肾综合征出血热发病初期皮肤微血管病毒抗原定位和电镜观察
作者：朱平 杨为松 刘健 张文彬 陈龙邦 白雪帆 唐永明 杨传红
单位：朱平(西安第四军医大学附属第一医院传染科 710038)；杨为松、张文彬、陈龙邦、白雪帆、唐永明(西安第四军医大学附属第二医院传染科 710038)；刘健、杨传红(西安第四军医大学电镜室 710038)
关键词：血管；病毒抗原定位；电镜观察
中华医学杂志900113
提要 采用卵白素、生物素辣根过氧化物酶复合物(ABC)法染色和电镜技术对14例肾综合征出血热(HFRS)早期患者皮肤活检材料进行病毒抗原定位研究和形态学观察。发现5/14例皮肤毛细血管内皮细胞的胞浆内可检出特异性病毒抗原颗粒，且受染的内皮细胞分布较为广泛。皮肤微血管的改变主要限于内皮细胞肿胀和轻度变性，可见与体外感染实验中受染内皮细胞相类似的病变和病毒感染的形态学指征。提示病毒感染和直接作用全身小血管和毛细血管内皮细胞，可能是造成HFRS血管系统损伤的一个始动和重要的因素。
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我们已在体外感染实验中发现，肾综合征出血热(HFRS)病毒能够侵入培养的人血管内皮细胞(HEC)，并能在其中增殖传代[1]，引起细胞损伤[2]。但体外感染尚不能替代内自然感染过程。因此，为进一步探讨HFRS发病初期人体微血管中病毒的分布和微血管损伤的特点，以及两者之间的关系，我们采用免疫组化和电子显微镜等项技术，对HFRS早期患者皮肤活检标本，进行病毒抗原定位研究和形态学观察。
材料和方法
一、标本的来源
1987年11月至1988年1月，从第四军医大学附属第一、二医院及西安地区其他医院选择14例HFRS早期患者(附表)。各患者早期毛细血管损害症状比较明显，临床经过均较典型，符合HFRS诊断标准[3]，并经特异性血清学方法证实。
标本取自患者腋前线及前臂具有潮红和出血点的皮肤。同期选择2例非出血热患者，按相同部位取材，做为阴性对照组，并采取HFRS病毒感染的乳小白鼠肺和脑组织做为阳性对照。
, 百拇医药
附表 14例肾综合征出血热早期病例临床概况
病日
倒数
分型(倒数)
轻
中
重
发热期
2～4
8
0
2
6
, 百拇医药
发热后期
5～6
5
0
4
1
低血压休克期
7
1
0
0
1
合计
2～7
, 百拇医药
14
0
6
8
二、标本的处理
1.光镜和免疫组化样品制备；每例取3mm3皮肤组织2～3块，丙酮4°C下固定1小时后，用0.1mol、pH7.2PBS充分浸洗，滤纸吸干，逐渐浸入碳蜡，按常规制备碳腊包埋块，切片。每例取两张切片进行HE染色，其余切片密封保存于4°C冰箱待检。
2.透射电镜样品制备：皮肤组织采取后立即以4%戊二醛和1%锇酸双固定，按常规脱水，浸透制备环氧树脂618包埋块，切超薄片，经醋酸铀和枸橼酸铅染色，JEM-2000 EX 型电镜下观察照相。
三、ABC染色
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参照Hsu等[4]介绍的方法进行。抗HFRS McAb系4B9、4E7、3H4、3D10四种McAb等量混合而成，由本校微生物教研室提供。ABC药盒为美国Vector公司产品。同时设：(1)HFRS病毒感染的乳小白鼠脑和肺组织切片为阳性对照；(2)非HFRS患者皮肤组织切片做为阴性对照；(3)分别以PBS和同种属正常血清替代第一抗体和第二抗体。
结 果
一、病毒抗原检测
14例皮肤活检组织切片经生物素辣根过氧化物酶复合物(ABC)法染色，其中5例于毛细血管壁上检出酶染色呈阳性反应的病毒抗原。病毒抗原在毛细血管主要定位于内皮细胞的胞浆内，呈颗粒状，散在分布。酶染色呈阳性反应的内皮细胞分布较为广泛，有时在纵切的毛细血管上可见多个内皮细胞的胞浆内有病毒抗原(图1)。此外，在一些组织细胞内和个别淋巴样细胞胞浆内也有病毒抗毒抗原存在。
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图1 ABC染色检测皮肤微血管内皮细胞中HFRS病毒抗原×400
二、微血管损伤的形态学特点
1.光镜观察：HFRS发病初期，真皮间质多有不同程度水肿，少量淋巴样细胞浸润，仅少数毛细血管有明显扩张、充血和出血。
2.电镜观察：多数毛细血管的管腔狭小，由完整的基底膜包绕。这种血管与对照组(图2)相比，改变较轻，主要限于内皮细胞。最多见的是内皮细胞肿胀，表现为胞浆水肿，电子密度降低。此外尚有部分内皮细胞发生轻度变性，电子密度增高。在同一条毛细血管上，常可见这两种肿胀和变性的内此细胞相间排列而形成的电子密度不一致的鲜明对照(图3)。在这些病变的内皮细胞的胞浆中，可见内质网增生扩张，部分线粒体肿胀和空泡形成，以及散在分布的电子致密物质。后者呈圆形或卵圆形，直径约80～160nm，主要位于扩张的内质网和高尔基氏器囊泡中(图4～6)。有明显改变的微血管，即有扩张、充血和出血者仅占少数。这种毛细血管除内皮细胞有上述改变外，尚可见管壁缺损，基底膜中断或模糊不清。真皮其他成分改变不显著，主要是血管周围间质有不同程度水肿，有时可见淋巴细胞浸润。其中部分淋巴细胞的胞浆内亦可见电子致密物质。吞噬细胞较多见，其内也可见到内质网扩张。
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图2 透射电镜显示-正常毛细血管×6.8K
图3 透射电镜显示肾综合征出血热病毒早期患者皮肤
微血管内皮细胞肿胀变性，内质网扩张，空泡形成×13.75K
图4 系上图同一血管局部放大，内皮细胞中可见线
粒体肿胀，内质网扩张，空泡形成×17K
图5 透射电镜显示-微血管内皮细胞肿胀，内质网扩张血管腔狭小×5.1K
, 百拇医药
图6 系上图内皮细胞局部放大，高尔基氏器
囊泡中可见圆形电子致密物质(80～160mm)×27K
讨 论
阐明HFRS病毒对血管系统的直接作用，对于深入探讨HFRS的发病机理具有十分重要的意义。但由于本病早期体内有病毒存在时，难以得到形态学资料，而尸检者又多属重型的中、晚期病例，常因各种合并症，使形态学的改变不能反映本病最基本的原发性病理变化。因此，对早期病例皮肤微血管进行病毒抗原定位及形态学观察，有助于阐明本病早期微血管损伤的机理。
我们采用低温碳蜡包埋，ABC染色等免疫组化技术和电子显微镜技术，对14例HFRS早期病例皮肤活检材料进行病毒抗原定位和形态学观察。发现：(1)4/15例皮肤微血管内皮细胞的胞浆内检出HFRS病毒抗原，而且病毒抗原阳性的内皮细胞分布较为广泛；(2)HFRS早期多数微血管病变较轻，主要限于内皮细胞肿胀或轻度变性；(3)病变的内皮细胞多有内质网扩张，空泡形成，并在扩张的高尔基氏器囊泡和内质网池中可见散在分布的，直径为80～160nm呈圆形或卵圆形的电子致密物质，与体外受HFRS病毒感染的人血管内皮细胞的形态学改变相类似[2]。研究结果提示，HFRS病毒在本病早期已广泛地侵入微血管内皮细胞；早期微血管的病变与体外感染试验相类似，均可见广泛的内皮细胞轻至中度的变质性改变。反映病毒感染的内皮细胞存在着代谢紊乱和通透性改变，由此可导致全身小血管和毛细血管功能障碍和通透性增高，从而为血液透过性漏出提供条件。
, 百拇医药
此外，从本病过程来看，HFRS为急性病毒性感染过程，临床早期病毒血症明显，发病后全身血管系统的损伤立即出现。而据测定，本病符合初次感染的规律，特异性抗体于发病后2～3日才产生[5]。结合体外感染实验中人血管内皮细胞对HFRS病毒高度敏感，HFRS病毒能在其中增殖复制造成损伤这一结果，我们认为病毒感染和直接作用全身小血管和毛细血管内皮细胞，可能是造成HFRS血管系统损伤的一个始动和重要的因素。
参考文献
1.朱平，等.流行性出血热病毒在体外培养的人血管内皮细胞中增殖和复制. 中华医学杂志 1988；68：524.
2.朱平，等.肾综合征出血热病毒感染人血管内皮细胞的观察. 中华医学杂志 1989；69：592.
3.流行性出血热防治方案.中华内科杂志 1987；26：503.
4.Hsu SM, et al. The use of antiavidin antibody and avidinbiotinperoxidase coplex in immunoperoxidase technics. AM J Clin Pathol 1981;75:734.
5.管美英，等.流行性出血热血清特异性IgM和IgG的检测及临床意义.病毒学杂志 1987；1：41
(1989年7月15日收稿 同年10月5日修回), 百拇医药
单位：朱平(西安第四军医大学附属第一医院传染科 710038)；杨为松、张文彬、陈龙邦、白雪帆、唐永明(西安第四军医大学附属第二医院传染科 710038)；刘健、杨传红(西安第四军医大学电镜室 710038)
关键词：血管；病毒抗原定位；电镜观察
中华医学杂志900113
提要 采用卵白素、生物素辣根过氧化物酶复合物(ABC)法染色和电镜技术对14例肾综合征出血热(HFRS)早期患者皮肤活检材料进行病毒抗原定位研究和形态学观察。发现5/14例皮肤毛细血管内皮细胞的胞浆内可检出特异性病毒抗原颗粒，且受染的内皮细胞分布较为广泛。皮肤微血管的改变主要限于内皮细胞肿胀和轻度变性，可见与体外感染实验中受染内皮细胞相类似的病变和病毒感染的形态学指征。提示病毒感染和直接作用全身小血管和毛细血管内皮细胞，可能是造成HFRS血管系统损伤的一个始动和重要的因素。
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我们已在体外感染实验中发现，肾综合征出血热(HFRS)病毒能够侵入培养的人血管内皮细胞(HEC)，并能在其中增殖传代[1]，引起细胞损伤[2]。但体外感染尚不能替代内自然感染过程。因此，为进一步探讨HFRS发病初期人体微血管中病毒的分布和微血管损伤的特点，以及两者之间的关系，我们采用免疫组化和电子显微镜等项技术，对HFRS早期患者皮肤活检标本，进行病毒抗原定位研究和形态学观察。
材料和方法
一、标本的来源
1987年11月至1988年1月，从第四军医大学附属第一、二医院及西安地区其他医院选择14例HFRS早期患者(附表)。各患者早期毛细血管损害症状比较明显，临床经过均较典型，符合HFRS诊断标准[3]，并经特异性血清学方法证实。
标本取自患者腋前线及前臂具有潮红和出血点的皮肤。同期选择2例非出血热患者，按相同部位取材，做为阴性对照组，并采取HFRS病毒感染的乳小白鼠肺和脑组织做为阳性对照。
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附表 14例肾综合征出血热早期病例临床概况
病日
倒数
分型(倒数)
轻
中
重
发热期
2～4
8
0
2
6
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发热后期
5～6
5
0
4
1
低血压休克期
7
1
0
0
1
合计
2～7
, 百拇医药
14
0
6
8
二、标本的处理
1.光镜和免疫组化样品制备；每例取3mm3皮肤组织2～3块，丙酮4°C下固定1小时后，用0.1mol、pH7.2PBS充分浸洗，滤纸吸干，逐渐浸入碳蜡，按常规制备碳腊包埋块，切片。每例取两张切片进行HE染色，其余切片密封保存于4°C冰箱待检。
2.透射电镜样品制备：皮肤组织采取后立即以4%戊二醛和1%锇酸双固定，按常规脱水，浸透制备环氧树脂618包埋块，切超薄片，经醋酸铀和枸橼酸铅染色，JEM-2000 EX 型电镜下观察照相。
三、ABC染色
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参照Hsu等[4]介绍的方法进行。抗HFRS McAb系4B9、4E7、3H4、3D10四种McAb等量混合而成，由本校微生物教研室提供。ABC药盒为美国Vector公司产品。同时设：(1)HFRS病毒感染的乳小白鼠脑和肺组织切片为阳性对照；(2)非HFRS患者皮肤组织切片做为阴性对照；(3)分别以PBS和同种属正常血清替代第一抗体和第二抗体。
结 果
一、病毒抗原检测
14例皮肤活检组织切片经生物素辣根过氧化物酶复合物(ABC)法染色，其中5例于毛细血管壁上检出酶染色呈阳性反应的病毒抗原。病毒抗原在毛细血管主要定位于内皮细胞的胞浆内，呈颗粒状，散在分布。酶染色呈阳性反应的内皮细胞分布较为广泛，有时在纵切的毛细血管上可见多个内皮细胞的胞浆内有病毒抗原(图1)。此外，在一些组织细胞内和个别淋巴样细胞胞浆内也有病毒抗毒抗原存在。
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图1 ABC染色检测皮肤微血管内皮细胞中HFRS病毒抗原×400
二、微血管损伤的形态学特点
1.光镜观察：HFRS发病初期，真皮间质多有不同程度水肿，少量淋巴样细胞浸润，仅少数毛细血管有明显扩张、充血和出血。
2.电镜观察：多数毛细血管的管腔狭小，由完整的基底膜包绕。这种血管与对照组(图2)相比，改变较轻，主要限于内皮细胞。最多见的是内皮细胞肿胀，表现为胞浆水肿，电子密度降低。此外尚有部分内皮细胞发生轻度变性，电子密度增高。在同一条毛细血管上，常可见这两种肿胀和变性的内此细胞相间排列而形成的电子密度不一致的鲜明对照(图3)。在这些病变的内皮细胞的胞浆中，可见内质网增生扩张，部分线粒体肿胀和空泡形成，以及散在分布的电子致密物质。后者呈圆形或卵圆形，直径约80～160nm，主要位于扩张的内质网和高尔基氏器囊泡中(图4～6)。有明显改变的微血管，即有扩张、充血和出血者仅占少数。这种毛细血管除内皮细胞有上述改变外，尚可见管壁缺损，基底膜中断或模糊不清。真皮其他成分改变不显著，主要是血管周围间质有不同程度水肿，有时可见淋巴细胞浸润。其中部分淋巴细胞的胞浆内亦可见电子致密物质。吞噬细胞较多见，其内也可见到内质网扩张。
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图2 透射电镜显示-正常毛细血管×6.8K
图3 透射电镜显示肾综合征出血热病毒早期患者皮肤
微血管内皮细胞肿胀变性，内质网扩张，空泡形成×13.75K
图4 系上图同一血管局部放大，内皮细胞中可见线
粒体肿胀，内质网扩张，空泡形成×17K
图5 透射电镜显示-微血管内皮细胞肿胀，内质网扩张血管腔狭小×5.1K
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图6 系上图内皮细胞局部放大，高尔基氏器
囊泡中可见圆形电子致密物质(80～160mm)×27K
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阐明HFRS病毒对血管系统的直接作用，对于深入探讨HFRS的发病机理具有十分重要的意义。但由于本病早期体内有病毒存在时，难以得到形态学资料，而尸检者又多属重型的中、晚期病例，常因各种合并症，使形态学的改变不能反映本病最基本的原发性病理变化。因此，对早期病例皮肤微血管进行病毒抗原定位及形态学观察，有助于阐明本病早期微血管损伤的机理。
我们采用低温碳蜡包埋，ABC染色等免疫组化技术和电子显微镜技术，对14例HFRS早期病例皮肤活检材料进行病毒抗原定位和形态学观察。发现：(1)4/15例皮肤微血管内皮细胞的胞浆内检出HFRS病毒抗原，而且病毒抗原阳性的内皮细胞分布较为广泛；(2)HFRS早期多数微血管病变较轻，主要限于内皮细胞肿胀或轻度变性；(3)病变的内皮细胞多有内质网扩张，空泡形成，并在扩张的高尔基氏器囊泡和内质网池中可见散在分布的，直径为80～160nm呈圆形或卵圆形的电子致密物质，与体外受HFRS病毒感染的人血管内皮细胞的形态学改变相类似[2]。研究结果提示，HFRS病毒在本病早期已广泛地侵入微血管内皮细胞；早期微血管的病变与体外感染试验相类似，均可见广泛的内皮细胞轻至中度的变质性改变。反映病毒感染的内皮细胞存在着代谢紊乱和通透性改变，由此可导致全身小血管和毛细血管功能障碍和通透性增高，从而为血液透过性漏出提供条件。
, 百拇医药
此外，从本病过程来看，HFRS为急性病毒性感染过程，临床早期病毒血症明显，发病后全身血管系统的损伤立即出现。而据测定，本病符合初次感染的规律，特异性抗体于发病后2～3日才产生[5]。结合体外感染实验中人血管内皮细胞对HFRS病毒高度敏感，HFRS病毒能在其中增殖复制造成损伤这一结果，我们认为病毒感染和直接作用全身小血管和毛细血管内皮细胞，可能是造成HFRS血管系统损伤的一个始动和重要的因素。
参考文献
1.朱平，等.流行性出血热病毒在体外培养的人血管内皮细胞中增殖和复制. 中华医学杂志 1988；68：524.
2.朱平，等.肾综合征出血热病毒感染人血管内皮细胞的观察. 中华医学杂志 1989；69：592.
3.流行性出血热防治方案.中华内科杂志 1987；26：503.
4.Hsu SM, et al. The use of antiavidin antibody and avidinbiotinperoxidase coplex in immunoperoxidase technics. AM J Clin Pathol 1981;75:734.
5.管美英，等.流行性出血热血清特异性IgM和IgG的检测及临床意义.病毒学杂志 1987；1：41
(1989年7月15日收稿 同年10月5日修回), 百拇医药