单克隆抗体检测血吸虫病病人循环抗原的研究*
作者：严自助 王文 吕再婴 吴缨 Peter Rotmans Andre Deelde
单位：严自助 王文 吕再婴 吴缨 中国预防医学科学院寄生虫病研究所Δ；Peter Rotmans Andre Deelde 荷兰莱顿大学寄生虫学实验室
关键词：抗体，单克隆；血吸虫病；循环抗原；酶免疫技术
中华医学杂志900114
提要 将血吸虫肠相关趋阳极多糖抗原的单克隆抗体用于夹心法ELISA检测血吸虫病病人血清中循环抗原。102例粪检阳性的慢性血吸虫病病人血清，循环抗原阳性者85例，阳性率83.3%；10例急性和10例晚期血吸虫病病人血清，阳性分别为8及3例；肺吸虫、肝吸虫血清未见交叉反应。25例上海地区正常人血清中有3例呈弱阳性反应，40例荷兰献血员血清均显阴性反应。另56例慢性血吸虫病病人(粪便虫卵计数1～176只/g)，用上述方法测定血清中循环抗原水平为1∶4～1∶8 192，抗原滴度与粪便虫卵数呈正相关。测定治疗前后慢性血吸虫病病人血清表明，经有效药物治疗后半年，循环抗原水平有不同程度下降。
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血吸虫循环抗原的检测能反映宿主活性感染、虫体负荷量及评价药物治疗的效果[1～4]。我们在制备、筛选及预试单克隆抗体工作中，发现抗血吸虫肠道趋阳极多糖抗原的单克隆抗体，在用夹心法ELISA来检测血吸虫相应的循环抗原时，具有敏感性好，能反映感染度和药物治疗效果等优点。我们将该法用于检测各期血吸虫病病人血清中循环抗原及对反应的特异性进行观察，现将结果报告如下。
材料与方法
1. 抗血吸虫肠道趋阳极多糖抗原单克隆抗体的制备：采用杂交瘤技术，将感染血吸血的BALA/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用间接荧光抗体试验过筛特异性抗体，获得一批单克隆抗体细胞株，经反复克隆化筛选及预试验，其中单克隆抗体细胞株120·1 B10A所分泌的单克隆抗体在Rossman氏固定的血吸虫成虫石蜡切片间接荧光抗体试验上对成虫肠道呈强阳性反应，细胞诱生的小鼠腹水效价可达1∶5×104；其靶抗原为血吸虫多糖蛋白，在免疫电泳上趋阳极泳动；免疫球蛋白属IgG1亚类，对血吸虫种具有属特异性。
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2. 单克隆抗体酶结合物的制备：将120·1B10A细胞诱生小鼠腹水，该腹水经蛋白A琼脂糖珠柱层析纯化，经解离洗脱，收集活性组分。经浓缩后用戊二醛一步法标记碱性磷料酸酶待用。
3. 血清预处理：取待测血清100μl加等量4%三氯醋酸溶液，室温静止10min，经5000r/min离心15min，去沉淀，上清液加等量0.244mol碳酸盐缓冲液(pH9.6)中和，保存4°C待用(1∶4血清待测液)。
4. 待试血清：急、慢性血吸虫病病人血清取自湖南省泗湖山、浙江省嘉兴及湖北省武汉流行区经粪便检查证实为血吸虫病的病人。对其中部分慢性血吸虫病病人的粪便用改良加藤法与消化法进行了虫卵计数。晚期病人血清及治疗前后病人血清均取自浙江省嘉兴地区。肺吸虫、肝吸虫病病人血清分别取自四川、广东地区。正常人血清来自上海地区健康人群及荷兰健康献血员。
5. 试验方法：将抗肠道多糖抗原的单克隆抗体腹水用pH9.6碳酸盐缓冲液作1∶1000稀释包被聚氯乙烯塑料板，室温过夜。次日用PBS洗涤2次，再用250μg/mg牛血清白蛋白(BSA)于37°C孵育1小时。经PBS洗涤甩干后，将抗原板储-70°C备用。检测时取经过预处理的病人血清，用0.02%Toween20作1∶4～1∶8 192稀释，加80μl稀释血清至上述已包被单克隆抗体的塑料板小井中，置37°C孵育1小时，再加100μl 1∶40稀释的碱性磷酸酶标记的同种单克隆抗体结合物，再置于37°C1小时。经洗涤后，加底物对硝基苯磷酸盐，浓度系1mg/ml。置4°C过夜，次日测405nm波长处的光吸收值。每块塑料反应板上除待测血清外，均设有已知的成虫三氯醋酸可溶性抗原及PBS作对照。
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以≥阴性血清光吸收均值加2倍标准差为阳性反应的判读标准；以阳性反应的最后一个血清稀释度作为效价。
结 果
1. 共测定了湖南省慢性血吸虫病病人血清102份，其中85份血清抗原效价均>1∶4。若以1∶4为阳性反应判读标准，则阳性反应85例，阳性率为83.3%。其中55例血清滴度为1∶4～1∶32(占阳性病例的64.7%)；另30例血清滴度为1：64～1：8 192(占35.3%)；17例血清抗原效价低于1∶4。
2. 测定了10例湖南、湖北急性血吸虫病病人的血清，阳性反应8例，其中7例(87.5%)血清滴度为1：64～1：2 048，另1例血清滴度为1：4。
测定10例浙江晚期血吸虫病病人的血清，阳性3例，滴度均为1：4。
8例肺吸虫与肝吸虫病病人血清未见阳性反应。
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1.急性期 2.慢性期 3.晚期 4.肺吸虫、肝吸虫病人 5.健康人
图1 单克隆抗体酶联试验测定各期血吸虫病人及健
康人血清中循环抗原水平(40例荷兰献血员血清未列入图中)
测定25名正常人血清，其中有3例滴度为1∶4，其余22名均<1∶4(图1)；另测定40例荷兰健康献血员血清，未见阳性反应。
3. 10例慢性血吸虫病病人血清，治疗前循环抗原滴度为1∶4～1∶64；经吡喹酮治疗后半年，取血再测，其中6例已低于1∶4，另4例也有不同程度的下降。
4. 56例慢性血吸虫病病人(粪便虫卵计数为1～176只虫卵/克粪)，血清循环抗原滴度为1∶4～1：8 192，抗原滴度随粪便虫卵数的增多而增高，两者呈正相关(Υ=0.39)(图2)。
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图2 慢性血吸虫病人血清中循环抗原水平与粪便虫卵数的关系
讨 论
用于血吸虫病免疫诊断的方法甚多，但均系检测抗体。由于抗体在宿主体内存留时间较长，特别在我国流行区，多数病人经过反复治疗，检测抗体常常不能真实反映病人目前的感染情况。为此许多学者致力于检测循环抗原的研究，但因缺乏特异性抗体而不能令人满意。国内外各实验室检测的结果也颇不一致[5，6]。单克隆抗体技术的诞生，使高效价高特异性抗体的制备成为可能，我们通过30余株单克隆抗体的制备和筛选发现抗血吸虫成虫肠道多糖抗原的单克隆抗体用于夹心法ELISA检测抗原的效果最好，其敏感度可达1ng/ml或更低水平。本研究用此法检测各期血吸虫病病人血清中循环抗原，表明有较好的敏感性和特异性，血清循环抗原水平不仅与感染度相关，而且治疗后短期内抗原水平也有明显下降，因而本法对于诊断血吸虫病、考核药物疗效均有很大价值。
Capron实验室采用双抗体放免法检测循环抗原时，其敏感度仅达到5ng/ml，低于本文报道的结果[7]。我们认为在夹心法ELISA中，应用高特异性、高滴度、高亲和力的单克隆抗体是一关键。由于血吸虫原原性复杂，因而筛选高滴度、高亲和力的单克隆抗体绝非易事。因为最好的杂交细胞可能并不是与最好的分泌抗体的浆细胞融合后产生的。高亲和力的抗体仅为总抗体的一部分，因而在众多的单克隆抗体中往往只能出现一个高亲和力的单克隆抗体。另外，根据我们的实践，应用夹心法ELISA检测血吸虫循环抗原时，所用的单克隆抗体其靶抗原为多糖者较蛋白质类好，免疫球蛋白属于IgG1的较IgM为好，其机理尚不清楚。
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采用夹心法ELISA检测慢性血吸虫病病人血清时，64.7%的血清循环抗原滴度为1：4～1：32，仅35.3%血清滴度≥1：64，而在测定急性血吸虫病病人时87.5%血清循环抗原滴度≥1：64，可见急性血吸虫病人的循环抗原水平高于慢性血吸虫病病人。我们在动物实验时也有类似现象，家兔或小鼠在感染后3～4周，循环抗原量上升，7～8周达到高峰，9～10周后呈下降趋势。推测在慢性病人中，由于病程长，多数病人经过反复治疗，虫体在宿主体内的存活数少，循环抗原受到机体清除以及诸多因素的影响，致使有一部分病人的循环抗原处于低水平状态。
湖南沅江县血吸虫病防治所提供大部分血清及粪便虫卵计数，特此致谢
参考文献
1. Berggren WL, Weller TH. Immunoelectrophoretic demonstration of specific circulating antigen in animals infected with Schistosoma mansoni. Am J Trop Med Hyg 1967; 16:606.
, http://www.100md.com
2. Gold R. et al. A specific circulating antigen in hamsters infected with Schistosoma mansom. Detection of antigen in serum and urine, and correlation between antigenic concentration and worm burden. Am J Trop Med Hyg 1969; 18:545.
3. Deelder AM, et al. Schistosoma mansoni: Characterization of two circulating polysaccharide antigens and the immunological response to these antigens in mouse, hamster and human infections. Exp Parasitol 1980, 50:16.
, 百拇医药
4. Nash TE, et al. Further purification and characterization of a circulating antigen in schistosomiasis. J Immunol 1977, 119:1627.
5. Deelder AM, et al. Schistosoma mansoni: Microfluorometric determination of circulating anodic antigen and antigen-antibody complexes in infected hamster serum. Exp Parasitol 1978, 44:216.
6. Qian ZL, Wen HC. Schistosome circulating antigens(CSA) as a possible diagnostic parameter for active infections. Acta Leiden 1983, 51:37.
, 百拇医药
7. Nogueira-Queiroz JA, et al. Detection and quantification of circulating antigen in schistosomiasis by a monoclonal antibody. I.Specifictity analysis of a monoclonal antibody with immunodiagnostic capacity. Clin. Exp Immunol 1986,65:223.
*卫生部科研基金资助项目
Δ世界卫生组织疟疾、血吸虫、丝虫病协作中心，上海，邮政编码 200025
(1989年1月9日收稿 同年9月5日修回), http://www.100md.com
单位：严自助 王文 吕再婴 吴缨 中国预防医学科学院寄生虫病研究所Δ；Peter Rotmans Andre Deelde 荷兰莱顿大学寄生虫学实验室
关键词：抗体，单克隆；血吸虫病；循环抗原；酶免疫技术
中华医学杂志900114
提要 将血吸虫肠相关趋阳极多糖抗原的单克隆抗体用于夹心法ELISA检测血吸虫病病人血清中循环抗原。102例粪检阳性的慢性血吸虫病病人血清，循环抗原阳性者85例，阳性率83.3%；10例急性和10例晚期血吸虫病病人血清，阳性分别为8及3例；肺吸虫、肝吸虫血清未见交叉反应。25例上海地区正常人血清中有3例呈弱阳性反应，40例荷兰献血员血清均显阴性反应。另56例慢性血吸虫病病人(粪便虫卵计数1～176只/g)，用上述方法测定血清中循环抗原水平为1∶4～1∶8 192，抗原滴度与粪便虫卵数呈正相关。测定治疗前后慢性血吸虫病病人血清表明，经有效药物治疗后半年，循环抗原水平有不同程度下降。
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血吸虫循环抗原的检测能反映宿主活性感染、虫体负荷量及评价药物治疗的效果[1～4]。我们在制备、筛选及预试单克隆抗体工作中，发现抗血吸虫肠道趋阳极多糖抗原的单克隆抗体，在用夹心法ELISA来检测血吸虫相应的循环抗原时，具有敏感性好，能反映感染度和药物治疗效果等优点。我们将该法用于检测各期血吸虫病病人血清中循环抗原及对反应的特异性进行观察，现将结果报告如下。
材料与方法
1. 抗血吸虫肠道趋阳极多糖抗原单克隆抗体的制备：采用杂交瘤技术，将感染血吸血的BALA/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用间接荧光抗体试验过筛特异性抗体，获得一批单克隆抗体细胞株，经反复克隆化筛选及预试验，其中单克隆抗体细胞株120·1 B10A所分泌的单克隆抗体在Rossman氏固定的血吸虫成虫石蜡切片间接荧光抗体试验上对成虫肠道呈强阳性反应，细胞诱生的小鼠腹水效价可达1∶5×104；其靶抗原为血吸虫多糖蛋白，在免疫电泳上趋阳极泳动；免疫球蛋白属IgG1亚类，对血吸虫种具有属特异性。
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2. 单克隆抗体酶结合物的制备：将120·1B10A细胞诱生小鼠腹水，该腹水经蛋白A琼脂糖珠柱层析纯化，经解离洗脱，收集活性组分。经浓缩后用戊二醛一步法标记碱性磷料酸酶待用。
3. 血清预处理：取待测血清100μl加等量4%三氯醋酸溶液，室温静止10min，经5000r/min离心15min，去沉淀，上清液加等量0.244mol碳酸盐缓冲液(pH9.6)中和，保存4°C待用(1∶4血清待测液)。
4. 待试血清：急、慢性血吸虫病病人血清取自湖南省泗湖山、浙江省嘉兴及湖北省武汉流行区经粪便检查证实为血吸虫病的病人。对其中部分慢性血吸虫病病人的粪便用改良加藤法与消化法进行了虫卵计数。晚期病人血清及治疗前后病人血清均取自浙江省嘉兴地区。肺吸虫、肝吸虫病病人血清分别取自四川、广东地区。正常人血清来自上海地区健康人群及荷兰健康献血员。
5. 试验方法：将抗肠道多糖抗原的单克隆抗体腹水用pH9.6碳酸盐缓冲液作1∶1000稀释包被聚氯乙烯塑料板，室温过夜。次日用PBS洗涤2次，再用250μg/mg牛血清白蛋白(BSA)于37°C孵育1小时。经PBS洗涤甩干后，将抗原板储-70°C备用。检测时取经过预处理的病人血清，用0.02%Toween20作1∶4～1∶8 192稀释，加80μl稀释血清至上述已包被单克隆抗体的塑料板小井中，置37°C孵育1小时，再加100μl 1∶40稀释的碱性磷酸酶标记的同种单克隆抗体结合物，再置于37°C1小时。经洗涤后，加底物对硝基苯磷酸盐，浓度系1mg/ml。置4°C过夜，次日测405nm波长处的光吸收值。每块塑料反应板上除待测血清外，均设有已知的成虫三氯醋酸可溶性抗原及PBS作对照。
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以≥阴性血清光吸收均值加2倍标准差为阳性反应的判读标准；以阳性反应的最后一个血清稀释度作为效价。
结 果
1. 共测定了湖南省慢性血吸虫病病人血清102份，其中85份血清抗原效价均>1∶4。若以1∶4为阳性反应判读标准，则阳性反应85例，阳性率为83.3%。其中55例血清滴度为1∶4～1∶32(占阳性病例的64.7%)；另30例血清滴度为1：64～1：8 192(占35.3%)；17例血清抗原效价低于1∶4。
2. 测定了10例湖南、湖北急性血吸虫病病人的血清，阳性反应8例，其中7例(87.5%)血清滴度为1：64～1：2 048，另1例血清滴度为1：4。
测定10例浙江晚期血吸虫病病人的血清，阳性3例，滴度均为1：4。
8例肺吸虫与肝吸虫病病人血清未见阳性反应。
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1.急性期 2.慢性期 3.晚期 4.肺吸虫、肝吸虫病人 5.健康人
图1 单克隆抗体酶联试验测定各期血吸虫病人及健
康人血清中循环抗原水平(40例荷兰献血员血清未列入图中)
测定25名正常人血清，其中有3例滴度为1∶4，其余22名均<1∶4(图1)；另测定40例荷兰健康献血员血清，未见阳性反应。
3. 10例慢性血吸虫病病人血清，治疗前循环抗原滴度为1∶4～1∶64；经吡喹酮治疗后半年，取血再测，其中6例已低于1∶4，另4例也有不同程度的下降。
4. 56例慢性血吸虫病病人(粪便虫卵计数为1～176只虫卵/克粪)，血清循环抗原滴度为1∶4～1：8 192，抗原滴度随粪便虫卵数的增多而增高，两者呈正相关(Υ=0.39)(图2)。
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图2 慢性血吸虫病人血清中循环抗原水平与粪便虫卵数的关系
讨 论
用于血吸虫病免疫诊断的方法甚多，但均系检测抗体。由于抗体在宿主体内存留时间较长，特别在我国流行区，多数病人经过反复治疗，检测抗体常常不能真实反映病人目前的感染情况。为此许多学者致力于检测循环抗原的研究，但因缺乏特异性抗体而不能令人满意。国内外各实验室检测的结果也颇不一致[5，6]。单克隆抗体技术的诞生，使高效价高特异性抗体的制备成为可能，我们通过30余株单克隆抗体的制备和筛选发现抗血吸虫成虫肠道多糖抗原的单克隆抗体用于夹心法ELISA检测抗原的效果最好，其敏感度可达1ng/ml或更低水平。本研究用此法检测各期血吸虫病病人血清中循环抗原，表明有较好的敏感性和特异性，血清循环抗原水平不仅与感染度相关，而且治疗后短期内抗原水平也有明显下降，因而本法对于诊断血吸虫病、考核药物疗效均有很大价值。
Capron实验室采用双抗体放免法检测循环抗原时，其敏感度仅达到5ng/ml，低于本文报道的结果[7]。我们认为在夹心法ELISA中，应用高特异性、高滴度、高亲和力的单克隆抗体是一关键。由于血吸虫原原性复杂，因而筛选高滴度、高亲和力的单克隆抗体绝非易事。因为最好的杂交细胞可能并不是与最好的分泌抗体的浆细胞融合后产生的。高亲和力的抗体仅为总抗体的一部分，因而在众多的单克隆抗体中往往只能出现一个高亲和力的单克隆抗体。另外，根据我们的实践，应用夹心法ELISA检测血吸虫循环抗原时，所用的单克隆抗体其靶抗原为多糖者较蛋白质类好，免疫球蛋白属于IgG1的较IgM为好，其机理尚不清楚。
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采用夹心法ELISA检测慢性血吸虫病病人血清时，64.7%的血清循环抗原滴度为1：4～1：32，仅35.3%血清滴度≥1：64，而在测定急性血吸虫病病人时87.5%血清循环抗原滴度≥1：64，可见急性血吸虫病人的循环抗原水平高于慢性血吸虫病病人。我们在动物实验时也有类似现象，家兔或小鼠在感染后3～4周，循环抗原量上升，7～8周达到高峰，9～10周后呈下降趋势。推测在慢性病人中，由于病程长，多数病人经过反复治疗，虫体在宿主体内的存活数少，循环抗原受到机体清除以及诸多因素的影响，致使有一部分病人的循环抗原处于低水平状态。
湖南沅江县血吸虫病防治所提供大部分血清及粪便虫卵计数，特此致谢
参考文献
1. Berggren WL, Weller TH. Immunoelectrophoretic demonstration of specific circulating antigen in animals infected with Schistosoma mansoni. Am J Trop Med Hyg 1967; 16:606.
, http://www.100md.com
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3. Deelder AM, et al. Schistosoma mansoni: Characterization of two circulating polysaccharide antigens and the immunological response to these antigens in mouse, hamster and human infections. Exp Parasitol 1980, 50:16.
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4. Nash TE, et al. Further purification and characterization of a circulating antigen in schistosomiasis. J Immunol 1977, 119:1627.
5. Deelder AM, et al. Schistosoma mansoni: Microfluorometric determination of circulating anodic antigen and antigen-antibody complexes in infected hamster serum. Exp Parasitol 1978, 44:216.
6. Qian ZL, Wen HC. Schistosome circulating antigens(CSA) as a possible diagnostic parameter for active infections. Acta Leiden 1983, 51:37.
, 百拇医药
7. Nogueira-Queiroz JA, et al. Detection and quantification of circulating antigen in schistosomiasis by a monoclonal antibody. I.Specifictity analysis of a monoclonal antibody with immunodiagnostic capacity. Clin. Exp Immunol 1986,65:223.
*卫生部科研基金资助项目
Δ世界卫生组织疟疾、血吸虫、丝虫病协作中心，上海，邮政编码 200025
(1989年1月9日收稿 同年9月5日修回), http://www.100md.com