重庆地区淋球菌青霉素耐药质粒的分离与鉴定
作者：俞晓峰 梅基铭 曹俊杰 冷泰俊 宦秉瑜 周玲 代祥安
单位：俞晓峰、冷泰俊(重庆，第三军医大学流行病学教研室)；梅基铭(重庆第三军医大学临床微生物学教研室)；曹俊杰(重庆，第三军医大学微生物学教研室)；宦秉瑜、周玲、代祥安(重庆市性病监测中心)
关键词：淋病双球菌；耐药性；质粒
中华医学杂志900312
提要 从8株淋球菌的抗生素敏感试验中筛选出1株青霉素耐药株；经质粒图谱分析表明，该青霉素耐药株带有一分子量为4.7Mdal的R质粒，并带有24.5Mdal接合质粒和2.4Mdal隐蔽质粒，从而首次在重庆分离到淋球菌青霉素R质粒。
自1976年英国首次报道产青霉素酶淋球菌(PPNG)以来，世界各地相继出现淋球菌青霉素耐药株，且呈越来越严重的趋势。淋球菌对青霉素耐药性的产生是由其所带青霉素耐药质粒(R质粒)介导的[1]。李德如等[2]曾报道重庆地区有33%的淋球菌分离株对青霉素有耐药性。为了解重庆淋球菌青霉素R质粒及其特征，我们对重庆市性病监测中心性病门诊淋病患者进行了调查，并在重庆首次分离到淋球菌青霉素R质粒。
, 百拇医药
材料与方法
一、菌种来源
取重庆市性病监测中心性病门诊男性患者尿道分泌物直接涂片，作革兰氏染色，显微镜下见多核细胞内有肾形革兰氏阴性双球菌存在，初步定为淋球菌。
二、培养及抗生素敏感试验
将初步鉴定的淋球菌接种于血琼脂培养基[3]，置培养皿于烛缸内，在36°C下培养约36小时后，观察其菌落形态及特征，氧化酶试验呈阳性反应，进一步鉴定为淋球菌；筛选符合标准的淋球菌单个菌落转种；并选择5种抗生素药敏纸片(上海生化试剂所)对已分离培养的8株淋球菌作抗生素敏感试验[3]，观察药敏纸片抑菌圈直径大小(包括纸片直径)。判定标准见表1。
表1 抗生素敏感试验结果判定标准 抗生素
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抑菌圈直径(mm)
耐药
中度敏感
敏感
青霉素G
≤11
12～21
≥22
四环素
≤13
14～17
≥18
卡那霉素
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≤14
15～18
≥19
洁霉素
≤13
14～17
≥18
红霉素
≤16
17～20
≥21
三、质粒DNA提取及电泳鉴定
根据药敏试验结果，用无菌生理盐水洗下经血琼脂培养基培养36小时，且耐青霉素的淋球菌菌落，收集于Eppendorf管内，离心收集菌体；加入溶液100μl，冰浴15分钟，再加0.2mol NaOH、1%十二烷基磺酸钠200μl使淋球菌完全裂解后，立即加入3mol NaAC 150μl，冰浴60分钟；离心收集上清液400μl，并加入酚-氯仿-异戊醇800μl抽提反复两次；用RNase 3μl在37°C水浴中作用30分钟，再用等体积氯仿-异戊醇抽提；离心收集上清液350μl，并分别加入0.1mol NaAC 35μl和冰乙醇700μl，于-20°C下过夜沉淀后，离心收集质粒DNA。用TE缓冲液20μl溶解DNA，并加入溴酚蓝5μl，在0.8%琼脂糖凝胶平板上电泳，电压为55V，电泳3.5小时后，用EB染色。观察结果并在紫外线灯下拍片。结 果
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一、淋球菌抗生素敏感试验
根据表1的判定标准，由表2结果可见，在分离到的8株淋球菌药敏试验中，只有菌株6淋球菌分离株对青霉素G具有耐药性，其他7株淋球菌对青霉素G则为中度敏感或敏感。
表2 淋球菌对5种抗生素敏感试验结果 菌株
抑菌圈直径(mm)
青霉素G
四环霉
卡那霉素
洁霉素
红霉素
1
28
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30
23
22
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2
15
27
20
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3
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18
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4
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5
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6
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二、淋球菌质粒DNA检测
由附图可见，经提取的淋球菌菌株6带有3条质粒带。参照标准样品大肠杆菌质粒V517分子量的大小，并根据DNA分子的泳动距离与分子量的对数成反比的原理，求得该株淋球菌质粒DNA的分子量分别为24.5Mdal、4.7Mdal和2.4Mdal(1dal=0.992 U=1.657×10-27kg)，其中分子量为4.7Mdal的质粒即为淋球菌的青霉素R质粒。
A 为大肠杆菌质粒V517
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B 为淋球菌质粒
附图 淋球菌质粒DNA琼脂糖电泳图谱
讨 论
淋球菌质粒按其分子量大小常分为3种：(1)24.5Mdal(39kb)的接合质粒或传递质粒，参与淋球菌R质粒的接合传递过程；(2)4.5～4.7Mdal(7.1～7.5kb)和3.2～3.4Mdal(5.1～5.4kb)的R质粒,具有编码TEMB-内酰胺酶基因相关的R因子，形成对青霉素的耐药性；(3)2.6Mdal(4.2kb)的隐蔽质粒，约有90%以上的淋球菌临床分离株含有此种质粒[4]。一般认为，4.5Mdal9(7.2kb)的青霉素R质粒因归初是由菲律宾菌株中分离到的，故又称其为“亚洲型”R质粒，约占R质粒的87%；而3.2Mdal(5.1kb)的青霉素R质粒首先来源于西非，故又称为“非洲型”R质粒，只占R质粒的13%[5]。然而，这两种R质粒在分子特征上有许多相似之处，如它们均带有40%的转座氨苄青霉素耐药性序列Tn 2，此转座子带有编码TEM-B-内酰胺酶的结构基因；两种质粒之间DNA序列的同源性为70%；并且两种R质粒与产β-内酰胺酶的流感、副流感和杜氏嗜血杆菌R质粒密切相关。Dickgiesser等[6]用限制性内切酶分析和异双显性组合研究表明，两种R质粒的不同表现在7.4kb(4.6Mdal)R质粒为5.3kb(3.3Mdal)R质粒含有一个2.1kb的插入序列，且由转变而得的5.3kb R质粒稳定性明显不如7.4kb的R质粒。另外，Dillon等[7]发现，有65.2%的淋球菌分离株既带有4.5Mdal的R质粒，又带有R质粒转移过程所必需的24.5Mdal接合质粒，而在带有3.2Mdal R质粒的淋球菌分离株中却未发现有24.5Mdal接合质粒的存在，提示带有4.5Mdal R质粒的淋球菌在其青霉素耐药性传递方面更具有流行病学意义[8，9]。本文首次在重庆分离到的淋球菌青霉素R质粒经鉴定证明及分子量为4.7Mdal的“亚洲型”R质粒，且带有24.5Mdal的接合质粒。由于该种青霉素R质粒在24.5Mdal接合质粒的介导下，可在淋球菌之间，以及其它菌属间发生R质粒的接合转移。由此推测4.7Mdal R质粒可能是重庆地区淋球菌青霉素耐药株的主要流行质粒。这为今后进一步开展重庆地区淋球菌青霉素耐药性流行特征的研究，追踪传染源及接触者，指导临床治疗，以及淋病的监测提供了线索和依据。
, 百拇医药
参考文献
1. Roberts M, et al. Molecular characterization of two betalactamase-specifying-plasmids from Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol 1977；131：557-563.
2. 李德如，等.71株淋球菌培养药敏试验和临床观察.重庆医药 1988；6：44.
3. 叶干运，等.性传播疾病.南京：江苏科学技术出版社. 1988：163.
4. Roy RN, et al. A novel insertion sequence in the cryptic plasmld of Neisseria gonorrhoeae may alter the B protein at the translational level. Plasmid 1988；19：39.
, http://www.100md.com
5. Brunton J, et al. Molecular epidemiology of antibiotic resistance plasmids of Haemophilus species and Neisseria gonorrhoeae. Rev Infect Dis 1986；8：713.
6. Dickgiesser N, et al. Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae: a molecular comparison of 5.3-kb amd 7.4-kb beta-lactamase plasmids. J Bacteriol 1982；151：1171.
7. Dillon JR, et al. Molecular and phenotypic characteriation of penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae from canadian sources. Antimicrob Agents Chemother 1981；19：925.
, 百拇医药
8. Brunton J, et al. Molecular nature of a plasmid specifying beta-lactamase producing in Haemophilus ducreyi. J Bacteriol 1981；148：788.
9. McNicol PJ, et al. Characterization of ampicillin resistance plasmids of Haemophilus ducreyi and Neisseria gonorrhoeae with regard to location of origin of transfer and mobilization by a conjugative plasmid of Haemophilus ducreyi. J Bacteriol 1983；156：437.
(1989年9月20日收稿), 百拇医药
单位：俞晓峰、冷泰俊(重庆，第三军医大学流行病学教研室)；梅基铭(重庆第三军医大学临床微生物学教研室)；曹俊杰(重庆，第三军医大学微生物学教研室)；宦秉瑜、周玲、代祥安(重庆市性病监测中心)
关键词：淋病双球菌；耐药性；质粒
中华医学杂志900312
提要 从8株淋球菌的抗生素敏感试验中筛选出1株青霉素耐药株；经质粒图谱分析表明，该青霉素耐药株带有一分子量为4.7Mdal的R质粒，并带有24.5Mdal接合质粒和2.4Mdal隐蔽质粒，从而首次在重庆分离到淋球菌青霉素R质粒。
自1976年英国首次报道产青霉素酶淋球菌(PPNG)以来，世界各地相继出现淋球菌青霉素耐药株，且呈越来越严重的趋势。淋球菌对青霉素耐药性的产生是由其所带青霉素耐药质粒(R质粒)介导的[1]。李德如等[2]曾报道重庆地区有33%的淋球菌分离株对青霉素有耐药性。为了解重庆淋球菌青霉素R质粒及其特征，我们对重庆市性病监测中心性病门诊淋病患者进行了调查，并在重庆首次分离到淋球菌青霉素R质粒。
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材料与方法
一、菌种来源
取重庆市性病监测中心性病门诊男性患者尿道分泌物直接涂片，作革兰氏染色，显微镜下见多核细胞内有肾形革兰氏阴性双球菌存在，初步定为淋球菌。
二、培养及抗生素敏感试验
将初步鉴定的淋球菌接种于血琼脂培养基[3]，置培养皿于烛缸内，在36°C下培养约36小时后，观察其菌落形态及特征，氧化酶试验呈阳性反应，进一步鉴定为淋球菌；筛选符合标准的淋球菌单个菌落转种；并选择5种抗生素药敏纸片(上海生化试剂所)对已分离培养的8株淋球菌作抗生素敏感试验[3]，观察药敏纸片抑菌圈直径大小(包括纸片直径)。判定标准见表1。
表1 抗生素敏感试验结果判定标准 抗生素
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抑菌圈直径(mm)
耐药
中度敏感
敏感
青霉素G
≤11
12～21
≥22
四环素
≤13
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≥18
卡那霉素
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洁霉素
≤13
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红霉素
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三、质粒DNA提取及电泳鉴定
根据药敏试验结果，用无菌生理盐水洗下经血琼脂培养基培养36小时，且耐青霉素的淋球菌菌落，收集于Eppendorf管内，离心收集菌体；加入溶液100μl，冰浴15分钟，再加0.2mol NaOH、1%十二烷基磺酸钠200μl使淋球菌完全裂解后，立即加入3mol NaAC 150μl，冰浴60分钟；离心收集上清液400μl，并加入酚-氯仿-异戊醇800μl抽提反复两次；用RNase 3μl在37°C水浴中作用30分钟，再用等体积氯仿-异戊醇抽提；离心收集上清液350μl，并分别加入0.1mol NaAC 35μl和冰乙醇700μl，于-20°C下过夜沉淀后，离心收集质粒DNA。用TE缓冲液20μl溶解DNA，并加入溴酚蓝5μl，在0.8%琼脂糖凝胶平板上电泳，电压为55V，电泳3.5小时后，用EB染色。观察结果并在紫外线灯下拍片。结 果
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一、淋球菌抗生素敏感试验
根据表1的判定标准，由表2结果可见，在分离到的8株淋球菌药敏试验中，只有菌株6淋球菌分离株对青霉素G具有耐药性，其他7株淋球菌对青霉素G则为中度敏感或敏感。
表2 淋球菌对5种抗生素敏感试验结果 菌株
抑菌圈直径(mm)
青霉素G
四环霉
卡那霉素
洁霉素
红霉素
1
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二、淋球菌质粒DNA检测
由附图可见，经提取的淋球菌菌株6带有3条质粒带。参照标准样品大肠杆菌质粒V517分子量的大小，并根据DNA分子的泳动距离与分子量的对数成反比的原理，求得该株淋球菌质粒DNA的分子量分别为24.5Mdal、4.7Mdal和2.4Mdal(1dal=0.992 U=1.657×10-27kg)，其中分子量为4.7Mdal的质粒即为淋球菌的青霉素R质粒。
A 为大肠杆菌质粒V517
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B 为淋球菌质粒
附图 淋球菌质粒DNA琼脂糖电泳图谱
讨 论
淋球菌质粒按其分子量大小常分为3种：(1)24.5Mdal(39kb)的接合质粒或传递质粒，参与淋球菌R质粒的接合传递过程；(2)4.5～4.7Mdal(7.1～7.5kb)和3.2～3.4Mdal(5.1～5.4kb)的R质粒,具有编码TEMB-内酰胺酶基因相关的R因子，形成对青霉素的耐药性；(3)2.6Mdal(4.2kb)的隐蔽质粒，约有90%以上的淋球菌临床分离株含有此种质粒[4]。一般认为，4.5Mdal9(7.2kb)的青霉素R质粒因归初是由菲律宾菌株中分离到的，故又称其为“亚洲型”R质粒，约占R质粒的87%；而3.2Mdal(5.1kb)的青霉素R质粒首先来源于西非，故又称为“非洲型”R质粒，只占R质粒的13%[5]。然而，这两种R质粒在分子特征上有许多相似之处，如它们均带有40%的转座氨苄青霉素耐药性序列Tn 2，此转座子带有编码TEM-B-内酰胺酶的结构基因；两种质粒之间DNA序列的同源性为70%；并且两种R质粒与产β-内酰胺酶的流感、副流感和杜氏嗜血杆菌R质粒密切相关。Dickgiesser等[6]用限制性内切酶分析和异双显性组合研究表明，两种R质粒的不同表现在7.4kb(4.6Mdal)R质粒为5.3kb(3.3Mdal)R质粒含有一个2.1kb的插入序列，且由转变而得的5.3kb R质粒稳定性明显不如7.4kb的R质粒。另外，Dillon等[7]发现，有65.2%的淋球菌分离株既带有4.5Mdal的R质粒，又带有R质粒转移过程所必需的24.5Mdal接合质粒，而在带有3.2Mdal R质粒的淋球菌分离株中却未发现有24.5Mdal接合质粒的存在，提示带有4.5Mdal R质粒的淋球菌在其青霉素耐药性传递方面更具有流行病学意义[8，9]。本文首次在重庆分离到的淋球菌青霉素R质粒经鉴定证明及分子量为4.7Mdal的“亚洲型”R质粒，且带有24.5Mdal的接合质粒。由于该种青霉素R质粒在24.5Mdal接合质粒的介导下，可在淋球菌之间，以及其它菌属间发生R质粒的接合转移。由此推测4.7Mdal R质粒可能是重庆地区淋球菌青霉素耐药株的主要流行质粒。这为今后进一步开展重庆地区淋球菌青霉素耐药性流行特征的研究，追踪传染源及接触者，指导临床治疗，以及淋病的监测提供了线索和依据。
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参考文献
1. Roberts M, et al. Molecular characterization of two betalactamase-specifying-plasmids from Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol 1977；131：557-563.
2. 李德如，等.71株淋球菌培养药敏试验和临床观察.重庆医药 1988；6：44.
3. 叶干运，等.性传播疾病.南京：江苏科学技术出版社. 1988：163.
4. Roy RN, et al. A novel insertion sequence in the cryptic plasmld of Neisseria gonorrhoeae may alter the B protein at the translational level. Plasmid 1988；19：39.
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5. Brunton J, et al. Molecular epidemiology of antibiotic resistance plasmids of Haemophilus species and Neisseria gonorrhoeae. Rev Infect Dis 1986；8：713.
6. Dickgiesser N, et al. Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae: a molecular comparison of 5.3-kb amd 7.4-kb beta-lactamase plasmids. J Bacteriol 1982；151：1171.
7. Dillon JR, et al. Molecular and phenotypic characteriation of penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae from canadian sources. Antimicrob Agents Chemother 1981；19：925.
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8. Brunton J, et al. Molecular nature of a plasmid specifying beta-lactamase producing in Haemophilus ducreyi. J Bacteriol 1981；148：788.
9. McNicol PJ, et al. Characterization of ampicillin resistance plasmids of Haemophilus ducreyi and Neisseria gonorrhoeae with regard to location of origin of transfer and mobilization by a conjugative plasmid of Haemophilus ducreyi. J Bacteriol 1983；156：437.
(1989年9月20日收稿), 百拇医药