三碘甲状腺原氨酸对人胚脑神经原特异性烯醇化酶表达的影响
作者：庞智玲 张文治 李兰英 陈琢聿
单位：(天津医学院内分泌研究所，300070)
关键词：胚胎；神经元；脑；三碘甲状腺原氨酸
中华医学杂志910603
摘要 利用早期人胚大脑神经细胞无血清培养液原代培养物，经生化法分离出烯醇化酶三个活性峰：αα、αγ、γγ组分。培养20天中呈αα-αγ-γγ，即非神经原性烯醇化酶(NNE)-神经原特异性烯醇化酶(NSE)转换与体内情况相似。三碘甲状腺原氨酸(T3)作用下NNE总活性下降，γγ亚基出现提前，NSE总活性高于对照组2.55倍，且随培养时间呈线性增长。表明T3可直接促进人胚大脑神经细胞分化成熟。
哺乳动物脑组织中糖原酵解酶烯醇化酶(EC4，2，1，11)具有αα，αγ，γγ三种形式同工酶。在鼠胚胎脑发育早期，非神经原性烯醇化酶(Non-Neuronal Enolase，NNE，αα和αγ)占主要优势，随着神经细胞的发生，神经原特异性烯醇化酶(Neuron-Specific Enolase，NSE，γγ)出现，但最初时水平很低，随神经细胞的分化成熟不断增长，即神经细胞的发育分化过程呈现αα-αγ-γγ(NNE-NSE)的转换过程，而NSE为神经细胞分化成熟的特异性标记[1，2]。
, 百拇医药
神经细胞发育可受多种因素(如激素、生长因子等等)影响。有关三碘甲状腺原氨酸(T3)对NSE发育影响资料极少[3]，我们利用人脑神经细胞培养物用酶学方法进一步探讨。
材料与方法
一、原代分离培养
取妊娠3个月人工流产的人胚大脑半球，按本室建立的方法[4]，细胞浓度为1×106/ml，培养(DMEM)(Dulbecco’s modified Eagle medium)与Ham F 12的无血清培养液中。实验分为对照组(未加T3)及加入T3组，T3浓度为20μg/dl，取样时间为培养5、10、15、20天。
二、细胞样品制备
弃除培养上清液，刮取各组样品细胞，用Hank液洗涤离心3次。各组细胞分别加入1ml缓冲液A(10mmol/L磷酸盐缓冲液，1mmol/L硫酸镁，pH7.0)500r/min匀浆，匀浆液中再加入4ml缓冲液A，100000g 4℃离心60分钟，取离心上清液-40℃保存。
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三、NSE提取
按Marangos法[5]加以改良，采用二乙氨乙基纤维素DE52以离子交换色谱法提取。
4℃下DE52装入0.5×5cm柱中，用缓冲液A平衡后，将离心细胞匀浆上清液上柱，用10ml含0～0.5mol/L氯化钠缓冲液A梯度溶液洗脱，收集分离产物，其速度为0.6ml/分，每管1.2ml。分离产物置4℃保存，待测。
四、NSE活力测定
NST可以催化2-磷酸甘油酸反应，生成烯醇丙酮酸，利用该反应测定NSE活力。
配制缓冲液B[50 mmol/L 磷酸盐缓冲液，1.5mmol/L硫酸镁，50mmol/L氯化钾，1mmol/L 2-磷酸甘油酸钠(Sigma)]。取200μl色谱柱分离物，加入4ml缓冲液B于25℃反应10分钟，立即于沸水中中止反应，用岛津UV-120-02分光光度计，波长240nm条件下测吸光度值，以缓冲液A为空白。
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五、可溶性蛋白测定
按Bradford法[6]测每管色谱分离物的蛋白含量，于波长595nm下测吸光度值。
结 果
一、大脑神经细胞体外发育分化过程中NSE发育及NNE至NSE转换
对照组及加T3组实验结果均显示人胚大脑神经细胞培养物匀浆上清液经DE52离子交换色谱法分离得到烯醇化酶3个活性峰。最初出现的峰为αα亚单位(NNE)，最晚者为γγ亚基(NSE)，中间峰为αγ(杂交烯醇化酶)。对照组(未加T3)显示：培养5天时仅出现αα峰，10、15天时为αα、αγ两个峰，γγ亚基峰于培养20天时出现(附图)。各亚基活性占烯醇化酶总活性百分比显示，在整个发育分化过程中，均以αα及αγ亚基占主要优势，如20天αα为64，而γγ亚基仅为14.2(附表)。各亚基各自的发育趋势为αα与αγ一直持续在较高水平，γγ亚基峰出现晚、水平低、增长缓慢。
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二、T3对NSE发育的影响
加T3组培养5天时已出现αα、αγ两个峰；15天时γγ峰即出现，其总活性为 12.4；培养20天时γγ亚基总活性增高达36.2，为对照组14.2的2.55倍(P<0.01)。加T3组各亚基各自发育趋势显示，培养10天以前，αα亚基与αγ亚基占主要优势，随培养时间延长则趋向减少，而γγ亚基总活性则呈线性增长趋势(附图，附表)。
酶 活 性
附图 T3对人胚大脑神经细胞培养物NNE-NSE发育的影响
, 百拇医药
附表 T3对人胚大脑神经细胞培养物αα、αγ、γγ亚基活性的影响(%) 培养天数
αα亚基
αγ亚基
γγ亚基
对照
加T3
对照
加T3
对照
加T3
5
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100.0*
23.1
0
76.9
0
0
10
75.3*
21.2
24.7
78.8*
0
, http://www.100md.com 0
15
55.5
61.0
44.4*
25.9
0
12.4*
20
64.0*
38.0
21.6
, http://www.100md.com 25.3
14.2
36.2*
* P<0.01
讨 论
我们用无血清培养液进行人胚大脑神经细胞原代培养，获得了纯度较高的神经细胞，仅有少数非神经细胞，神经细胞的形态、功能与体内情况相似[4]。3个月人胚大脑处于神经母细胞增殖期，原代培养过程中可不断发育分化成熟。NSE免疫细胞化学观察表明，培养10天时，分化成熟的神经细胞达90%以上[3]，可作为发育神经内分泌学研究的很好模型。
以往报道[1，2，7]主要利用鼠、鸡等哺乳动物进行在体与离体实验，经免疫细胞化学、生化、放射免疫测定及分子生物学的研究证明脑发育过程中存在神经原特异性烯醇化酶的发育与NNE至NSE的转换。我们采用原代培养人胚大脑神经毒细胞，经酶学方法分析发现，在培养20天过程中分离出αα、αγ、γγ3种亚基同工酶，培养15天以前主要为αα、αγ，其中以αα为主要优势型，γγ亚基出现最晚(于15天以后)。结果表明，人胚大脑神经母细胞在体外发育下亦呈αα-αγ-γγ，即NNE至NSE转换过程，神经细胞可以分化成熟，与文献报道相同，说明原代培养神经母细胞可模拟体内脑发育过程。α亚基至γ亚基同工酶的转换机理尚了解不多。Tanaka等[7]指出，α亚基至γ亚基同工酶mRNA发育与NNE至NSE活性水平一致，认为脑烯醇化酶同功酶表达主要控制在转录水平。
, 百拇医药
免疫组织化学观察指出，胚胎脑组织中NNE主要定位于星形胶质细胞，并可见于生成神经细胞的增殖细胞群体中，NSE仅位于神经细胞中[1]。我们研究发现，20天培养过程中，一直可见αα亚基(NNE)，但主要分布在15天以前，而NSE则在15天以后，γγ峰则于20天出现。我们认为NNE可以存在于发育早期，功能分化已开始的神经细胞或正在分化成熟的神经细胞中。我们用敏感的免疫细胞化学方法发现，培养3天时，阳性NSE反应即可见，仅程度较弱，而生化分析NSE总活性出现于培养15天后，高峰于20天，提示可以认为NSE存在于神经细胞发化早期阶段，随发育而增长，是神经细胞分化成熟、功能完善阶段的主要优势型。
目前一般认为甲状腺激素与脑发育关系十分密切。地方性克汀病出现不同程度脑发育障碍，主要与缺碘、缺甲状腺激素导致的中枢神经系统损伤有关。近年来利用体外培养方法证实T3对脑神经细胞发育、分化有直接促进作用[3]。我们研究发现，在人胚大脑神经细胞体外发育时期T3可促进神经细胞突起分化早期标记蛋白——微管蛋白的合成、微管装配蛋白合成及NSE发育。本实验结果也表明T3加速NNE-NSE转换，并增加NSE总活性。T3作用方式、途径与机理至今未完全阐明。脑神经细胞中存在着T3核受体，后者主要位于核染色质非组蛋白部分，考虑可能为T3与核受体结合，调控基因表达，影响转录过程，促进特异性蛋白质的产生。
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参考文献
1 Marangos PJ, et al. Developmental profile of neuronspecific (NSE)and non-neuronal (NNE)enolase in rat and monkey brain. Brain Research 1980;190:185.
2 Schmechel DE, et al. Neuron switch from non-neuronal enolase to neuron-specific enolase during differentiation. Brain Research 1980;190:195.
3 庞智玲等，碘及甲状腺激素对体外培养早期人胚大脑神经细胞分研究——神经特殊烯醇酶免疫组织化学观察，中华内分泌代谢杂志 1986；2：248。
, 百拇医药
4 庞智玲等，人胚大脑神经细胞无血清培养液中的生长特性，细胞生物学杂志 1987；9：176。
5 Marangos PJ, et al. Determination and characterization of neuron specific protein (NSP)associated enolase aceivity. Biochem Biophys Res Commun 1976;68:1309.
6 Bradford MM, et al. A rapid and sensitive method for the quantities of protein utillizintg the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248.
7 Tanaka M, et al. Developmental change in levels of translatable mRNA for enolase isozymes in chicken brain. J Neurochem 1986;47:1523., 百拇医药
单位：(天津医学院内分泌研究所，300070)
关键词：胚胎；神经元；脑；三碘甲状腺原氨酸
中华医学杂志910603
摘要 利用早期人胚大脑神经细胞无血清培养液原代培养物，经生化法分离出烯醇化酶三个活性峰：αα、αγ、γγ组分。培养20天中呈αα-αγ-γγ，即非神经原性烯醇化酶(NNE)-神经原特异性烯醇化酶(NSE)转换与体内情况相似。三碘甲状腺原氨酸(T3)作用下NNE总活性下降，γγ亚基出现提前，NSE总活性高于对照组2.55倍，且随培养时间呈线性增长。表明T3可直接促进人胚大脑神经细胞分化成熟。
哺乳动物脑组织中糖原酵解酶烯醇化酶(EC4，2，1，11)具有αα，αγ，γγ三种形式同工酶。在鼠胚胎脑发育早期，非神经原性烯醇化酶(Non-Neuronal Enolase，NNE，αα和αγ)占主要优势，随着神经细胞的发生，神经原特异性烯醇化酶(Neuron-Specific Enolase，NSE，γγ)出现，但最初时水平很低，随神经细胞的分化成熟不断增长，即神经细胞的发育分化过程呈现αα-αγ-γγ(NNE-NSE)的转换过程，而NSE为神经细胞分化成熟的特异性标记[1，2]。
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神经细胞发育可受多种因素(如激素、生长因子等等)影响。有关三碘甲状腺原氨酸(T3)对NSE发育影响资料极少[3]，我们利用人脑神经细胞培养物用酶学方法进一步探讨。
材料与方法
一、原代分离培养
取妊娠3个月人工流产的人胚大脑半球，按本室建立的方法[4]，细胞浓度为1×106/ml，培养(DMEM)(Dulbecco’s modified Eagle medium)与Ham F 12的无血清培养液中。实验分为对照组(未加T3)及加入T3组，T3浓度为20μg/dl，取样时间为培养5、10、15、20天。
二、细胞样品制备
弃除培养上清液，刮取各组样品细胞，用Hank液洗涤离心3次。各组细胞分别加入1ml缓冲液A(10mmol/L磷酸盐缓冲液，1mmol/L硫酸镁，pH7.0)500r/min匀浆，匀浆液中再加入4ml缓冲液A，100000g 4℃离心60分钟，取离心上清液-40℃保存。
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三、NSE提取
按Marangos法[5]加以改良，采用二乙氨乙基纤维素DE52以离子交换色谱法提取。
4℃下DE52装入0.5×5cm柱中，用缓冲液A平衡后，将离心细胞匀浆上清液上柱，用10ml含0～0.5mol/L氯化钠缓冲液A梯度溶液洗脱，收集分离产物，其速度为0.6ml/分，每管1.2ml。分离产物置4℃保存，待测。
四、NSE活力测定
NST可以催化2-磷酸甘油酸反应，生成烯醇丙酮酸，利用该反应测定NSE活力。
配制缓冲液B[50 mmol/L 磷酸盐缓冲液，1.5mmol/L硫酸镁，50mmol/L氯化钾，1mmol/L 2-磷酸甘油酸钠(Sigma)]。取200μl色谱柱分离物，加入4ml缓冲液B于25℃反应10分钟，立即于沸水中中止反应，用岛津UV-120-02分光光度计，波长240nm条件下测吸光度值，以缓冲液A为空白。
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五、可溶性蛋白测定
按Bradford法[6]测每管色谱分离物的蛋白含量，于波长595nm下测吸光度值。
结 果
一、大脑神经细胞体外发育分化过程中NSE发育及NNE至NSE转换
对照组及加T3组实验结果均显示人胚大脑神经细胞培养物匀浆上清液经DE52离子交换色谱法分离得到烯醇化酶3个活性峰。最初出现的峰为αα亚单位(NNE)，最晚者为γγ亚基(NSE)，中间峰为αγ(杂交烯醇化酶)。对照组(未加T3)显示：培养5天时仅出现αα峰，10、15天时为αα、αγ两个峰，γγ亚基峰于培养20天时出现(附图)。各亚基活性占烯醇化酶总活性百分比显示，在整个发育分化过程中，均以αα及αγ亚基占主要优势，如20天αα为64，而γγ亚基仅为14.2(附表)。各亚基各自的发育趋势为αα与αγ一直持续在较高水平，γγ亚基峰出现晚、水平低、增长缓慢。
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二、T3对NSE发育的影响
加T3组培养5天时已出现αα、αγ两个峰；15天时γγ峰即出现，其总活性为 12.4；培养20天时γγ亚基总活性增高达36.2，为对照组14.2的2.55倍(P<0.01)。加T3组各亚基各自发育趋势显示，培养10天以前，αα亚基与αγ亚基占主要优势，随培养时间延长则趋向减少，而γγ亚基总活性则呈线性增长趋势(附图，附表)。
酶 活 性
附图 T3对人胚大脑神经细胞培养物NNE-NSE发育的影响
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附表 T3对人胚大脑神经细胞培养物αα、αγ、γγ亚基活性的影响(%) 培养天数
αα亚基
αγ亚基
γγ亚基
对照
加T3
对照
加T3
对照
加T3
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讨 论
我们用无血清培养液进行人胚大脑神经细胞原代培养，获得了纯度较高的神经细胞，仅有少数非神经细胞，神经细胞的形态、功能与体内情况相似[4]。3个月人胚大脑处于神经母细胞增殖期，原代培养过程中可不断发育分化成熟。NSE免疫细胞化学观察表明，培养10天时，分化成熟的神经细胞达90%以上[3]，可作为发育神经内分泌学研究的很好模型。
以往报道[1，2，7]主要利用鼠、鸡等哺乳动物进行在体与离体实验，经免疫细胞化学、生化、放射免疫测定及分子生物学的研究证明脑发育过程中存在神经原特异性烯醇化酶的发育与NNE至NSE的转换。我们采用原代培养人胚大脑神经毒细胞，经酶学方法分析发现，在培养20天过程中分离出αα、αγ、γγ3种亚基同工酶，培养15天以前主要为αα、αγ，其中以αα为主要优势型，γγ亚基出现最晚(于15天以后)。结果表明，人胚大脑神经母细胞在体外发育下亦呈αα-αγ-γγ，即NNE至NSE转换过程，神经细胞可以分化成熟，与文献报道相同，说明原代培养神经母细胞可模拟体内脑发育过程。α亚基至γ亚基同工酶的转换机理尚了解不多。Tanaka等[7]指出，α亚基至γ亚基同工酶mRNA发育与NNE至NSE活性水平一致，认为脑烯醇化酶同功酶表达主要控制在转录水平。
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免疫组织化学观察指出，胚胎脑组织中NNE主要定位于星形胶质细胞，并可见于生成神经细胞的增殖细胞群体中，NSE仅位于神经细胞中[1]。我们研究发现，20天培养过程中，一直可见αα亚基(NNE)，但主要分布在15天以前，而NSE则在15天以后，γγ峰则于20天出现。我们认为NNE可以存在于发育早期，功能分化已开始的神经细胞或正在分化成熟的神经细胞中。我们用敏感的免疫细胞化学方法发现，培养3天时，阳性NSE反应即可见，仅程度较弱，而生化分析NSE总活性出现于培养15天后，高峰于20天，提示可以认为NSE存在于神经细胞发化早期阶段，随发育而增长，是神经细胞分化成熟、功能完善阶段的主要优势型。
目前一般认为甲状腺激素与脑发育关系十分密切。地方性克汀病出现不同程度脑发育障碍，主要与缺碘、缺甲状腺激素导致的中枢神经系统损伤有关。近年来利用体外培养方法证实T3对脑神经细胞发育、分化有直接促进作用[3]。我们研究发现，在人胚大脑神经细胞体外发育时期T3可促进神经细胞突起分化早期标记蛋白——微管蛋白的合成、微管装配蛋白合成及NSE发育。本实验结果也表明T3加速NNE-NSE转换，并增加NSE总活性。T3作用方式、途径与机理至今未完全阐明。脑神经细胞中存在着T3核受体，后者主要位于核染色质非组蛋白部分，考虑可能为T3与核受体结合，调控基因表达，影响转录过程，促进特异性蛋白质的产生。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Marangos PJ, et al. Developmental profile of neuronspecific (NSE)and non-neuronal (NNE)enolase in rat and monkey brain. Brain Research 1980;190:185.
2 Schmechel DE, et al. Neuron switch from non-neuronal enolase to neuron-specific enolase during differentiation. Brain Research 1980;190:195.
3 庞智玲等，碘及甲状腺激素对体外培养早期人胚大脑神经细胞分研究——神经特殊烯醇酶免疫组织化学观察，中华内分泌代谢杂志 1986；2：248。
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4 庞智玲等，人胚大脑神经细胞无血清培养液中的生长特性，细胞生物学杂志 1987；9：176。
5 Marangos PJ, et al. Determination and characterization of neuron specific protein (NSP)associated enolase aceivity. Biochem Biophys Res Commun 1976;68:1309.
6 Bradford MM, et al. A rapid and sensitive method for the quantities of protein utillizintg the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248.
7 Tanaka M, et al. Developmental change in levels of translatable mRNA for enolase isozymes in chicken brain. J Neurochem 1986;47:1523., 百拇医药