胃粘膜细胞动力学研究两种方法的比较
作者：贾柳萍Δ 章天予 邝贺龄 黄日允 陈 为
单位：(广州，中山医科大学第一附属医院内科 510089)
关键词：
体外3H
体外3H-TdR渗入法是研究胃肠道粘膜细胞动力学的重要方法之一[1，2]，3H-TdR作为DNA合成的前体，其渗入量可代表细胞增殖的速度或处于增殖周期细胞的多少；60年代至今，观察组织DNA合成水平及细胞增殖变化多用放射自显影法，该法繁锁、费时，细胞计数量大，使临床应用受到限制。为此，我们应用液闪计数法测定3H-TdR渗入量，了解细胞增殖或DNA合成水平，并采用两种方法对慢性胃炎、胃癌的3H-TdR渗入细胞动力学进行观察，探讨萎缩性胃炎与胃癌的关系及液闪计数法的应用。
, 百拇医药
对象与方法
一、对象
慢性浅表性胃炎21例(CSG组)，萎缩性胃炎35例伴肠化22例(CAG组)，胃癌23例(GC组)。全部病人为我院住院及门诊者，均经胃镜及病理检查确诊。对照组20例为无消化道疾病的健康自愿者。
二、方法
取材：浅表性胃炎及对照组取幽门前3cm胃窦小弯组织，萎缩性胃炎取胃窦部粘膜苍白和(或)粘膜粗糙呈颗粒状明显的粘膜组织，胃癌组取癌肿处组织，其中10例取癌旁4cm处肉眼观察正常的粘膜组织。每例取标本6块。
1. 放射自显影标本制作及计算标记率[3，4]：胃粘膜标本放入含3H-TdR 5μCi/ml(比放射性20mmol上海原子能研究所提供)的RPMI1640培养液中(pH7.2～7.4购自美国GIBCO公司)，37°C恒温水浴振荡器中孵育30分钟，冰生理盐水冲洗标本3次，用Carnoy's液固定，制病理切片(切片垂直切)，暗室内恒温(18～20°C)用浸膜法涂布核-4乳胶于切片上，曝光2周，显影定影，HE染色。
, 百拇医药
选择胃粘膜纵切面上纵切的腺管，计数500～1000个增殖区细胞及其中的标记细胞，计算标记率：标记率=标记细胞数/增殖区细胞总数×100%
标记细胞是指细胞核上银粒数≥5个的上皮细胞；增殖区细胞是指在胃粘膜纵切面上，标记细胞分布范围内的上皮细胞[3]。
空白对照：组织标本经不含3H-TdR的培养液孵育，同样步骤制片、涂片乳胶、曝光显影定影染色，计数，要求本底小于1个银粒/100μm2。
2. 液闪计数法：所取标本经与放射自显影法相同的孵育后，将标本冲洗3次，吸干，称重，然后放入盛有60%高氯酸，30%过氧化氢各0.2ml试管内，在70～80°C不浴中消化为无色透明液，样品移入液闪测量杯中，加入闪烁液(甲苯1000ml、ppo6g、萘100g)6ml，乙二醇乙醚4ml，摇匀。在LKB1210液闪测量仪上测量(1～2分钟)放射性计数(cpm)，计算出每毫克湿重组织的cpm作为相对放射性单位(cpm/mg组织)。
, 百拇医药
资料处理：计量资料统计学处理用F、t检验，相关性用直线相关分析
结 果
一、各组胃粘膜病变的比放射性比较
正常组均值为308±87cpm/mg，与浅表性胃炎388±129cpm/mg比较差异无显著意义(P〉0.05)。萎缩性胃炎(725±189cpm/mg)和胃癌(982±275cpm/mg)较正常和浅表性胃炎组升高，差异有非常显著意义(P〈0.01)，胃癌与萎缩性胃炎之间差异亦有非常显著意义(P〈0.01)。对10例胃癌病人，测定其癌及癌旁组织的比放射性，癌组织为967±338cpm/mg，癌旁组织为671±171cpm/mg，两者比较差异有非常显著意义(P〈0.01)。
二、液闪法的重复性
对10例病人(CSG2例、CAG6例、和胃癌2例)，3个月复查胃镜，在同一部位取标本再次测定组织比放射性(图1)两次测定结果显著相关，Υ=0.9718(P〈0.05)，说明此方法重复性好。
, http://www.100md.com
第2次(cpm/wg)
图1 两次液闪计数法的重复性测定
三、标记率的测定
正常人均值为10.7±1.5%，浅表性胃炎12.6±2.6%，两者差异无显著意义(P〉0.05)，萎缩性胃炎17.6±2.4，胃癌21±4.0%较正常组和浅表性胃炎组高，差异有非常显著意义(P〈0.01)，胃癌与萎缩性胃炎间差异亦有非常显著意义(P〈0.01)。
四、CAG组伴肠化与非肠化的标记率测定
萎缩性胃炎伴肠化的标记率(18.2±2.1%)，较不伴肠化者(16.5±2.6%)高，差异有显著意义(P〈0.05)。
五、标记细胞的分布
, 百拇医药
标记细胞分布的范围表示为粘膜上皮增殖区的部位，正常及浅表性胃炎增殖区位于腺体颈部和胃不凹基底部(图2)；萎缩性胃炎的粘膜上皮增殖区扩大，向粘膜表面扩展，部分出现粘膜表面增殖现象(图3)；胃粘膜被分化好的肠上皮取代，增殖区位于基底部；肠化上皮分化不好者，增殖区亦向上扩展(图4)；胃癌组织的标记细胞弥散分布于癌细胞群中(图5，6)，胃腺癌还有粘膜表面大量标记细胞聚集现象(图6)。
图2 正常或浅表性胃炎增值区位干基底部HE×100
图3 CAG增值区上移，粘膜表面标记细胞出现HE×100
, 百拇医药
图4 不完全肠化增殖区向上扩展 HE×50
图5 印戒细胞癌标记细胞弥漫分布HE×100
图6 高分化腺癌，粘膜表面大量标记细胞聚集，及标记细胞弥漫分布HE×100
六、液闪计数法与放射自显影法的比较
同时应用液闪法与放射自显影法测定胃粘膜细胞的标记率及比放射性，可以看到组织比放射性随标记率升高而升高。两者密切相关(Υ=0.8702，P〈0.01)。
讨 论
液闪计数法通过测定3H-TdR渗入量反映DNA的合成及细胞增殖。应用两种方法同时测定四组病人的胃粘膜细胞增殖变化。结果基本一致，液闪计数法的重复性也较理想，说明此方法能够较好地测定细胞增殖及DNA合成的能力，该法简便，并能定量，适用于临床研究。
, 百拇医药
目前多数国内外学者认为，从胃炎到胃癌是一个逐渐发展的过程。本文结果表明，从正常胃粘膜、浅表性胃炎、萎缩性胃炎到胃癌，标记率或组织比放射性逐渐升高，胃癌时最高，若将浅表性胃炎，萎缩性胃炎，胃癌看为是同一病理过程的不同发展阶段，则细胞增殖率随胃炎加重而升高，CAG组与GC组接近，结果与文献[3，4]相似。
有报道胃癌病人87.3%伴有萎缩性胃炎[5]，经癌组织及癌旁组织比放射性比较，可以看到癌旁的比放射性(671±171cpm/mg)与萎缩性胃炎(724±189cpm/mg)非常接近，较浅表性胃炎明显升高，说明癌旁组织的DNA合成水平和细胞增殖已接近萎缩性胃炎水平。
本组随萎缩性胃炎的进展，增殖区有逐渐向粘膜表面扩展的趋势，胃癌的增殖细胞弥漫分布，腺癌则有标记细胞在粘膜表面聚集现象。Lipkin等[6]研究表明胃肠癌前病变都有增殖区扩大，粘膜表面有大量标记细胞集中，因此在胃粘膜病变时，粘膜表面有大量标记细胞集中时，要高度警惕胃癌的可能性。
, 百拇医药
参考文献
1. Hansen OH, et al. Cell Proliferation kinetic in normal human gastric mucosa. Gastroenterology 1976；70：1051.
2. Hansen OH, et al. Relationship between gastric acid secretion histopathology and cell proliferation kinetics in human gastric mucosa. Gastroenterology 1977；73：453.
3. Hansen OH, et al. A method to study cell proli-feration kinetics in human gastric mucosa. Gut 1975；16：23.
, 百拇医药
4. 徐永玲，等.慢性胃炎及胃癌的细胞动力学的研究.北京医学院学报 1982；14：7.
5. Matsukura N, et al. Distribution of marker enzyme and musin in the intestinal metaplasia in human stomach and relation of complete and incomplete type of intestinal metaplasia to gastric carcinoma. JNCL. 1980；65：231.
6. Lipkin M, et al. Early proliferative chang in intestinal cell. Cancer Res 1976；36：2665.
Δ 现在广东省南海县人民医院
(1990年1月9日收稿 同年5月4日修回), 百拇医药
单位：(广州，中山医科大学第一附属医院内科 510089)
关键词：
体外3H
体外3H-TdR渗入法是研究胃肠道粘膜细胞动力学的重要方法之一[1，2]，3H-TdR作为DNA合成的前体，其渗入量可代表细胞增殖的速度或处于增殖周期细胞的多少；60年代至今，观察组织DNA合成水平及细胞增殖变化多用放射自显影法，该法繁锁、费时，细胞计数量大，使临床应用受到限制。为此，我们应用液闪计数法测定3H-TdR渗入量，了解细胞增殖或DNA合成水平，并采用两种方法对慢性胃炎、胃癌的3H-TdR渗入细胞动力学进行观察，探讨萎缩性胃炎与胃癌的关系及液闪计数法的应用。
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对象与方法
一、对象
慢性浅表性胃炎21例(CSG组)，萎缩性胃炎35例伴肠化22例(CAG组)，胃癌23例(GC组)。全部病人为我院住院及门诊者，均经胃镜及病理检查确诊。对照组20例为无消化道疾病的健康自愿者。
二、方法
取材：浅表性胃炎及对照组取幽门前3cm胃窦小弯组织，萎缩性胃炎取胃窦部粘膜苍白和(或)粘膜粗糙呈颗粒状明显的粘膜组织，胃癌组取癌肿处组织，其中10例取癌旁4cm处肉眼观察正常的粘膜组织。每例取标本6块。
1. 放射自显影标本制作及计算标记率[3，4]：胃粘膜标本放入含3H-TdR 5μCi/ml(比放射性20mmol上海原子能研究所提供)的RPMI1640培养液中(pH7.2～7.4购自美国GIBCO公司)，37°C恒温水浴振荡器中孵育30分钟，冰生理盐水冲洗标本3次，用Carnoy's液固定，制病理切片(切片垂直切)，暗室内恒温(18～20°C)用浸膜法涂布核-4乳胶于切片上，曝光2周，显影定影，HE染色。
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选择胃粘膜纵切面上纵切的腺管，计数500～1000个增殖区细胞及其中的标记细胞，计算标记率：标记率=标记细胞数/增殖区细胞总数×100%
标记细胞是指细胞核上银粒数≥5个的上皮细胞；增殖区细胞是指在胃粘膜纵切面上，标记细胞分布范围内的上皮细胞[3]。
空白对照：组织标本经不含3H-TdR的培养液孵育，同样步骤制片、涂片乳胶、曝光显影定影染色，计数，要求本底小于1个银粒/100μm2。
2. 液闪计数法：所取标本经与放射自显影法相同的孵育后，将标本冲洗3次，吸干，称重，然后放入盛有60%高氯酸，30%过氧化氢各0.2ml试管内，在70～80°C不浴中消化为无色透明液，样品移入液闪测量杯中，加入闪烁液(甲苯1000ml、ppo6g、萘100g)6ml，乙二醇乙醚4ml，摇匀。在LKB1210液闪测量仪上测量(1～2分钟)放射性计数(cpm)，计算出每毫克湿重组织的cpm作为相对放射性单位(cpm/mg组织)。
, 百拇医药
资料处理：计量资料统计学处理用F、t检验，相关性用直线相关分析
结 果
一、各组胃粘膜病变的比放射性比较
正常组均值为308±87cpm/mg，与浅表性胃炎388±129cpm/mg比较差异无显著意义(P〉0.05)。萎缩性胃炎(725±189cpm/mg)和胃癌(982±275cpm/mg)较正常和浅表性胃炎组升高，差异有非常显著意义(P〈0.01)，胃癌与萎缩性胃炎之间差异亦有非常显著意义(P〈0.01)。对10例胃癌病人，测定其癌及癌旁组织的比放射性，癌组织为967±338cpm/mg，癌旁组织为671±171cpm/mg，两者比较差异有非常显著意义(P〈0.01)。
二、液闪法的重复性
对10例病人(CSG2例、CAG6例、和胃癌2例)，3个月复查胃镜，在同一部位取标本再次测定组织比放射性(图1)两次测定结果显著相关，Υ=0.9718(P〈0.05)，说明此方法重复性好。
, http://www.100md.com
第2次(cpm/wg)
图1 两次液闪计数法的重复性测定
三、标记率的测定
正常人均值为10.7±1.5%，浅表性胃炎12.6±2.6%，两者差异无显著意义(P〉0.05)，萎缩性胃炎17.6±2.4，胃癌21±4.0%较正常组和浅表性胃炎组高，差异有非常显著意义(P〈0.01)，胃癌与萎缩性胃炎间差异亦有非常显著意义(P〈0.01)。
四、CAG组伴肠化与非肠化的标记率测定
萎缩性胃炎伴肠化的标记率(18.2±2.1%)，较不伴肠化者(16.5±2.6%)高，差异有显著意义(P〈0.05)。
五、标记细胞的分布
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标记细胞分布的范围表示为粘膜上皮增殖区的部位，正常及浅表性胃炎增殖区位于腺体颈部和胃不凹基底部(图2)；萎缩性胃炎的粘膜上皮增殖区扩大，向粘膜表面扩展，部分出现粘膜表面增殖现象(图3)；胃粘膜被分化好的肠上皮取代，增殖区位于基底部；肠化上皮分化不好者，增殖区亦向上扩展(图4)；胃癌组织的标记细胞弥散分布于癌细胞群中(图5，6)，胃腺癌还有粘膜表面大量标记细胞聚集现象(图6)。
图2 正常或浅表性胃炎增值区位干基底部HE×100
图3 CAG增值区上移，粘膜表面标记细胞出现HE×100
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图4 不完全肠化增殖区向上扩展 HE×50
图5 印戒细胞癌标记细胞弥漫分布HE×100
图6 高分化腺癌，粘膜表面大量标记细胞聚集，及标记细胞弥漫分布HE×100
六、液闪计数法与放射自显影法的比较
同时应用液闪法与放射自显影法测定胃粘膜细胞的标记率及比放射性，可以看到组织比放射性随标记率升高而升高。两者密切相关(Υ=0.8702，P〈0.01)。
讨 论
液闪计数法通过测定3H-TdR渗入量反映DNA的合成及细胞增殖。应用两种方法同时测定四组病人的胃粘膜细胞增殖变化。结果基本一致，液闪计数法的重复性也较理想，说明此方法能够较好地测定细胞增殖及DNA合成的能力，该法简便，并能定量，适用于临床研究。
, 百拇医药
目前多数国内外学者认为，从胃炎到胃癌是一个逐渐发展的过程。本文结果表明，从正常胃粘膜、浅表性胃炎、萎缩性胃炎到胃癌，标记率或组织比放射性逐渐升高，胃癌时最高，若将浅表性胃炎，萎缩性胃炎，胃癌看为是同一病理过程的不同发展阶段，则细胞增殖率随胃炎加重而升高，CAG组与GC组接近，结果与文献[3，4]相似。
有报道胃癌病人87.3%伴有萎缩性胃炎[5]，经癌组织及癌旁组织比放射性比较，可以看到癌旁的比放射性(671±171cpm/mg)与萎缩性胃炎(724±189cpm/mg)非常接近，较浅表性胃炎明显升高，说明癌旁组织的DNA合成水平和细胞增殖已接近萎缩性胃炎水平。
本组随萎缩性胃炎的进展，增殖区有逐渐向粘膜表面扩展的趋势，胃癌的增殖细胞弥漫分布，腺癌则有标记细胞在粘膜表面聚集现象。Lipkin等[6]研究表明胃肠癌前病变都有增殖区扩大，粘膜表面有大量标记细胞集中，因此在胃粘膜病变时，粘膜表面有大量标记细胞集中时，要高度警惕胃癌的可能性。
, 百拇医药
参考文献
1. Hansen OH, et al. Cell Proliferation kinetic in normal human gastric mucosa. Gastroenterology 1976；70：1051.
2. Hansen OH, et al. Relationship between gastric acid secretion histopathology and cell proliferation kinetics in human gastric mucosa. Gastroenterology 1977；73：453.
3. Hansen OH, et al. A method to study cell proli-feration kinetics in human gastric mucosa. Gut 1975；16：23.
, 百拇医药
4. 徐永玲，等.慢性胃炎及胃癌的细胞动力学的研究.北京医学院学报 1982；14：7.
5. Matsukura N, et al. Distribution of marker enzyme and musin in the intestinal metaplasia in human stomach and relation of complete and incomplete type of intestinal metaplasia to gastric carcinoma. JNCL. 1980；65：231.
6. Lipkin M, et al. Early proliferative chang in intestinal cell. Cancer Res 1976；36：2665.
Δ 现在广东省南海县人民医院
(1990年1月9日收稿 同年5月4日修回), 百拇医药