牛下丘脑钠、钾三磷酸腺苷酶抑制因子的研究*
作者：符云峰 李素琴 张世联 王薇
单位：河北省医学科学院实验医学研究所生物化学研究室**
关键词：腺苷三磷酸酶，钠、钾；离子；输送；下丘脑
中华医学杂志900807
摘要 用酸性丙酮从牛下丘脑成功地提取了内源性哇巴因样物质，经Sephadex-G25层析及混合床树脂脱盐，达到部分纯化。生物活性测试证明该提取物对肾外髓钠、钾三磷酸腺苷酶(Na+-泵)、红细胞36Rb摄取率、小动脉血管平滑肌细胞Na+外流及哇巴团结合率具有明显的抑制作用，是一种活力强而特异的Na+-泵抑制因子。并就该抑制因子对细胞膜钠、钾三磷酸腺苷酶活性的调节作用及在原发性高血压发病机理中的病理生理作用进行了讨论。
, 百拇医药
已知哺乳动物下丘脑富含钠、钾三磷酸腺苷[(Na++K+-ATP)]酶抑制因子[1]。在体内Na+水平增加或血浆容量扩张时，该因子生成增加，释入体循环血中的量也增加，出现利纳尿效应和血管收缩反应增强[2]。这种内源性物质是一种类似哇巴因的化合物，能够明显抑制(Na++K+)-ATP酶活性和细胞质膜Na+、K+和Na2+主动性运输。本文报告我们从牛下丘脑提取和部分纯化的(Na++K+)-ATP酶抑制因子对(Na+-+K+)-ATP酶活性和Na+、K+离子运输的影响的研究结果，并对其作用性质进行了议论。
材料和方法
, http://www.100md.com 1.(Na++K+)-ATP酶抑制因子分离和纯化：牛屠宰后，立即劈颅取出下丘脑置于干冰冷冻，在-20°C保存。收集达一定数量后，将组织融化，用丙酮/盐酸制成匀浆，过滤后按Lichtstein等[3]方法先后用丙酮/水(80/20)及甲醇提取其沉渣。所得提取物再通过0.5 mol/L乙酸平衡的Sephadex-25柱及用0.1mol/L乙酸平衡的混合床树脂柱层析纯化。
2. 分离小动脉血管：采用雄性WKY大鼠，氮气致死后，立即开腹，自十二指肠末端切取上部小肠置生理盐水中，在显微镜下分离肠系膜上动脉第二、三分枝，长3～4mm，内径约200μm，穿人直径为40μm的不锈钢丝。
3. 溶液制备：用于节段血管保温用的生理盐水(PSS)含有以下成分(浓度均为mmol/L)：NaCl119；KCl4.7；NaHC03 25；KH2P04 1.18；MgS04 1.17；CaC12 1.6；EDTA 0.026；葡萄糖5.5。含K+的生理盐水是以KCl代替NaCl，及含CaCl22.5。无K+的生理盐水(K+-Free PSS)是以NaCl和NaH2PO4代替KCl和KH2P04。含Li+的生理盐水(Li+-PSS)是以LiCl l07和LiC03 25代替NaCl和NaHC03。含22Na(英国Amersham，放射化学中心)的生理盐水(22Na-PSS)，比活性0.63 Ci*mol-1。除22Na一PSS外，所有的溶液经通入含5%CO2的O2气泡，调至pH7.4。含22Na-PSS的锥形小塑料管置于37°C循环水中，通入含5%C02的O2气。
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4.测定(Na++K+)-ATP酶活性：按Jorgensen[4]方法从家兔肾外髓制备(Na++K+)-ATP酶。按我们报道的方法[5]测定(Na++K+)-ATP酶活性，唯在反应介质中加一定量的(Na++K+)-ATP酶抑制因子提取物。
5. 测定86Rb摄取率：按Swarts等[6]方法制备新鲜人红细胞。取一定容量的红细胞悬液(内含15%红细胞)与一定容量的含有不同浓度的(Na++K+)-ATP酶抑制因子的Krebs一Ringer磷酸盐溶液(浓度均为mmol/L)：NaCl 150； MgCl2；EDTA 0.1；葡萄糖 5；Tris一HCl 10；pH 7.4。37°C预保温15分钟后加入86Rb，使其浓度达5mmol/L，保温40分钟(期间不时摇动)后，迅速移人冰浴中，加150 mmo1/L氯化胆碱，0.3mmol/L哇巴因溶液洗涤3次，最后一次沉淀加入双蒸水使红细胞溶解，混匀，用γ-计数仪测定放射性。以反应液中有和无0.3 mmol/L哇巴因，所得数值之差计算86Rb摄取串，以nmol/mi*min-1表示。
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6. 小动脉血管平滑肌细胞Na+外流测定：按Aalkjaer等[7]方法切取的血管节段，置于含50μl22Na-PSS的锥形小塑料管内，37°C保温30分钟。然后顺序经过一系列(1，3，5，7，9， 11和13分钟)含750μlPSS(1.6mmol/L Ca2+)的小塑管进行洗涤，最后放入含双蒸水的小管内洗涤，加入闪烁液。测定最后4管含PSS及含有血管节段的蒸馏水的放射活性。
7. 3H哇巴因与小动脉血管结合率：按Aalkjaer等[7]方法，将切取的3mm长的肠系膜小动脉节段穿入两条直径为40μm的不锈钢丝上，浸于37°C PSS中，在光学显微镜下测定血管平滑肌细胞容积后，在无K+-PSS中37°C预保温60分钟，然后分别移入5μl含有 1μmol/L 3H哇巴因(18Ci/mmol)无K+-PSS 及50μl含有1μmol/L 3H哇巴困和一定量的下丘脑(Na++K+)-ATP酶抑制因子提取物的无K+-PSS，于37°C保温60分钟。取出后在0°C经一系列含有无K+-PSS的小塑管洗涤共计120分钟。最后将血管节段脱落入含双蒸水的小塑管内，加入闪烁液，于液闪仪(MarkⅢ，6880型Searle Analytic Inc)计数。
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结 果
1. 牛下丘脑提取物：将冻干的牛下丘脑提取物溶解加至Sephadex-G25凝胶层析柱，分部收集的洗脱液，于核酸蛋白测定仪波长280nm记录吸收峰(A 280 nm)(图1)。将该吸收峰域各管洗脱液冷冻干燥后溶解移至混合床树脂柱脱盐，同样于280 nm记录分部收集的洗脱液吸收峰(图1)。
管号
图1 下丘脑提取物经Sephadex-G25层析(a)
及混合床树脂脱盐后(b)的洗脱液A280吸收峰
2. 对肾脏(Na++K+)-ATP酶活性的抑制效应：不同浓度的下丘脑提取物和哇巴因，分别与纯化制备的家兔肾外髓(Na++K+)-ATP酶保温，显示对该酶活性直接的剂量依赖性抑制效应。当提取物和哇巴因共同与酶保温时，呈相加性抑制效应，明显大于两者单独作用于酶时的抑制程度(图2)。
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图2 不同浓度的下丘脑提取物和哇巴因对家兔肾外髓(Na++K+)-ATP酶活性的抑制效应
3. 对人红细胞86Rb摄取率的影响：同一提取物对红细胞86Rb摄取率呈现明显的剂量依赖性抑制曲线(图3)，与对肾脏(Na++K+)-ATP酶活性的抑制曲线是一致的。
下丘脑提取物
图3 不同浓度下丘脑提取物对人红细胞86Rb摄取率的影响
4. 对大鼠肠系膜小动脉血管Na+外流的影响：一定量的下丘脑提取物和哇巴因与大鼠肠系膜小动脉血管节段保温，6分钟后小血管Na+外流逐渐减少，当两者共同与血管节段保温时，呈相加性抑制Na+外流的效应，而生理盐水对Na+外流无任何影响(图4)。
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图4 下丘脑提取物对大鼠肠系膜小动脉血管节段Na+外流的影响
5. 对大鼠肠系膜小动脉血管哇巴因结合率的影响：以一定量的下丘脑提取物加入含3H哇巴因(1μmoi/L)与大鼠肠系膜小动脉血管节段的无K+-PSS保温介质中，并以无K+-PSS为对照， 于37°C保温60分钟。结果显示，加提取物的小动脉血管节段3H哇巴因结合率为14.63±0.80μmol/L细胞，对照组为17.81±1.15μmol/L细胞，两组比较差异有显著意义(P<0.01)，明显抑制哇巴因与细胞结合。
讨 论
本研究证明，牛下丘脑提取物中存在一种稳定的活性物质，对各组织细胞膜(Na++K+)-ATP酶活性和一价阳离子运输具有明显的抑制作用，其作用方式与(Na++K+)-ATP酶特异性抑制剂哇巴因类似[1]。该抑制因子明显抑制哇巴因与其细胞结合位点相结合，表现其对膜(Na++K+)-ATP酶的亲和性高于哇巴因，与Carilli等[8]的研究结论一致。这种抑制作用是与哇巴因直接竞争结合位点而产生的，还是间接地减低哇巴因对其结合位点的结合能力，尚需进一步研究。以往多数以红细胞、肾小管、蟾蜍膀胱以及自肾外髓或脑组织纯化制备的(Na++K+)-ATP酶为材料进行研究，我们不仅采用人红细胞和纯化制备的家兔肾外髓(Na++K+)-ATP酶为研究材料，取得了下丘脑(Na++K+)-ATP酶抑制因子明显抑制(Na++K+)-ATP酶活性和86Rbck+)主动性运输的证据；并以大鼠肠系膜小动脉为材料，明确了该抑制因子对小动脉壁平滑肌细胞Na+泵活性起同样的抑制作用。这对于阐明(Na++K+)-ATP酶抑制因子在原发性高血压发病机理中的作用具有重要意义。因为按Wardener等[9]的假设，在循环血中的(Na++K+)-ATP酶抑制因子水平增高，通过其抑制小动脉壁平滑肌细胞Na+泵活性而增加细胞内Na+含量，Na+-Ca2+交换减少，细胞内Ca2+含量增加。因而血管张力及总外周阻力增加，形成和保持慢性高血压状态[10]。
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本文大鼠肠系膜小动脉血管Na+外流及3H哇巴因结合率实验系第一作者在丹麦奥尔胡斯(Aarhus)大学生物物理系高血压研究组进修期间完成，得到C.Aalkjaer博士热诚帮助，特此志谢
参考文献
1.Haupert GT Jr.Characteristics of the Na，K-ATPase inhibitor from hypothalamus. Prog Biochem Pharmacol 1988；23：10.
2. Poston L. Endogenous sodium pump inhibitors: a role in essential hypertensions. Clin Sci 1987；72：647.
3. Lichtstein D,Samuelov S.Endogenous ouabain like' activity in rat brain. Biochem Biophys Res Commun 1980；96：1518.
, 百拇医药
4. Jorgensen PL.Purification and characterization of (Na+ plus K+)-ATPase. 3. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by sodium do-decylsulphate. Biochem Biophys Acta 1974；356：36.
5. Fu YF, et al. Gossypol inhibition of kidney (Na++K+)-ATPase. Chin Med J [Engl]1987；100：921.
6. Swarts HG, Ht al. Cation fluxes and Na+-K+ activated ATPase activity in erythrocytes of patients with essential hypertension Hypertension 1981；3：641.
, http://www.100md.com
7. Aalkjaer C,Mulvany MJ. Sodium metabolism in rat resistance vessels. J Physiol(Lond)1983；343：105.
8. Carilli CT, et al. Hypothalamic factor inhibits the (Na,K)-ATPase from the extracellular surface: mechanism of inhibition J Biol Chem 1985；260：1027.
9. De Wardener HE,MacGregor GA Dahl's hypothesis that a saluretic substance may be responsible for a sustained rise in arterial pressure: its possible role in essential hypertension. Kidney Int 1980；18：1.
10. Mulvany MJ. Changes in sodium pump activity and vascular contraction. J Hypertens 1985；3：429.
(1989年9月20日收稿 1990年4月29日修回), 百拇医药
单位：河北省医学科学院实验医学研究所生物化学研究室**
关键词：腺苷三磷酸酶，钠、钾；离子；输送；下丘脑
中华医学杂志900807
摘要 用酸性丙酮从牛下丘脑成功地提取了内源性哇巴因样物质，经Sephadex-G25层析及混合床树脂脱盐，达到部分纯化。生物活性测试证明该提取物对肾外髓钠、钾三磷酸腺苷酶(Na+-泵)、红细胞36Rb摄取率、小动脉血管平滑肌细胞Na+外流及哇巴团结合率具有明显的抑制作用，是一种活力强而特异的Na+-泵抑制因子。并就该抑制因子对细胞膜钠、钾三磷酸腺苷酶活性的调节作用及在原发性高血压发病机理中的病理生理作用进行了讨论。
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已知哺乳动物下丘脑富含钠、钾三磷酸腺苷[(Na++K+-ATP)]酶抑制因子[1]。在体内Na+水平增加或血浆容量扩张时，该因子生成增加，释入体循环血中的量也增加，出现利纳尿效应和血管收缩反应增强[2]。这种内源性物质是一种类似哇巴因的化合物，能够明显抑制(Na++K+)-ATP酶活性和细胞质膜Na+、K+和Na2+主动性运输。本文报告我们从牛下丘脑提取和部分纯化的(Na++K+)-ATP酶抑制因子对(Na+-+K+)-ATP酶活性和Na+、K+离子运输的影响的研究结果，并对其作用性质进行了议论。
材料和方法
, http://www.100md.com 1.(Na++K+)-ATP酶抑制因子分离和纯化：牛屠宰后，立即劈颅取出下丘脑置于干冰冷冻，在-20°C保存。收集达一定数量后，将组织融化，用丙酮/盐酸制成匀浆，过滤后按Lichtstein等[3]方法先后用丙酮/水(80/20)及甲醇提取其沉渣。所得提取物再通过0.5 mol/L乙酸平衡的Sephadex-25柱及用0.1mol/L乙酸平衡的混合床树脂柱层析纯化。
2. 分离小动脉血管：采用雄性WKY大鼠，氮气致死后，立即开腹，自十二指肠末端切取上部小肠置生理盐水中，在显微镜下分离肠系膜上动脉第二、三分枝，长3～4mm，内径约200μm，穿人直径为40μm的不锈钢丝。
3. 溶液制备：用于节段血管保温用的生理盐水(PSS)含有以下成分(浓度均为mmol/L)：NaCl119；KCl4.7；NaHC03 25；KH2P04 1.18；MgS04 1.17；CaC12 1.6；EDTA 0.026；葡萄糖5.5。含K+的生理盐水是以KCl代替NaCl，及含CaCl22.5。无K+的生理盐水(K+-Free PSS)是以NaCl和NaH2PO4代替KCl和KH2P04。含Li+的生理盐水(Li+-PSS)是以LiCl l07和LiC03 25代替NaCl和NaHC03。含22Na(英国Amersham，放射化学中心)的生理盐水(22Na-PSS)，比活性0.63 Ci*mol-1。除22Na一PSS外，所有的溶液经通入含5%CO2的O2气泡，调至pH7.4。含22Na-PSS的锥形小塑料管置于37°C循环水中，通入含5%C02的O2气。
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4.测定(Na++K+)-ATP酶活性：按Jorgensen[4]方法从家兔肾外髓制备(Na++K+)-ATP酶。按我们报道的方法[5]测定(Na++K+)-ATP酶活性，唯在反应介质中加一定量的(Na++K+)-ATP酶抑制因子提取物。
5. 测定86Rb摄取率：按Swarts等[6]方法制备新鲜人红细胞。取一定容量的红细胞悬液(内含15%红细胞)与一定容量的含有不同浓度的(Na++K+)-ATP酶抑制因子的Krebs一Ringer磷酸盐溶液(浓度均为mmol/L)：NaCl 150； MgCl2；EDTA 0.1；葡萄糖 5；Tris一HCl 10；pH 7.4。37°C预保温15分钟后加入86Rb，使其浓度达5mmol/L，保温40分钟(期间不时摇动)后，迅速移人冰浴中，加150 mmo1/L氯化胆碱，0.3mmol/L哇巴因溶液洗涤3次，最后一次沉淀加入双蒸水使红细胞溶解，混匀，用γ-计数仪测定放射性。以反应液中有和无0.3 mmol/L哇巴因，所得数值之差计算86Rb摄取串，以nmol/mi*min-1表示。
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6. 小动脉血管平滑肌细胞Na+外流测定：按Aalkjaer等[7]方法切取的血管节段，置于含50μl22Na-PSS的锥形小塑料管内，37°C保温30分钟。然后顺序经过一系列(1，3，5，7，9， 11和13分钟)含750μlPSS(1.6mmol/L Ca2+)的小塑管进行洗涤，最后放入含双蒸水的小管内洗涤，加入闪烁液。测定最后4管含PSS及含有血管节段的蒸馏水的放射活性。
7. 3H哇巴因与小动脉血管结合率：按Aalkjaer等[7]方法，将切取的3mm长的肠系膜小动脉节段穿入两条直径为40μm的不锈钢丝上，浸于37°C PSS中，在光学显微镜下测定血管平滑肌细胞容积后，在无K+-PSS中37°C预保温60分钟，然后分别移入5μl含有 1μmol/L 3H哇巴因(18Ci/mmol)无K+-PSS 及50μl含有1μmol/L 3H哇巴困和一定量的下丘脑(Na++K+)-ATP酶抑制因子提取物的无K+-PSS，于37°C保温60分钟。取出后在0°C经一系列含有无K+-PSS的小塑管洗涤共计120分钟。最后将血管节段脱落入含双蒸水的小塑管内，加入闪烁液，于液闪仪(MarkⅢ，6880型Searle Analytic Inc)计数。
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结 果
1. 牛下丘脑提取物：将冻干的牛下丘脑提取物溶解加至Sephadex-G25凝胶层析柱，分部收集的洗脱液，于核酸蛋白测定仪波长280nm记录吸收峰(A 280 nm)(图1)。将该吸收峰域各管洗脱液冷冻干燥后溶解移至混合床树脂柱脱盐，同样于280 nm记录分部收集的洗脱液吸收峰(图1)。
管号
图1 下丘脑提取物经Sephadex-G25层析(a)
及混合床树脂脱盐后(b)的洗脱液A280吸收峰
2. 对肾脏(Na++K+)-ATP酶活性的抑制效应：不同浓度的下丘脑提取物和哇巴因，分别与纯化制备的家兔肾外髓(Na++K+)-ATP酶保温，显示对该酶活性直接的剂量依赖性抑制效应。当提取物和哇巴因共同与酶保温时，呈相加性抑制效应，明显大于两者单独作用于酶时的抑制程度(图2)。
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图2 不同浓度的下丘脑提取物和哇巴因对家兔肾外髓(Na++K+)-ATP酶活性的抑制效应
3. 对人红细胞86Rb摄取率的影响：同一提取物对红细胞86Rb摄取率呈现明显的剂量依赖性抑制曲线(图3)，与对肾脏(Na++K+)-ATP酶活性的抑制曲线是一致的。
下丘脑提取物
图3 不同浓度下丘脑提取物对人红细胞86Rb摄取率的影响
4. 对大鼠肠系膜小动脉血管Na+外流的影响：一定量的下丘脑提取物和哇巴因与大鼠肠系膜小动脉血管节段保温，6分钟后小血管Na+外流逐渐减少，当两者共同与血管节段保温时，呈相加性抑制Na+外流的效应，而生理盐水对Na+外流无任何影响(图4)。
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图4 下丘脑提取物对大鼠肠系膜小动脉血管节段Na+外流的影响
5. 对大鼠肠系膜小动脉血管哇巴因结合率的影响：以一定量的下丘脑提取物加入含3H哇巴因(1μmoi/L)与大鼠肠系膜小动脉血管节段的无K+-PSS保温介质中，并以无K+-PSS为对照， 于37°C保温60分钟。结果显示，加提取物的小动脉血管节段3H哇巴因结合率为14.63±0.80μmol/L细胞，对照组为17.81±1.15μmol/L细胞，两组比较差异有显著意义(P<0.01)，明显抑制哇巴因与细胞结合。
讨 论
本研究证明，牛下丘脑提取物中存在一种稳定的活性物质，对各组织细胞膜(Na++K+)-ATP酶活性和一价阳离子运输具有明显的抑制作用，其作用方式与(Na++K+)-ATP酶特异性抑制剂哇巴因类似[1]。该抑制因子明显抑制哇巴因与其细胞结合位点相结合，表现其对膜(Na++K+)-ATP酶的亲和性高于哇巴因，与Carilli等[8]的研究结论一致。这种抑制作用是与哇巴因直接竞争结合位点而产生的，还是间接地减低哇巴因对其结合位点的结合能力，尚需进一步研究。以往多数以红细胞、肾小管、蟾蜍膀胱以及自肾外髓或脑组织纯化制备的(Na++K+)-ATP酶为材料进行研究，我们不仅采用人红细胞和纯化制备的家兔肾外髓(Na++K+)-ATP酶为研究材料，取得了下丘脑(Na++K+)-ATP酶抑制因子明显抑制(Na++K+)-ATP酶活性和86Rbck+)主动性运输的证据；并以大鼠肠系膜小动脉为材料，明确了该抑制因子对小动脉壁平滑肌细胞Na+泵活性起同样的抑制作用。这对于阐明(Na++K+)-ATP酶抑制因子在原发性高血压发病机理中的作用具有重要意义。因为按Wardener等[9]的假设，在循环血中的(Na++K+)-ATP酶抑制因子水平增高，通过其抑制小动脉壁平滑肌细胞Na+泵活性而增加细胞内Na+含量，Na+-Ca2+交换减少，细胞内Ca2+含量增加。因而血管张力及总外周阻力增加，形成和保持慢性高血压状态[10]。
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本文大鼠肠系膜小动脉血管Na+外流及3H哇巴因结合率实验系第一作者在丹麦奥尔胡斯(Aarhus)大学生物物理系高血压研究组进修期间完成，得到C.Aalkjaer博士热诚帮助，特此志谢
参考文献
1.Haupert GT Jr.Characteristics of the Na，K-ATPase inhibitor from hypothalamus. Prog Biochem Pharmacol 1988；23：10.
2. Poston L. Endogenous sodium pump inhibitors: a role in essential hypertensions. Clin Sci 1987；72：647.
3. Lichtstein D,Samuelov S.Endogenous ouabain like' activity in rat brain. Biochem Biophys Res Commun 1980；96：1518.
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4. Jorgensen PL.Purification and characterization of (Na+ plus K+)-ATPase. 3. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by sodium do-decylsulphate. Biochem Biophys Acta 1974；356：36.
5. Fu YF, et al. Gossypol inhibition of kidney (Na++K+)-ATPase. Chin Med J [Engl]1987；100：921.
6. Swarts HG, Ht al. Cation fluxes and Na+-K+ activated ATPase activity in erythrocytes of patients with essential hypertension Hypertension 1981；3：641.
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7. Aalkjaer C,Mulvany MJ. Sodium metabolism in rat resistance vessels. J Physiol(Lond)1983；343：105.
8. Carilli CT, et al. Hypothalamic factor inhibits the (Na,K)-ATPase from the extracellular surface: mechanism of inhibition J Biol Chem 1985；260：1027.
9. De Wardener HE,MacGregor GA Dahl's hypothesis that a saluretic substance may be responsible for a sustained rise in arterial pressure: its possible role in essential hypertension. Kidney Int 1980；18：1.
10. Mulvany MJ. Changes in sodium pump activity and vascular contraction. J Hypertens 1985；3：429.
(1989年9月20日收稿 1990年4月29日修回), 百拇医药