正常人及先天性肾上腺皮质增生症患者21-羟化酶基因的变异研究
作者：潘星时 陈磊 沈永年 冯伟军 钱大龙 郭华 张美华 张雅芬 陈瑞冠 陈中孚
单位：潘星时 陈磊 沈永年 冯伟军 钱大龙(上海市儿科医学研究所，200092)；郭华 张美华 张雅芬 陈瑞冠(复旦大学遗传学研究所)陈中孚
关键词：羟化酶类；染色体缺失；基因重叠；肾上腺皮质疾病
中华医学杂志910606
摘要 用21羟化酶基因的cDNA pC21/3C作探针，对40名正常人及18例先天性肾上腺皮质增生症患者16个家系的血DNA进行Southern杂交分析。发现在正常人群中，功能基因的拷贝数无变异，假基因的拷贝数有较多变异；在16个本症家系中，患者功能基因缺失率为19%，假基因的变异与正常人无差异。并利用该基因的变异，对1例患者之弟作出了明确的基因诊断。
, http://www.100md.com 先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一种较常见的遗传性代谢病。其中95%病例是由于肾上腺皮质21-羟化酶(21-OH)(EC1.14.99.10)缺乏所致。21-HO基因位于第6号染色体短臂HLA基因族区域[1]，分为A基因(21-OHA)及B基因(21-OHB)，后者编码具有活性的酶，前者则为假基因[2]。
国外已有人用DNA经限制性内切酶TapI消化，并用21-OH cDNA作探针进行杂交后，产生3.2kb及3.7kb两条带，分别对应于A、B基因的报道[3]。作者应用该项分子生物学技术，分析了中国人群中40名正常人和16例CAH患者及家系成员血DNA的杂交结果，就21-OH基因的高度变异及变异的多样性进行比较，以期探讨中国人群中CAH发生的遗传机理和特点，并为该症的基因诊断提供信息。
材料与方法
1、DNA样品来源：正常中国人40名。CAH患者18例，来自16个家系，均长期在我所随访。临床除家系6、14及16例 ，均为失盐型。此外，还包括患者亲代及1例患者的弟弟(家系10)共32例。各取全血5ml含0.1mol/L EDTA的抗凝管中，按照文献[4]方法抽提DNA。
, 百拇医药
2、21-OH基因探针的制备：用作21-OH基因探针的质粒pC21/3C，系美国Connell大学医学院White教授赠送[4]。按文献[5]介绍方法分离该质粒中的2.1kb片段，该片段包括21-OH基因接近全部的cDNA。用缺口平移法以[α-32P]dATP标记探针。探针的比放射性为1～3×108cpm/μg。
3、Southern杂交分析：取8μgDNA，用限制性内切酶TaqI消化，按文献[5]方法进行电泳、杂交及放射自显影。
经Southern杂交后，可观察到3.7kb和3.2kb两条带，分别对应于21-OHB和21-OHA基因。在正常情况下，A、B基因分别有2份拷贝。当一个基因缺失或重复时，对应的杂交带将明显的减弱或增强。肉眼判断带的相对密度：(+)表示明显减弱，对应于基因缺失一份；(++)表示正常；(+++)表示明显增强，对应于基因重复一份；(-)表示无该片段，对应于基因纯合子缺失(附图)。所得结果均经两次重复确定。
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附图 Southern杂交结果及其对应杂交带密度
结 果
1、正常人Southern杂交结果：假基因A对应的3.2kb片段有较多变异，而功能基因B对应的3.7kb片段无变异。基中，3.2kb片段的变异有：4名呈(+++)，为A基因重复；6名呈(+)，为A基因缺失杂合子；1名呈(-)，为A基因缺失纯合子；另1名有额外的5.6kb片段，经查来自父系。
2、16例CAH家系杂交结果(附表)：来源于16个家系的18例患者分析，假基因A对应的3.2kb片段及功能基因B对应的3.7kb片段均有较多变异，后者的变异更多，主要表现为基因缺失。基中3.7kb片段的变异有：1例呈(+++)(家系6)，为B基因重复；6例呈(+)(家系1～5及10)，为B基因缺失杂合子。因此，32个失活基因中，基因缺失的比例为19%。3.2kb片段的变异有：3例呈(+++)(家系2、3、10)，为A基因重复；1例呈(+)(家系7)，为A基因缺失杂合子；1例有额外的5.6kb片段(家系1)。患者基因的变异均可追溯到亲代。患者的亲代中，也存在未遗传给患者的正常变异。包括1例B基因重复(家系1母)，其余均为A基因的变异，1例A基因重复(家系1父)，1例A基因纯合子缺失(家系6父)，2例A基因缺失杂合子(家系8、9母)。
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3、1例患者之弟的基因诊断：经分析确知家系10患者为B基因缺失杂合子，而患者之弟B基因无变化 。因此，我们肯定后者属正常。
附表 CAH患者家系1～10 Southern杂交结果 家系
患者
父亲
母亲
3.7kb
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注：家系11～16所有结果均为++，未列出；* 患者及母均有额外5.6kb片段；** 该家系母亲样品缺如，所示结果为患者之弟
讨 论
1、21-OHB基因的变异：本组40名正常人的B基因均无变化，而来自16个家系的18例患者中，有6例B基因缺失杂合子，占失活基因的19%。国外报道[6，7]白种人群为25%，略高于我们的结果，此种差异可能是由于种族差异或病例数较少造成。本组患者19%的基因缺失是导致基因功能丧失的原因之一，大多数患者的B基因经TaqI酶切后片段无变化，其失活原因可能是基因转变或点突变所致[8]。
2、21-OH A基因的变异：无论正常人或患者，21-OH A基因均有较多变异。本组40名正常人与18例患者家系成员中，各有1例A基因缺失纯合子，也存在相当数量的基因重复及缺失杂合子。这与国外关于A基因拷贝数变异较多的报道[9]相一致 。A基因的这种较普遍的变异显然与其为假基因有关，它的各种变异容易在群体中累积。
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3、额外的5.6kb片段来源：在40名正常人及18例患者家系中，各发现一名正常人及一个患者家系存在一条未见报道的5.6kb片段。根据已知的21-OH基因及邻近区域的DNA酶切图谱，我们推测该片段是因A基因3'端的一个TaqI切点消失，从而使原3.2kb片段向3'端延伸2.4kb所致。
4、基因诊断：本组发现21-OH基因的各种变异，包括A、B基因的缺失或重复以及额外片段，均可作为区分正常基因与异常基因的遗传标记，以进行基因诊断。家系10之弟即用此法作出了明确的诊断。
参考文献
1 Rumsby G, et l. Deletion of steroid 21-hydroxy-lase and complement C4 genes in congenital adrenal hyperplasia. J Med Genet 1986;23:204.
, 百拇医药
2 White PC, et al. Two genes encoding steroid 21-hydroxylase are located near the genes encoding the fourth component of complement in man Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:1089.
3 White PC, et al. HLA-linked congenital adrenal hyperplasia results from a defective gene encoding a cytochrome P-450 specific for steroid 21-hydro-xylation. Proc Natl Acad Sci USA 1984;81:7505.
4 White PC, et al. Structure of human steroid 21-hydroxylase genes. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:5111.
, 百拇医药
5 Thomas JS, et al. Experiments with gene fusions. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1984:177-200.
6 Schneider PM, et al. Polymorphism of the human complement C4 and steroid 21-hydroxylase genes. Restriction fragment length polymorphisms revealing structural deletions homoduplications and size variants. J Clin Invest 1986;78:650.
7 Werkmeister JW, et al. Frequent deletion and duplication of the steroid 21-hydroxylase genes. Am J Hum Genet 1986;39:461.
8 Walter LM. Gene conversions, deletions. and polymorphisms in congenital adrenal hyperplasia. Am j Hum Genet 1988;42:4.
9 Higashi Y, et al. Evidence for frequent gene conversion in the steroid 21-hydroxylase P-450(C21)gene: implications for steroid 21-hydroxylase defi-ciency Am J Hum Genet 1988;42:17., http://www.100md.com
单位：潘星时 陈磊 沈永年 冯伟军 钱大龙(上海市儿科医学研究所，200092)；郭华 张美华 张雅芬 陈瑞冠(复旦大学遗传学研究所)陈中孚
关键词：羟化酶类；染色体缺失；基因重叠；肾上腺皮质疾病
中华医学杂志910606
摘要 用21羟化酶基因的cDNA pC21/3C作探针，对40名正常人及18例先天性肾上腺皮质增生症患者16个家系的血DNA进行Southern杂交分析。发现在正常人群中，功能基因的拷贝数无变异，假基因的拷贝数有较多变异；在16个本症家系中，患者功能基因缺失率为19%，假基因的变异与正常人无差异。并利用该基因的变异，对1例患者之弟作出了明确的基因诊断。
, http://www.100md.com 先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一种较常见的遗传性代谢病。其中95%病例是由于肾上腺皮质21-羟化酶(21-OH)(EC1.14.99.10)缺乏所致。21-HO基因位于第6号染色体短臂HLA基因族区域[1]，分为A基因(21-OHA)及B基因(21-OHB)，后者编码具有活性的酶，前者则为假基因[2]。
国外已有人用DNA经限制性内切酶TapI消化，并用21-OH cDNA作探针进行杂交后，产生3.2kb及3.7kb两条带，分别对应于A、B基因的报道[3]。作者应用该项分子生物学技术，分析了中国人群中40名正常人和16例CAH患者及家系成员血DNA的杂交结果，就21-OH基因的高度变异及变异的多样性进行比较，以期探讨中国人群中CAH发生的遗传机理和特点，并为该症的基因诊断提供信息。
材料与方法
1、DNA样品来源：正常中国人40名。CAH患者18例，来自16个家系，均长期在我所随访。临床除家系6、14及16例 ，均为失盐型。此外，还包括患者亲代及1例患者的弟弟(家系10)共32例。各取全血5ml含0.1mol/L EDTA的抗凝管中，按照文献[4]方法抽提DNA。
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2、21-OH基因探针的制备：用作21-OH基因探针的质粒pC21/3C，系美国Connell大学医学院White教授赠送[4]。按文献[5]介绍方法分离该质粒中的2.1kb片段，该片段包括21-OH基因接近全部的cDNA。用缺口平移法以[α-32P]dATP标记探针。探针的比放射性为1～3×108cpm/μg。
3、Southern杂交分析：取8μgDNA，用限制性内切酶TaqI消化，按文献[5]方法进行电泳、杂交及放射自显影。
经Southern杂交后，可观察到3.7kb和3.2kb两条带，分别对应于21-OHB和21-OHA基因。在正常情况下，A、B基因分别有2份拷贝。当一个基因缺失或重复时，对应的杂交带将明显的减弱或增强。肉眼判断带的相对密度：(+)表示明显减弱，对应于基因缺失一份；(++)表示正常；(+++)表示明显增强，对应于基因重复一份；(-)表示无该片段，对应于基因纯合子缺失(附图)。所得结果均经两次重复确定。
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附图 Southern杂交结果及其对应杂交带密度
结 果
1、正常人Southern杂交结果：假基因A对应的3.2kb片段有较多变异，而功能基因B对应的3.7kb片段无变异。基中，3.2kb片段的变异有：4名呈(+++)，为A基因重复；6名呈(+)，为A基因缺失杂合子；1名呈(-)，为A基因缺失纯合子；另1名有额外的5.6kb片段，经查来自父系。
2、16例CAH家系杂交结果(附表)：来源于16个家系的18例患者分析，假基因A对应的3.2kb片段及功能基因B对应的3.7kb片段均有较多变异，后者的变异更多，主要表现为基因缺失。基中3.7kb片段的变异有：1例呈(+++)(家系6)，为B基因重复；6例呈(+)(家系1～5及10)，为B基因缺失杂合子。因此，32个失活基因中，基因缺失的比例为19%。3.2kb片段的变异有：3例呈(+++)(家系2、3、10)，为A基因重复；1例呈(+)(家系7)，为A基因缺失杂合子；1例有额外的5.6kb片段(家系1)。患者基因的变异均可追溯到亲代。患者的亲代中，也存在未遗传给患者的正常变异。包括1例B基因重复(家系1母)，其余均为A基因的变异，1例A基因重复(家系1父)，1例A基因纯合子缺失(家系6父)，2例A基因缺失杂合子(家系8、9母)。
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3、1例患者之弟的基因诊断：经分析确知家系10患者为B基因缺失杂合子，而患者之弟B基因无变化 。因此，我们肯定后者属正常。
附表 CAH患者家系1～10 Southern杂交结果 家系
患者
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讨 论
1、21-OHB基因的变异：本组40名正常人的B基因均无变化，而来自16个家系的18例患者中，有6例B基因缺失杂合子，占失活基因的19%。国外报道[6，7]白种人群为25%，略高于我们的结果，此种差异可能是由于种族差异或病例数较少造成。本组患者19%的基因缺失是导致基因功能丧失的原因之一，大多数患者的B基因经TaqI酶切后片段无变化，其失活原因可能是基因转变或点突变所致[8]。
2、21-OH A基因的变异：无论正常人或患者，21-OH A基因均有较多变异。本组40名正常人与18例患者家系成员中，各有1例A基因缺失纯合子，也存在相当数量的基因重复及缺失杂合子。这与国外关于A基因拷贝数变异较多的报道[9]相一致 。A基因的这种较普遍的变异显然与其为假基因有关，它的各种变异容易在群体中累积。
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3、额外的5.6kb片段来源：在40名正常人及18例患者家系中，各发现一名正常人及一个患者家系存在一条未见报道的5.6kb片段。根据已知的21-OH基因及邻近区域的DNA酶切图谱，我们推测该片段是因A基因3'端的一个TaqI切点消失，从而使原3.2kb片段向3'端延伸2.4kb所致。
4、基因诊断：本组发现21-OH基因的各种变异，包括A、B基因的缺失或重复以及额外片段，均可作为区分正常基因与异常基因的遗传标记，以进行基因诊断。家系10之弟即用此法作出了明确的诊断。
参考文献
1 Rumsby G, et l. Deletion of steroid 21-hydroxy-lase and complement C4 genes in congenital adrenal hyperplasia. J Med Genet 1986;23:204.
, 百拇医药
2 White PC, et al. Two genes encoding steroid 21-hydroxylase are located near the genes encoding the fourth component of complement in man Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:1089.
3 White PC, et al. HLA-linked congenital adrenal hyperplasia results from a defective gene encoding a cytochrome P-450 specific for steroid 21-hydro-xylation. Proc Natl Acad Sci USA 1984;81:7505.
4 White PC, et al. Structure of human steroid 21-hydroxylase genes. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:5111.
, 百拇医药
5 Thomas JS, et al. Experiments with gene fusions. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1984:177-200.
6 Schneider PM, et al. Polymorphism of the human complement C4 and steroid 21-hydroxylase genes. Restriction fragment length polymorphisms revealing structural deletions homoduplications and size variants. J Clin Invest 1986;78:650.
7 Werkmeister JW, et al. Frequent deletion and duplication of the steroid 21-hydroxylase genes. Am J Hum Genet 1986;39:461.
8 Walter LM. Gene conversions, deletions. and polymorphisms in congenital adrenal hyperplasia. Am j Hum Genet 1988;42:4.
9 Higashi Y, et al. Evidence for frequent gene conversion in the steroid 21-hydroxylase P-450(C21)gene: implications for steroid 21-hydroxylase defi-ciency Am J Hum Genet 1988;42:17., http://www.100md.com