溶剂挥发法制备蛋白质药物微球须考虑全面
近年来，蛋白质药物已被广泛用于临床疾病的治疗，取得了很好的疗效。目前，此类药物临床应用的剂型主要是冻干粉针剂，由于蛋白质的半衰期短，注射频繁，令很多患者难以接受。减少注射次数，维持稳定的血药浓度，提高患者的顺应性是蛋白质药物应用的迫切需要。采用合适的可生物降解的高分子材料包封药物制成微球制剂，可以达到缓释的要求。溶剂挥发法是制备微球的常用方法之一，不但操作简便，且制备的微球性能相对较好。其影响因素包括微球的大小、溶剂的毒理性要求和残留量、药物的包封率和载药量、突释反应和释放时间、微球的形态、微球中蛋白质的活性等。充分考虑这些因素，则有助于研究人员制备出理想的蛋白质药物微球。
■提高药物的包封率和载药量
目前，大多学者认为用溶剂挥发法制备微球，药物在相间的渗透，是导致载药量和包封率低的主要原因。为了减少药物的丢失，研究人员从制备工艺和附加剂的选择等方面进行了摸索，取得了一定成效。
研究人员调节pH值接近蛋白质的等电点，采用β乳球蛋白(BLG)作为模型蛋白质,采用复乳化溶剂挥发法制备微球，结果发现微球中BLG的载药量取决于外水相的pH值，BLG的浓度对内外水相的蛋白质的分布没有影响。外水相的pH值越接近BLG的等电点，药物的包封率越高，在等电点时最高，大约60%左右，而其他pH值时药物的包封率在30%～50%之间。
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还有研究人员将外水相加盐，以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白质制备微球。结果发现外水相无盐时，微球的包封率小于20%；而加入5%的氯化钠，则可使其包封率提高到大于80%。
另有研究人员尝试在内水相和油相加入小分子有机物。在制备人绒毛膜促性腺激素(hCG)微球时，内水相加入20%甘油，油相加入40%丙酮，得到微球的包封率超过90%。
表面活性剂的增加也能够增加微球的载药量和包封率。有研究发现，BSA微球的载药量和包封率随吐温80的浓度增加而增加，但当其浓度超过0.1%时则影响不大，这可能是由于表面活性剂的添加，提高了主要乳液的稳定性，减少了二次乳化进入外水相的药物量。
此外，形成乳液的方法不同可导致微球的包封率不同。研究人员在用聚丙酯乙烯乙二醇(PELA)包封人血白蛋白时发现，涡旋比超声形成的初乳更稳定，包封率也较高。
, 百拇医药 由此可见，尽可能地减少内相药物的渗透，是提高载药量和包封率的最关键因素，但微球的性能还主要取决于释放性质和蛋白质药物活性的控制两大方面。
■考虑影响微球体外释放的因素
制备成功的微球应可以在设定的时间内保持较恒速的释放。一般来说，微球的释放有三相：突释相，主要由微球表面的药物溶出所致；缓慢释放相，是由药物通过微球孔道和高分子材料的降解释出药物来实现；最后一相主要是高分子材料降解，药物释出。
影响微球释放性质的因素很多。如微球粒径对释放的影响，粒径大的微球释放慢，粒径小的微球释放快。而粒径又受制备中的搅拌速度、表面活性剂、油相中多聚体的浓度、内水相的体积等多因素的影响。如国内研究人员以溶菌酶为模板蛋白研究微球释放时发现，内水相体积增加，会形成较多的内水相小液滴，附着在微球表面的小液滴就会越多，突释效应越突出。
微球的形态学也会影响其释放。制备的微球由于溶剂蒸发会留有孔道，这些孔道同时也是药物释出的通道，多孔药物就释放较快。调节孔的多少和大小，可调节药物的释放，主要从外水相的等电点、制备温度、内外水相加盐的影响、多聚体浓度的影响、多聚体的分子量、微球内孔壁结构对释放的影响等方面来进行。如国外研究人员发现，在等电点时制得的微球多孔，初始释放快；在低温时得到的微球含有无孔致密层，更多的药物渗入微球的较深隔层内，初始释放减少。
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此外，研究还发现，通过溶胀技术将胰岛素结合在丙烯酰羟乙基淀粉中，然后用聚丙交酯-乙交酯(PLGA)溶剂挥发法进行包封，微球的突释较低，且能持续释放，皮下给药可以抑制高血糖16天不复发。
■保持微球释出的蛋白质的活性
蛋白质为生物大分子，稳定性较差，物理化学性质容易遭到破坏，而使其部分或完全失去活性。蛋白质结构一旦遭到破坏，不仅会使药效下降，而且有可能在体内产生免疫原性和一些不良反应。在微球的制备过程中，往往需要搅拌、超声、使用有机溶剂，这些外界因素的干扰都可能影响蛋白质的结构，而使其发生聚集、吸附、沉淀、氧化、脱酰胺、水解等一系列物理或化学的改变。为了保持蛋白质的活性，研究人员做出了不少改进。
比如，加入了保护性添加剂。在蛋白质的制备中，加入一些其他物质，如蛋白质、多糖类、甘露醇等，可对包封蛋白起到一定的保护作用。国外研究人员在制备氨基酰脯胺酸酶微球时发现，同时加入0.5%的BSA和1.2毫摩尔浓度的MnCl2可较好的维持蛋白质的活性(BSA是一种有名的蛋白质保护剂，它可与酶竞争油水界面而发挥保护作用，MnCl2的加入稳固了它的这种作用)。在制备重组人生长激素(rhGH)微球时，加入了甘露醇和海藻糖，由于其优先水合的作用，制备初乳时可防止rhGH在油水界面的聚集，从而保护蛋白。此外，某些金属离子的加入对稳固某些蛋白质的活性也有帮助，如在制备神经生长因子(NGF)微球时，加入醋酸锌，由于锌离子与蛋白质的可逆结合，不仅可提高NGF的稳定性，而且不影响NGF的释放。
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多聚体的分子量也会影响蛋白质的活性，因此在选择高分子材料时应该考虑分子量对蛋白质活性的影响，而不应仅仅顾及微球的释放。在制备钩端螺旋体抗原(OMP)微球时，研究人员发现，PLA和PLGA分子量的增加可增加蛋白质药物的包封率，但却明显降低蛋白质的活性，这是由于分子量高的多聚体和蛋白质分子间有强烈的相互作用，可引起蛋白质结构的重组和凝聚的形成。
制备方法的影响也不容忽视。国内研究人员在制备胰岛素微球时发现，采用S/O/W法胰岛素以固体形式存在，比在双乳液法中溶解在内相水中的胰岛素向外相水溶液扩散的速度要慢得多，而且以固体形式存在的胰岛素与有机溶剂接触的面积也要小些,由此产生的胰岛素失活的量则相应减少。还有采用W1/O1/O2方法制备微球时发现，包封的蛋白质有70%～80%分散在或靠近微球表面，而W1/O/W2复乳化法得到的微球表面蛋白仅占20%～30%。蛋白分子位于表面更易受到如机械搅拌、接触有机溶剂等诸多不利的影响，从而导致蛋白质失活。
此外，某些表面活性剂对蛋白质有保护作用。PEG400可以修饰蛋白质的结构，使其稳定性增加。国外研究人员在包封重组干扰素时发现，PEG400可以使rhGH活性由修饰前的16%增加到超过50%。
研究人员通过控制制备工艺中的理化参数，选择添加剂来改善制得的微球的性质。但由于不同蛋白质物理化学性质差异较大，对一种蛋白质适合的理化条件、保护性添加剂，对其他蛋白质不一定适用。因此，在确定一种包封蛋白质药物后，具体的操作条件和辅料的选择等需要进行处方筛选。相信通过全面考虑和摸索，研究人员必定会制备出能满足临床需要的微球制剂。
(孙华燕徐风华), http://www.100md.com(孙华燕；徐风华)
■提高药物的包封率和载药量
目前，大多学者认为用溶剂挥发法制备微球，药物在相间的渗透，是导致载药量和包封率低的主要原因。为了减少药物的丢失，研究人员从制备工艺和附加剂的选择等方面进行了摸索，取得了一定成效。
研究人员调节pH值接近蛋白质的等电点，采用β乳球蛋白(BLG)作为模型蛋白质,采用复乳化溶剂挥发法制备微球，结果发现微球中BLG的载药量取决于外水相的pH值，BLG的浓度对内外水相的蛋白质的分布没有影响。外水相的pH值越接近BLG的等电点，药物的包封率越高，在等电点时最高，大约60%左右，而其他pH值时药物的包封率在30%～50%之间。
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还有研究人员将外水相加盐，以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白质制备微球。结果发现外水相无盐时，微球的包封率小于20%；而加入5%的氯化钠，则可使其包封率提高到大于80%。
另有研究人员尝试在内水相和油相加入小分子有机物。在制备人绒毛膜促性腺激素(hCG)微球时，内水相加入20%甘油，油相加入40%丙酮，得到微球的包封率超过90%。
表面活性剂的增加也能够增加微球的载药量和包封率。有研究发现，BSA微球的载药量和包封率随吐温80的浓度增加而增加，但当其浓度超过0.1%时则影响不大，这可能是由于表面活性剂的添加，提高了主要乳液的稳定性，减少了二次乳化进入外水相的药物量。
此外，形成乳液的方法不同可导致微球的包封率不同。研究人员在用聚丙酯乙烯乙二醇(PELA)包封人血白蛋白时发现，涡旋比超声形成的初乳更稳定，包封率也较高。
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■考虑影响微球体外释放的因素
制备成功的微球应可以在设定的时间内保持较恒速的释放。一般来说，微球的释放有三相：突释相，主要由微球表面的药物溶出所致；缓慢释放相，是由药物通过微球孔道和高分子材料的降解释出药物来实现；最后一相主要是高分子材料降解，药物释出。
影响微球释放性质的因素很多。如微球粒径对释放的影响，粒径大的微球释放慢，粒径小的微球释放快。而粒径又受制备中的搅拌速度、表面活性剂、油相中多聚体的浓度、内水相的体积等多因素的影响。如国内研究人员以溶菌酶为模板蛋白研究微球释放时发现，内水相体积增加，会形成较多的内水相小液滴，附着在微球表面的小液滴就会越多，突释效应越突出。
微球的形态学也会影响其释放。制备的微球由于溶剂蒸发会留有孔道，这些孔道同时也是药物释出的通道，多孔药物就释放较快。调节孔的多少和大小，可调节药物的释放，主要从外水相的等电点、制备温度、内外水相加盐的影响、多聚体浓度的影响、多聚体的分子量、微球内孔壁结构对释放的影响等方面来进行。如国外研究人员发现，在等电点时制得的微球多孔，初始释放快；在低温时得到的微球含有无孔致密层，更多的药物渗入微球的较深隔层内，初始释放减少。
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此外，研究还发现，通过溶胀技术将胰岛素结合在丙烯酰羟乙基淀粉中，然后用聚丙交酯-乙交酯(PLGA)溶剂挥发法进行包封，微球的突释较低，且能持续释放，皮下给药可以抑制高血糖16天不复发。
■保持微球释出的蛋白质的活性
蛋白质为生物大分子，稳定性较差，物理化学性质容易遭到破坏，而使其部分或完全失去活性。蛋白质结构一旦遭到破坏，不仅会使药效下降，而且有可能在体内产生免疫原性和一些不良反应。在微球的制备过程中，往往需要搅拌、超声、使用有机溶剂，这些外界因素的干扰都可能影响蛋白质的结构，而使其发生聚集、吸附、沉淀、氧化、脱酰胺、水解等一系列物理或化学的改变。为了保持蛋白质的活性，研究人员做出了不少改进。
比如，加入了保护性添加剂。在蛋白质的制备中，加入一些其他物质，如蛋白质、多糖类、甘露醇等，可对包封蛋白起到一定的保护作用。国外研究人员在制备氨基酰脯胺酸酶微球时发现，同时加入0.5%的BSA和1.2毫摩尔浓度的MnCl2可较好的维持蛋白质的活性(BSA是一种有名的蛋白质保护剂，它可与酶竞争油水界面而发挥保护作用，MnCl2的加入稳固了它的这种作用)。在制备重组人生长激素(rhGH)微球时，加入了甘露醇和海藻糖，由于其优先水合的作用，制备初乳时可防止rhGH在油水界面的聚集，从而保护蛋白。此外，某些金属离子的加入对稳固某些蛋白质的活性也有帮助，如在制备神经生长因子(NGF)微球时，加入醋酸锌，由于锌离子与蛋白质的可逆结合，不仅可提高NGF的稳定性，而且不影响NGF的释放。
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多聚体的分子量也会影响蛋白质的活性，因此在选择高分子材料时应该考虑分子量对蛋白质活性的影响，而不应仅仅顾及微球的释放。在制备钩端螺旋体抗原(OMP)微球时，研究人员发现，PLA和PLGA分子量的增加可增加蛋白质药物的包封率，但却明显降低蛋白质的活性，这是由于分子量高的多聚体和蛋白质分子间有强烈的相互作用，可引起蛋白质结构的重组和凝聚的形成。
制备方法的影响也不容忽视。国内研究人员在制备胰岛素微球时发现，采用S/O/W法胰岛素以固体形式存在，比在双乳液法中溶解在内相水中的胰岛素向外相水溶液扩散的速度要慢得多，而且以固体形式存在的胰岛素与有机溶剂接触的面积也要小些,由此产生的胰岛素失活的量则相应减少。还有采用W1/O1/O2方法制备微球时发现，包封的蛋白质有70%～80%分散在或靠近微球表面，而W1/O/W2复乳化法得到的微球表面蛋白仅占20%～30%。蛋白分子位于表面更易受到如机械搅拌、接触有机溶剂等诸多不利的影响，从而导致蛋白质失活。
此外，某些表面活性剂对蛋白质有保护作用。PEG400可以修饰蛋白质的结构，使其稳定性增加。国外研究人员在包封重组干扰素时发现，PEG400可以使rhGH活性由修饰前的16%增加到超过50%。
研究人员通过控制制备工艺中的理化参数，选择添加剂来改善制得的微球的性质。但由于不同蛋白质物理化学性质差异较大，对一种蛋白质适合的理化条件、保护性添加剂，对其他蛋白质不一定适用。因此，在确定一种包封蛋白质药物后，具体的操作条件和辅料的选择等需要进行处方筛选。相信通过全面考虑和摸索，研究人员必定会制备出能满足临床需要的微球制剂。
(孙华燕徐风华), http://www.100md.com(孙华燕；徐风华)