应用聚合酶链反应在既往诊断的非甲非乙型肝炎中检HBV DNA
作者：陈义 吴斌 任进余 崔红
单位：兰州市第二人民医院 传染科* 陈义 吴斌；肝病研究室 任进余 崔红
关键词：
中华医学杂志920113
为了进一步明确病原，我们对既入诊断为非甲非乙型肝炎(NANBBH)患者的血清，应用聚合酶链反应(PCR)技术检测了HBV DNA。
一、材料和方法
1.血清标本：为我科1989年月至1990年4月收信的28例曾论断为NANBH患者的低温保存血清，其中3例患者保存双份血清，合计31份。采血时均使用一次性抽血器，血样离心后，分装于两个新的1.5ml离心管，第一管作HBV-M，抗HAV IgM，抗-EBV(EB病毒)IgM及抗-CMV(巨细胞病毒)IgM，第二管低温保存。本实验所用血清为第二管未曾使用过的血清。该28例在住院期间曾用ELISA法多次检测HBV-M、抗-HAV IgM、抗-EBV IgM、抗-CMV IgM均为阴性，其中21例应用斑点杂交检测HBV DNA亦为阴性，并排除了药物、酒精等其它原因所致肝损伤，在缺乏对丙、戊型肝炎特异性论断方法的情况下，遂诊断为NANBH。
, 百拇医药
2.PCR扩增方法及试剂：FD-DNA聚合酶由复旦大学遗传所提供，HBV-C基因引物由上海市肿瘤防治研究所合成，DNA扩增方法采用血清直接法[中华传染病杂志 1990；8：6]
3.扩增后HBV DNA产物的鉴定，经39次热循环后取20µl产物于1.8%~2.0%琼脂糖凝胸部电泳，然后在三用紫外检测仪下观察，若在619bp处见到发现荧光DNA区带即为阳性，反之为阴性。
二、结果
1.实验的特异性：每批实验中均设立试剂盒所附带阴阳性对照，另外分别设10例HBV DNA阳性血清和10例正常人血清作为对照。结果阳性对照和10例HBV DNA阳性血清在619bp处可见明显DNA荧光区带，而阴性对照及10例正常人血清却未见任何DNA区带(附图)，由此说明结果特异可信。
, 百拇医药
附图 HBV DNA阳性血清(A)，正常人血清(B)、患者血清(C)及阴阳性对照的PCR产物琼脂糖凝胶
电泳结果(1为阴性对照，2为阳性对照)
2.被检血清PCR测定结果：28例既往诊断的NANBH血清中，14例(50%)检出HBV DNA。3例患者的双份血清结果完全一致，均为阳性，总检出率为54.8%(17/31)。
3.PCR检出HBV DNA患者的临床资料：14例中男9例，女5例，平均年龄23岁(3.5~43岁)。12例急性发病，2例发病缓慢，急性黄疸型肝炎11例，慢性活动性肝炎2例，慢性迁延型肝炎1例。多数病程短，预后良好，12例临床治愈，2例好转出院。
三、讨论
本研究所用的一对引物具有高度保守性，不能引发PBR-322DNA模板扩增[中华传染病杂志 1990；8：6]；血清标本在采集后留1ml分装在新的离心管低温保存，不作重复使用；反应管及吸头等均一次性使用，因此保证了实验结果的准确性。结果表明，用排除法论断的NANBH中有相当一部分仍为HBV感染。与骆抗先等报告[中华内科杂志 1991；30：21]结果一致。说明目前常规酶标法及斑点杂交不足以检出微量抗原、抗体及HBV DNA。
, http://www.100md.com
为什么会在HBV标志物全阴性的血清中检出HBV-DNA，目前尚不清楚，我们推测可能与下述因素有关：(1)病毒复制水平低或者机体免疫功能不全，能未能产生足量的抗原或抗体，故目前常规方法不检出。(2)本组14例HBV DNA阳性者多数为急性黄疸型肝炎，这些患者可能原为HBV无症状携带者，本次重叠感染了其他病毒(如丙型或戊型肝炎病毒)，由于病毒间的相互干扰作用，使HBV标志物表达受到抑制、降至检出水平以下。(3)最近有报道[国外医学流行病学传染病学分册 1988；15：193]单纯HBsAg阳性的HBV2感染在HBsAg转阴后也可不出现抗-HBs，因其DNA序列与HBV1有同源性，因此是否存在HBV2感染也值得进一步研究。
(1991年3月25日收稿 同年8月10日修回), 百拇医药
单位：兰州市第二人民医院 传染科* 陈义 吴斌；肝病研究室 任进余 崔红
关键词：
中华医学杂志920113
为了进一步明确病原，我们对既入诊断为非甲非乙型肝炎(NANBBH)患者的血清，应用聚合酶链反应(PCR)技术检测了HBV DNA。
一、材料和方法
1.血清标本：为我科1989年月至1990年4月收信的28例曾论断为NANBH患者的低温保存血清，其中3例患者保存双份血清，合计31份。采血时均使用一次性抽血器，血样离心后，分装于两个新的1.5ml离心管，第一管作HBV-M，抗HAV IgM，抗-EBV(EB病毒)IgM及抗-CMV(巨细胞病毒)IgM，第二管低温保存。本实验所用血清为第二管未曾使用过的血清。该28例在住院期间曾用ELISA法多次检测HBV-M、抗-HAV IgM、抗-EBV IgM、抗-CMV IgM均为阴性，其中21例应用斑点杂交检测HBV DNA亦为阴性，并排除了药物、酒精等其它原因所致肝损伤，在缺乏对丙、戊型肝炎特异性论断方法的情况下，遂诊断为NANBH。
, 百拇医药
2.PCR扩增方法及试剂：FD-DNA聚合酶由复旦大学遗传所提供，HBV-C基因引物由上海市肿瘤防治研究所合成，DNA扩增方法采用血清直接法[中华传染病杂志 1990；8：6]
3.扩增后HBV DNA产物的鉴定，经39次热循环后取20µl产物于1.8%~2.0%琼脂糖凝胸部电泳，然后在三用紫外检测仪下观察，若在619bp处见到发现荧光DNA区带即为阳性，反之为阴性。
二、结果
1.实验的特异性：每批实验中均设立试剂盒所附带阴阳性对照，另外分别设10例HBV DNA阳性血清和10例正常人血清作为对照。结果阳性对照和10例HBV DNA阳性血清在619bp处可见明显DNA荧光区带，而阴性对照及10例正常人血清却未见任何DNA区带(附图)，由此说明结果特异可信。
, 百拇医药
附图 HBV DNA阳性血清(A)，正常人血清(B)、患者血清(C)及阴阳性对照的PCR产物琼脂糖凝胶
电泳结果(1为阴性对照，2为阳性对照)
2.被检血清PCR测定结果：28例既往诊断的NANBH血清中，14例(50%)检出HBV DNA。3例患者的双份血清结果完全一致，均为阳性，总检出率为54.8%(17/31)。
3.PCR检出HBV DNA患者的临床资料：14例中男9例，女5例，平均年龄23岁(3.5~43岁)。12例急性发病，2例发病缓慢，急性黄疸型肝炎11例，慢性活动性肝炎2例，慢性迁延型肝炎1例。多数病程短，预后良好，12例临床治愈，2例好转出院。
三、讨论
本研究所用的一对引物具有高度保守性，不能引发PBR-322DNA模板扩增[中华传染病杂志 1990；8：6]；血清标本在采集后留1ml分装在新的离心管低温保存，不作重复使用；反应管及吸头等均一次性使用，因此保证了实验结果的准确性。结果表明，用排除法论断的NANBH中有相当一部分仍为HBV感染。与骆抗先等报告[中华内科杂志 1991；30：21]结果一致。说明目前常规酶标法及斑点杂交不足以检出微量抗原、抗体及HBV DNA。
, http://www.100md.com
为什么会在HBV标志物全阴性的血清中检出HBV-DNA，目前尚不清楚，我们推测可能与下述因素有关：(1)病毒复制水平低或者机体免疫功能不全，能未能产生足量的抗原或抗体，故目前常规方法不检出。(2)本组14例HBV DNA阳性者多数为急性黄疸型肝炎，这些患者可能原为HBV无症状携带者，本次重叠感染了其他病毒(如丙型或戊型肝炎病毒)，由于病毒间的相互干扰作用，使HBV标志物表达受到抑制、降至检出水平以下。(3)最近有报道[国外医学流行病学传染病学分册 1988；15：193]单纯HBsAg阳性的HBV2感染在HBsAg转阴后也可不出现抗-HBs，因其DNA序列与HBV1有同源性，因此是否存在HBV2感染也值得进一步研究。
(1991年3月25日收稿 同年8月10日修回), 百拇医药