精浆、厌氧菌培养液及单纯疱疹病毒II型对癌基因的激活作用
作者：刘朝奇 黄树林 孙瑜 姚学军 鲁德银 曾毅
单位：(宜昌医学专科学校微生物室，443003)刘朝奇；(湛江医学院微生物室)黄树林；(湖北医学院病毒室)孙瑜 姚学军 鲁德银；(中国预防医学科学院病毒研究所)曾毅
关键词：
中华医学杂志910624
用人精浆、厌氧菌培养液和单纯疱疹病毒II型(HSV-2)协同诱导小鼠宫颈癌，进行宫颈癌病因研究，同时检测了小鼠宫颈组织中 c-Ha-ras-1和c-myc癌基因，以探讨其发生机制。
一、材料和方法
1、病毒：HSV-2333株接种于Hep-2细胞，病变达75%时收获病毒，用前快速冻融3次，紫外线照射3分钟(强度36μJ/mm2秒)，照射前病毒滴度为106TCID50/0.1ml。
, http://www.100md.com
2、人精浆和厌氧菌培养液：多份人精液分别经18000r/min离心1小时，上清液混合即人精浆。取宫颈癌病人宫颈棉拭子作厌氧菌培养，分离阳性菌株，纯化培养蔡氏滤器除菌，其滤液为厌氧菌培养液。将人精浆和厌氧菌培养液按1：1(v/v)比例混合(SB)用于实验。
3、动物分组及处理：2个月龄昆明种杂交雌性小鼠，随机分为4组(表1)。处理因子每组均为两种，方式为小块医用明胶海绵吸接种物0.1ml，置于小鼠阴部直抵宫颈，每周2次共8周，自第9周起用另一种因子同上处理共8周。
实验6个月后处死小鼠，取完整生殖道，矢状剖开，一半用10%甲醛固定，用于病理学检查，另一半用于组织DNA提取。
4、参照Sternberger法检测宫颈组织HSV-2抗原。
5、提取宫颈组织DNA，缺口翻译法32P标记c-Ha-ras-1和c-myc DNA作探针，进行DNA-DNA打点杂交。
, 百拇医药
二、结果
分子杂交检测标本74份，经统计学分析C、D组与A组间差异有极显著意义(表1)。
从病理学角度分类发现患癌鼠组与其它各组 相比差异有显著意义(表2)。
表1 宫颈组织中c-Ha-ras-1癌基因检测 组别
例数
阳性数*
阳性率(%)
A
15
1
7
, http://www.100md.com
B
15
1
7
C
20
9
45
D
24
13
54
注：A组为Hep-2+PBS；B组为PBS+SB；C组为HSV-2+PBS；D组为HSV-2+SB。* C、D与A组比较，P<0.001表2 宫颈病理分类与c-Ha-ras-1癌基因比较 分类
, 百拇医药
例数
阳性数
百分率
患癌
19
13*
68
不典型增生
21
7
33
慢性炎症
6
, 百拇医药 2
2/6
正常
28
2
7
注：例数<10不计算百分率，下同。*与其它组比较，P<0.05表3 HSV-2接种组c-Ha-ras-1和HSV-2抗原检测 分类
例数
c-Ha-ras-1阳性数(%)
HSV-2抗原阳性数(%)
患癌
17
, http://www.100md.com
12(71)
13(77)
不典型增生
14
6(43)
5(36)
慢性炎症
3
2(2/3)
2(2/3)
正常
10
2(20)
, 百拇医药
1(10)
c-myc分子杂交除阳性对照显示阳性结果外，其阴性对照及标本均为阴性。
病毒接种组44只小鼠作分子杂交的同时，本实验还用PAP法检测了宫颈组织HSV-2抗原的表达情况。表3显示随着病程进展，其Ha-ras-1和HSV-2抗原阳性率随之增高，两者间具有良好平行关系。
三、讨论
根据肿瘤发生的多基因激活和癌变的多阶段学说，本实验在HSV-2和SB诱导小鼠宫颈癌过程中检测了c-Ha-ras-1和c-myc癌基因表达情况。
实验结果表明c-Ha-ras-1杂交结果阳性，而c-myc结果为阴性，说明在此动物诱癌过程中没有c-myc基因放大。对于临床宫颈癌组织中c-myc检测情况，阳性和阴性报道均有。至于c-myc在宫颈癌发生发展中存在与否及其作用都有待更多的临床标本和动物实验研究。
, http://www.100md.com
在HSV-2和DSV-2+SB组c-Ha-ras-1阳性率分别为45%和54%，单纯SB组为7%；从病理分类角度分析病毒接种组宫颈组织中c-Ha-ras-1阳性和HSV-2抗原表达，发现两者间有良好的平行关系。以上结果均表明c-Ha-ras-1的激活与HSV-2有非常密切的关系。Verrisetty等[14th herpesvirus Workshop Nyborg Strand 1989:182]用HSV-2 Bam HIE片段中PstI-SalI的486bp结构转化仓鼠细胞，在转化细胞中测定了24种细胞癌基因，发现c-ha-ras-1和P53两种癌基因阳性并有高水平蛋白表达。本实验从体内直接表明c-Ha-ras-1的激活与宫颈癌发生有关，同时提示HSV-2的致癌作用及其在宫颈癌发生中的重要作用。
SB组的c-Ha-ras-1阳性率仅7%，与对照组无差异。但体内外实验都表明SB具有明显促癌作用，从而认为SB可能作为促进因子提高宫颈癌的发生率。, 百拇医药
单位：(宜昌医学专科学校微生物室，443003)刘朝奇；(湛江医学院微生物室)黄树林；(湖北医学院病毒室)孙瑜 姚学军 鲁德银；(中国预防医学科学院病毒研究所)曾毅
关键词：
中华医学杂志910624
用人精浆、厌氧菌培养液和单纯疱疹病毒II型(HSV-2)协同诱导小鼠宫颈癌，进行宫颈癌病因研究，同时检测了小鼠宫颈组织中 c-Ha-ras-1和c-myc癌基因，以探讨其发生机制。
一、材料和方法
1、病毒：HSV-2333株接种于Hep-2细胞，病变达75%时收获病毒，用前快速冻融3次，紫外线照射3分钟(强度36μJ/mm2秒)，照射前病毒滴度为106TCID50/0.1ml。
, http://www.100md.com
2、人精浆和厌氧菌培养液：多份人精液分别经18000r/min离心1小时，上清液混合即人精浆。取宫颈癌病人宫颈棉拭子作厌氧菌培养，分离阳性菌株，纯化培养蔡氏滤器除菌，其滤液为厌氧菌培养液。将人精浆和厌氧菌培养液按1：1(v/v)比例混合(SB)用于实验。
3、动物分组及处理：2个月龄昆明种杂交雌性小鼠，随机分为4组(表1)。处理因子每组均为两种，方式为小块医用明胶海绵吸接种物0.1ml，置于小鼠阴部直抵宫颈，每周2次共8周，自第9周起用另一种因子同上处理共8周。
实验6个月后处死小鼠，取完整生殖道，矢状剖开，一半用10%甲醛固定，用于病理学检查，另一半用于组织DNA提取。
4、参照Sternberger法检测宫颈组织HSV-2抗原。
5、提取宫颈组织DNA，缺口翻译法32P标记c-Ha-ras-1和c-myc DNA作探针，进行DNA-DNA打点杂交。
, 百拇医药
二、结果
分子杂交检测标本74份，经统计学分析C、D组与A组间差异有极显著意义(表1)。
从病理学角度分类发现患癌鼠组与其它各组 相比差异有显著意义(表2)。
表1 宫颈组织中c-Ha-ras-1癌基因检测 组别
例数
阳性数*
阳性率(%)
A
15
1
7
, http://www.100md.com
B
15
1
7
C
20
9
45
D
24
13
54
注：A组为Hep-2+PBS；B组为PBS+SB；C组为HSV-2+PBS；D组为HSV-2+SB。* C、D与A组比较，P<0.001表2 宫颈病理分类与c-Ha-ras-1癌基因比较 分类
, 百拇医药
例数
阳性数
百分率
患癌
19
13*
68
不典型增生
21
7
33
慢性炎症
6
, 百拇医药 2
2/6
正常
28
2
7
注：例数<10不计算百分率，下同。*与其它组比较，P<0.05表3 HSV-2接种组c-Ha-ras-1和HSV-2抗原检测 分类
例数
c-Ha-ras-1阳性数(%)
HSV-2抗原阳性数(%)
患癌
17
, http://www.100md.com
12(71)
13(77)
不典型增生
14
6(43)
5(36)
慢性炎症
3
2(2/3)
2(2/3)
正常
10
2(20)
, 百拇医药
1(10)
c-myc分子杂交除阳性对照显示阳性结果外，其阴性对照及标本均为阴性。
病毒接种组44只小鼠作分子杂交的同时，本实验还用PAP法检测了宫颈组织HSV-2抗原的表达情况。表3显示随着病程进展，其Ha-ras-1和HSV-2抗原阳性率随之增高，两者间具有良好平行关系。
三、讨论
根据肿瘤发生的多基因激活和癌变的多阶段学说，本实验在HSV-2和SB诱导小鼠宫颈癌过程中检测了c-Ha-ras-1和c-myc癌基因表达情况。
实验结果表明c-Ha-ras-1杂交结果阳性，而c-myc结果为阴性，说明在此动物诱癌过程中没有c-myc基因放大。对于临床宫颈癌组织中c-myc检测情况，阳性和阴性报道均有。至于c-myc在宫颈癌发生发展中存在与否及其作用都有待更多的临床标本和动物实验研究。
, http://www.100md.com
在HSV-2和DSV-2+SB组c-Ha-ras-1阳性率分别为45%和54%，单纯SB组为7%；从病理分类角度分析病毒接种组宫颈组织中c-Ha-ras-1阳性和HSV-2抗原表达，发现两者间有良好的平行关系。以上结果均表明c-Ha-ras-1的激活与HSV-2有非常密切的关系。Verrisetty等[14th herpesvirus Workshop Nyborg Strand 1989:182]用HSV-2 Bam HIE片段中PstI-SalI的486bp结构转化仓鼠细胞，在转化细胞中测定了24种细胞癌基因，发现c-ha-ras-1和P53两种癌基因阳性并有高水平蛋白表达。本实验从体内直接表明c-Ha-ras-1的激活与宫颈癌发生有关，同时提示HSV-2的致癌作用及其在宫颈癌发生中的重要作用。
SB组的c-Ha-ras-1阳性率仅7%，与对照组无差异。但体内外实验都表明SB具有明显促癌作用，从而认为SB可能作为促进因子提高宫颈癌的发生率。, 百拇医药