c-myc基因在甲状腺癌中的表达、扩增与重排
作者：杨叶 胡绍文 张劲翼 王成济
单位：(第四军医大学西京医院内分泌科，西安，710032)杨叶 胡绍文；(第四军医大学生化教研室)张劲翼 王成济
关键词：癌；基因；杂交；甲状腺
中华医学杂志910602
摘要 对15例甲状腺癌、3例甲状腺瘤、1例甲状腺癌旁组织及5例正常甲状腺组织的总RNA及DNA分别与c-myc探针进行分子杂交，结果表明：9例甲状腺癌c-myc基因表达比正常组织增高3～11倍，4例甲状腺癌出现c-myc基因的重排，其中1例伴有明显的扩增。提示c-myc基因的激活在甲状腺癌的发生、发展中可能发挥重要作用。
大量实验表明，c-myc原癌基因在人类某些恶性肿瘤中的扩增与过度表达可能与细胞的恶性变有关[1，2]。然而，有关甲状腺癌癌基因的研究报道较少[3]。为此，我们采用分子杂交的方法，观察了甲状腺肿瘤组织中c-myc原癌基因的表达，并对甲状腺癌中c-myc基因的结构作一初步分析。
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材料与方法
1、质粒DNA的提取与探针的制备：c-myc质粒系美国麻省理工学院Jay Mavgerstern教授惠赠。质粒的提取采用碱变性法[4]或羟基磷灰石法[5]。将提取的质粒DNA用EcoRI和Hind III酶解后，用低融点琼脂糖法[6]回收约8kb的c-myc基因片段。利用缺口平移法[7]制备同位素标记的c-myc探针(32p-dATP 为北京福瑞公司产品)，探针的比放射性约为1×108cpm/μg。
2、组织RNA和DNA的提取：从甲状腺外科手术中取下的经常规病理检查确诊的组织立即放入液氮中冻存。组织块在液氮中捣碎后，分别采用C homczynski等[8]和Maniatis等[9]方法提取细胞总RNA和基因组DNA。
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3、RNA打点杂交：在RNA样品中加入等体积的变性液(34%乙二醛，25mmol/L磷酸氢二钠，pH6.5)，50℃水浴1小时。变性后的RNA经倍比稀释三个梯度后点在20×SSC预处理的硝酸纤维膜上，置80℃干燥2小时，在20mmol/L三羟甲基氨基甲烷*盐酸(pH8.0)溶液中煮沸10分钟，室温下晾干备用。杂交按Hames等[10]方法进行。杂交完毕后将膜取出进行漂洗，晾干后在暗室中压X线片，加双侧高能增感屏，-20℃曝光1周显影。
4、Southern转移杂交：DNA样品用EcoRI消化后，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，以λDNA的Hind III酶解片段为分子量标记，电泳后凝胶按Southern[11]方法经碱变性、中和处理后，在20×SSC(17.5%氯化钠，8.8%枸橼酸钠)中进行硝酸纤维膜吸印24小时，取出滤膜置80℃干燥2小时，备用。按Hames等[10]方法进行杂交及洗膜。滤膜干燥后，在增感屏中置-20℃做放射自显影(1～2周)。
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5、c-myc基因表达量的分析：用TAS-Plus图像分析仪测定X线胶片上杂交信号，c-myc基因的表达量用灰度值表示(以正常甲状腺组织c-myc基因的表达量的平均值为1)。当甲状腺癌c-myc基因表达量≥3倍正常甲状腺组织c-myc表达量时，被认为是过度表达。
6、EORTC预后指数的计算：EORTC指数是一项综合评价各种影响甲状腺癌预后因素的指标，按照Byar等[12]提出的EORTC指数计算方法进行。EORTC指数≥66的甲状腺癌患者，其5年生存率<50%为预后不良。
结 果
1、用32p-dATP标记的c-myc探针与15例原发性甲状腺癌、3例甲状腺腺瘤、1例甲状腺癌旁组织及5例正常甲状腺组织的RNA打点杂交结果表明(图1)，所有标本均有c-myc基因的表达，其中9例甲状腺癌c-myc表达较正常甲状腺组织增高3～11倍；1例癌旁组织及1例腺瘤增高1～2倍。
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1—8：甲状腺癌；9—11：正常甲状腺组织；12：癌旁组织；13—14：甲状腺腺瘤
图1 人甲状腺组织RNA与c-myc探针打点杂交的放射自显影
1：正常甲状腺组织；2—6甲状腺癌
图2 人甲状腺癌DNA经EcoRi酶切后与c-myc探针的Southern blot杂交
2、经EcoRI酶切的甲状腺组织DNA与c-myc探针的Southern杂交表明，正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤及部分甲状腺癌在12.5kb处有一区带。有4例甲状腺癌杂交区带位置有多态性(图2，3～6标本)，其中1例(图2中第3个标本)同时在5.6kb处出现基因放大，密度扫描结果显示该片段的扩增较正常组织增高150倍以上。c-myc基因的多态性说明，c-myc基因在某些人甲状腺癌中存在重排现象。
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3、c-myc基因的过度表达、扩增或重排与甲状腺癌患者的关系：根据患者的临床资料(附表)，将患者分为两组，即EORTC指数≥66的预后不良组和EORTC指数≤65的预后良好组，预后不良组8例，其中c-myc基因过度表达7例，扩增或重排3例；预后良好组7例，其中c-myc基因过度表达2例，扩增或重排1例。比较两组与c-myc基因过度表达、扩增或重排 的关系。结果发现，预后不良组的患者c-myc基因过度表达的发生率(88%)高于预后良好组(28%)，两者差异具有显著意义(χ2=5.38，P<0.05)。预后不良组的c-myc基因扩增或重排的发生例数也高于预后良好组。
讨 论
c-myc基因普遍存在于正常细胞中，其产物对于细胞增殖、分化起着重要作用[13]。许多实验表明，c-myc基因的激活与某些人类恶性肿瘤如肺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、神经胶质瘤等发生有关[1]。本实验采用分子杂交方法，以c-myc基因片段为探针，检测了甲状腺肿瘤组织中c-myc基因的表达。发现多数原发性甲状腺癌c-myc表达较正常组织增高3～ 11倍。此外，我们在正常甲状腺组织中也检测到c-myc基因的表达，提示c-myc基因在甲状腺细胞的生长、分化中可能发挥着某些生理作用。而c-myc基因的过度表达可能与甲状腺组织的恶性变有关。
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对15例甲状腺癌c-myc基因的结构分析表明，4例发生c-myc基因的重排，其中1例伴有明显的扩增。提示甲状腺癌中c-myc基因的激活途径除了基因表达失控外，可能还存在该基因的扩增与重排。
c-myc基因的扩增、重排或过度表达与某些肿瘤的恶性程度有关[13，14]。我们发现预后不良的甲状腺癌患者c-myc基因表达过度、重排或扩增的发生率高于预后良好的患者，提示c-myc基因的激活可能与甲状腺癌的不良预后有一定的联系，并有可能为临床判断甲状腺癌的预后和疗效观察提供一个客观的指标。
参考文献
1 Alitalo K, et al. Oncogene amplificatino in tumor cells. Adv Cancer Res 1986;47:235.
2 Biunno J, et al. Structure and expression of oncogenes in surgical specimens of human breast carcinomas. Br J Cancer 1988;57:464.
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3 Namba H, et al. H-ras proto-oncogene mutation in human thyroid neoplasms J Clin Endocrinol Metab 1990;71:223.
4 Maniatis T, et al. Molecular Cloning. New York； Cold spring harbor laboratory, 1982;86-88.
5 黄翠芬，遗传工程理论与方法，北京：科学出版社，1987：172。
6 Sambrook J, et al. Molecular Cloning. New York Cold spring harbor laboratory, 1989:30-31.
7 Rigby PW. Labelling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J Mol Biol 1977;113:237.
, 百拇医药
8 Chomczynski P, et al. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction Analytical Biochemistry 1987;162:156.
9 Maniatis T, et al. Molecular Cloning. New York Cold spring harbor laboratory, 1982;80-81.
10 Williams JG, Mason PJ, Hybridisation in the analysis of RNA. In:Hames BD, & Hingging SJ, eds Nucleic acid hybridisation Oxford: IRL Press 1985:143-144.
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11 Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis J Mol Biol 1975;98:508.
12 Byar D, et al. A prognosis index for thyroid carcinoma. Astudy of the E.O.R.T.C. thyroid cancer cooperative group Eur J Cancer 1979;15:1033.
13 Barbacid M. Oncogenes and human cancer. Cause or consequences? Carcinogenesis 1986;7:1937.
14 Riou G, et al. C-myc proto-oncogene expression and prognosis in early carcinoma of uterine cervix L ancet 1987;1(8536):761., 百拇医药
单位：(第四军医大学西京医院内分泌科，西安，710032)杨叶 胡绍文；(第四军医大学生化教研室)张劲翼 王成济
关键词：癌；基因；杂交；甲状腺
中华医学杂志910602
摘要 对15例甲状腺癌、3例甲状腺瘤、1例甲状腺癌旁组织及5例正常甲状腺组织的总RNA及DNA分别与c-myc探针进行分子杂交，结果表明：9例甲状腺癌c-myc基因表达比正常组织增高3～11倍，4例甲状腺癌出现c-myc基因的重排，其中1例伴有明显的扩增。提示c-myc基因的激活在甲状腺癌的发生、发展中可能发挥重要作用。
大量实验表明，c-myc原癌基因在人类某些恶性肿瘤中的扩增与过度表达可能与细胞的恶性变有关[1，2]。然而，有关甲状腺癌癌基因的研究报道较少[3]。为此，我们采用分子杂交的方法，观察了甲状腺肿瘤组织中c-myc原癌基因的表达，并对甲状腺癌中c-myc基因的结构作一初步分析。
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材料与方法
1、质粒DNA的提取与探针的制备：c-myc质粒系美国麻省理工学院Jay Mavgerstern教授惠赠。质粒的提取采用碱变性法[4]或羟基磷灰石法[5]。将提取的质粒DNA用EcoRI和Hind III酶解后，用低融点琼脂糖法[6]回收约8kb的c-myc基因片段。利用缺口平移法[7]制备同位素标记的c-myc探针(32p-dATP 为北京福瑞公司产品)，探针的比放射性约为1×108cpm/μg。
2、组织RNA和DNA的提取：从甲状腺外科手术中取下的经常规病理检查确诊的组织立即放入液氮中冻存。组织块在液氮中捣碎后，分别采用C homczynski等[8]和Maniatis等[9]方法提取细胞总RNA和基因组DNA。
, 百拇医药
3、RNA打点杂交：在RNA样品中加入等体积的变性液(34%乙二醛，25mmol/L磷酸氢二钠，pH6.5)，50℃水浴1小时。变性后的RNA经倍比稀释三个梯度后点在20×SSC预处理的硝酸纤维膜上，置80℃干燥2小时，在20mmol/L三羟甲基氨基甲烷*盐酸(pH8.0)溶液中煮沸10分钟，室温下晾干备用。杂交按Hames等[10]方法进行。杂交完毕后将膜取出进行漂洗，晾干后在暗室中压X线片，加双侧高能增感屏，-20℃曝光1周显影。
4、Southern转移杂交：DNA样品用EcoRI消化后，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，以λDNA的Hind III酶解片段为分子量标记，电泳后凝胶按Southern[11]方法经碱变性、中和处理后，在20×SSC(17.5%氯化钠，8.8%枸橼酸钠)中进行硝酸纤维膜吸印24小时，取出滤膜置80℃干燥2小时，备用。按Hames等[10]方法进行杂交及洗膜。滤膜干燥后，在增感屏中置-20℃做放射自显影(1～2周)。
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5、c-myc基因表达量的分析：用TAS-Plus图像分析仪测定X线胶片上杂交信号，c-myc基因的表达量用灰度值表示(以正常甲状腺组织c-myc基因的表达量的平均值为1)。当甲状腺癌c-myc基因表达量≥3倍正常甲状腺组织c-myc表达量时，被认为是过度表达。
6、EORTC预后指数的计算：EORTC指数是一项综合评价各种影响甲状腺癌预后因素的指标，按照Byar等[12]提出的EORTC指数计算方法进行。EORTC指数≥66的甲状腺癌患者，其5年生存率<50%为预后不良。
结 果
1、用32p-dATP标记的c-myc探针与15例原发性甲状腺癌、3例甲状腺腺瘤、1例甲状腺癌旁组织及5例正常甲状腺组织的RNA打点杂交结果表明(图1)，所有标本均有c-myc基因的表达，其中9例甲状腺癌c-myc表达较正常甲状腺组织增高3～11倍；1例癌旁组织及1例腺瘤增高1～2倍。
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1—8：甲状腺癌；9—11：正常甲状腺组织；12：癌旁组织；13—14：甲状腺腺瘤
图1 人甲状腺组织RNA与c-myc探针打点杂交的放射自显影
1：正常甲状腺组织；2—6甲状腺癌
图2 人甲状腺癌DNA经EcoRi酶切后与c-myc探针的Southern blot杂交
2、经EcoRI酶切的甲状腺组织DNA与c-myc探针的Southern杂交表明，正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤及部分甲状腺癌在12.5kb处有一区带。有4例甲状腺癌杂交区带位置有多态性(图2，3～6标本)，其中1例(图2中第3个标本)同时在5.6kb处出现基因放大，密度扫描结果显示该片段的扩增较正常组织增高150倍以上。c-myc基因的多态性说明，c-myc基因在某些人甲状腺癌中存在重排现象。
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3、c-myc基因的过度表达、扩增或重排与甲状腺癌患者的关系：根据患者的临床资料(附表)，将患者分为两组，即EORTC指数≥66的预后不良组和EORTC指数≤65的预后良好组，预后不良组8例，其中c-myc基因过度表达7例，扩增或重排3例；预后良好组7例，其中c-myc基因过度表达2例，扩增或重排1例。比较两组与c-myc基因过度表达、扩增或重排 的关系。结果发现，预后不良组的患者c-myc基因过度表达的发生率(88%)高于预后良好组(28%)，两者差异具有显著意义(χ2=5.38，P<0.05)。预后不良组的c-myc基因扩增或重排的发生例数也高于预后良好组。
讨 论
c-myc基因普遍存在于正常细胞中，其产物对于细胞增殖、分化起着重要作用[13]。许多实验表明，c-myc基因的激活与某些人类恶性肿瘤如肺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、神经胶质瘤等发生有关[1]。本实验采用分子杂交方法，以c-myc基因片段为探针，检测了甲状腺肿瘤组织中c-myc基因的表达。发现多数原发性甲状腺癌c-myc表达较正常组织增高3～ 11倍。此外，我们在正常甲状腺组织中也检测到c-myc基因的表达，提示c-myc基因在甲状腺细胞的生长、分化中可能发挥着某些生理作用。而c-myc基因的过度表达可能与甲状腺组织的恶性变有关。
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对15例甲状腺癌c-myc基因的结构分析表明，4例发生c-myc基因的重排，其中1例伴有明显的扩增。提示甲状腺癌中c-myc基因的激活途径除了基因表达失控外，可能还存在该基因的扩增与重排。
c-myc基因的扩增、重排或过度表达与某些肿瘤的恶性程度有关[13，14]。我们发现预后不良的甲状腺癌患者c-myc基因表达过度、重排或扩增的发生率高于预后良好的患者，提示c-myc基因的激活可能与甲状腺癌的不良预后有一定的联系，并有可能为临床判断甲状腺癌的预后和疗效观察提供一个客观的指标。
参考文献
1 Alitalo K, et al. Oncogene amplificatino in tumor cells. Adv Cancer Res 1986;47:235.
2 Biunno J, et al. Structure and expression of oncogenes in surgical specimens of human breast carcinomas. Br J Cancer 1988;57:464.
, 百拇医药
3 Namba H, et al. H-ras proto-oncogene mutation in human thyroid neoplasms J Clin Endocrinol Metab 1990;71:223.
4 Maniatis T, et al. Molecular Cloning. New York； Cold spring harbor laboratory, 1982;86-88.
5 黄翠芬，遗传工程理论与方法，北京：科学出版社，1987：172。
6 Sambrook J, et al. Molecular Cloning. New York Cold spring harbor laboratory, 1989:30-31.
7 Rigby PW. Labelling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J Mol Biol 1977;113:237.
, 百拇医药
8 Chomczynski P, et al. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction Analytical Biochemistry 1987;162:156.
9 Maniatis T, et al. Molecular Cloning. New York Cold spring harbor laboratory, 1982;80-81.
10 Williams JG, Mason PJ, Hybridisation in the analysis of RNA. In:Hames BD, & Hingging SJ, eds Nucleic acid hybridisation Oxford: IRL Press 1985:143-144.
, 百拇医药
11 Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis J Mol Biol 1975;98:508.
12 Byar D, et al. A prognosis index for thyroid carcinoma. Astudy of the E.O.R.T.C. thyroid cancer cooperative group Eur J Cancer 1979;15:1033.
13 Barbacid M. Oncogenes and human cancer. Cause or consequences? Carcinogenesis 1986;7:1937.
14 Riou G, et al. C-myc proto-oncogene expression and prognosis in early carcinoma of uterine cervix L ancet 1987;1(8536):761., 百拇医药