immunization[J]. Infect Immun, 2000, 68(3): 1094-1101.
通讯作者：姜泊.Tel:(020)61641541Email: Drjiang@163.com
作者简介：刘红升. 博士生(导师张清华),主治医师. Tel: (010)66799159Email:liuhs325@163.com
1解放军305医院老年病中心，北京 100017， 2南方医科大学南方医院消化病研究所，广东 广州 510515
编辑井晓梅, http://www.100md.com(刘红升1，张清华1，姜泊2，蒋知新1)