应用改良的滤纸夹芯技术检测硝酸纤维素膜抗原
作者：张云飞*
单位：首都儿科研究所病毒室
关键词：
中华医学杂志920121 我们在Douglas等[1]方法的基础上进一步改进，用滤纸夹芯技术和BAS系统偶联，对婴儿肝炎综合症患儿血清抗人巨细胞病毒(HCMV)lgG抗体进行了检测，并与传统方法做了比较。证明此法敏感性和特异性强，并能大大节省试剂，便于推广使用。
一、材料和方法
1.一般材料：电泳电转两用电源购自浙江海宁玻璃仪器厂，硝酸纤维素膜(NC)购自浙江黄岩人民化工厂，生物素-亲合素系统(BAS)由军事医学科学院流行病微生物研究所提供。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及电转：电泳前将纯化的HCMV抗原裂解(裂解液：1mmol/L Tris/HC1 pH7.0,1%SDS;2.5% 2-巯基乙醇，20%甘油及0.04%溴酚蓝)100℃水浴3分钟。参照Laemmli等[2]方法，用9%分离胶的不连续缓冲系统电泳。分离胶面积为13cm×20cm。起始电流20mA，待指示染料进入胶后改用40mA恒流电泳。电泳结束后，立即将胶片取下，按照Towbin等[3，4]的方法转移。电转条件为6～8V/cm，4℃恒压16～22小时。转移后，用铅笔在NC上作标记，将NC切成4～5mm×120mm小条。此条可直接应用或用滤纸压干后密封贮存于-20℃。
, 百拇医药
3.NC上蛋白质的检测：(1)为防止非特异反应，先用含0.05%叠氮钠的10%胎牛血清封闭NC条37℃1小时。(2)PBST漂洗两次。(3)将NC作成夹层结构如下：将滤纸裁成略宽于NC条的小条两条，大小约为6mm×120mm。将待检血清以1：50稀释后，用加样器慢慢浸湿两条滤纸条(约需0.25～0.3ml)。用滤纸条将NC条夹在中间，两测再覆以两块玻璃板，用弹簧夹夹紧后置于湿盒内4℃过夜。(4)PBST漂洗同前。(5)将生物素标记的羊抗人lgG以1：60稀释，用上述夹芯结构37℃孵育1小时。(6)漂洗后将酶标亲和素以1：30稀释，37℃1小时孵育后显色。中止后立即拍照。(7)用滤纸将NC条压干。
4.对照组：用传统方法将NC条浸于各步反应试剂中(同上)。每步需用2～5ml代替滤纸夹芯法。方法如下：按各步按NC条和试剂加入一个约0.5cm×1cm×6.5cm的塑料糟内摇晃孵育。
二、结果和讨论
, 百拇医药
本组使用节省试剂的滤纸夹芯技术用于免疫印迹法研究纯化人巨细胞病毒蛋白并与传统方法进行了比较。我们发现两种方法结果一致(附图)。应用此法并不降低敏感性和特异性。本法利用最小量的试剂检测抗原或抗体。应用5mm×120mm大小的两层滤纸，每次反应只需溶液0.25～0.30ml。而按常规方法，在反应盘内一次须耗用20～60ml，改进后也须5ml。所以用节省试剂的滤纸夹芯技术可以大大地节省宝贵的试剂，如人血清标本。若使用小电转槽及更小的NC条/滤纸条，会进一步节省。同时还可根据需要一次同时做多个样品的检测。但须注意这种操作在同时检则不同抗原时，切勿将NC条互相接触，以免产生假结果。我们应用“滤纸夹芯法“做三步法(BAS)结果与两步法(间接酶法)相同。对于放射性同位素标记的二抗应用，可能这种方法更为适用。因为从理论上讲，它最大限度地限制了“溢出“的危险并极大地减少了爆光时间。以我们的经验，一抗4℃孵育过液，而BAS室温1小时即可得到满意的结果，延长孵育时间并不能提高敏感性。如果抗原量小时，可适当延长孵育时间以提高其敏感性。本法所用材料简单，经济有效，敏感性和特异性较强。且操作容易，又不需昂贵仪器，便于在普通实验室推广使用。
, http://www.100md.com
A，B：BAS法染色；
C，D：传统方法染色
附图 滤纸夹心法与传统方法检测硝酸纤维膜上抗原结果的比较
参考文献
1.Douglas GC, King BF.A filter paper sandwich methold using small volumes of reagents for the detection of antigens electrophoretically transferred onto nitrocellulose, J Immuno Methods 1984; 75:333.
2.Laemmli Uk.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Natur(London)1970;227:680.
, 百拇医药
3.Towbin H,et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets; procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979;76:4350.
4.Burnette WN."Western blotting":electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.Anal Biochem 1981;112:195.
(1991年6月11日收稿), 百拇医药(张云飞*)
单位：首都儿科研究所病毒室
关键词：
中华医学杂志920121 我们在Douglas等[1]方法的基础上进一步改进，用滤纸夹芯技术和BAS系统偶联，对婴儿肝炎综合症患儿血清抗人巨细胞病毒(HCMV)lgG抗体进行了检测，并与传统方法做了比较。证明此法敏感性和特异性强，并能大大节省试剂，便于推广使用。
一、材料和方法
1.一般材料：电泳电转两用电源购自浙江海宁玻璃仪器厂，硝酸纤维素膜(NC)购自浙江黄岩人民化工厂，生物素-亲合素系统(BAS)由军事医学科学院流行病微生物研究所提供。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及电转：电泳前将纯化的HCMV抗原裂解(裂解液：1mmol/L Tris/HC1 pH7.0,1%SDS;2.5% 2-巯基乙醇，20%甘油及0.04%溴酚蓝)100℃水浴3分钟。参照Laemmli等[2]方法，用9%分离胶的不连续缓冲系统电泳。分离胶面积为13cm×20cm。起始电流20mA，待指示染料进入胶后改用40mA恒流电泳。电泳结束后，立即将胶片取下，按照Towbin等[3，4]的方法转移。电转条件为6～8V/cm，4℃恒压16～22小时。转移后，用铅笔在NC上作标记，将NC切成4～5mm×120mm小条。此条可直接应用或用滤纸压干后密封贮存于-20℃。
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3.NC上蛋白质的检测：(1)为防止非特异反应，先用含0.05%叠氮钠的10%胎牛血清封闭NC条37℃1小时。(2)PBST漂洗两次。(3)将NC作成夹层结构如下：将滤纸裁成略宽于NC条的小条两条，大小约为6mm×120mm。将待检血清以1：50稀释后，用加样器慢慢浸湿两条滤纸条(约需0.25～0.3ml)。用滤纸条将NC条夹在中间，两测再覆以两块玻璃板，用弹簧夹夹紧后置于湿盒内4℃过夜。(4)PBST漂洗同前。(5)将生物素标记的羊抗人lgG以1：60稀释，用上述夹芯结构37℃孵育1小时。(6)漂洗后将酶标亲和素以1：30稀释，37℃1小时孵育后显色。中止后立即拍照。(7)用滤纸将NC条压干。
4.对照组：用传统方法将NC条浸于各步反应试剂中(同上)。每步需用2～5ml代替滤纸夹芯法。方法如下：按各步按NC条和试剂加入一个约0.5cm×1cm×6.5cm的塑料糟内摇晃孵育。
二、结果和讨论
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本组使用节省试剂的滤纸夹芯技术用于免疫印迹法研究纯化人巨细胞病毒蛋白并与传统方法进行了比较。我们发现两种方法结果一致(附图)。应用此法并不降低敏感性和特异性。本法利用最小量的试剂检测抗原或抗体。应用5mm×120mm大小的两层滤纸，每次反应只需溶液0.25～0.30ml。而按常规方法，在反应盘内一次须耗用20～60ml，改进后也须5ml。所以用节省试剂的滤纸夹芯技术可以大大地节省宝贵的试剂，如人血清标本。若使用小电转槽及更小的NC条/滤纸条，会进一步节省。同时还可根据需要一次同时做多个样品的检测。但须注意这种操作在同时检则不同抗原时，切勿将NC条互相接触，以免产生假结果。我们应用“滤纸夹芯法“做三步法(BAS)结果与两步法(间接酶法)相同。对于放射性同位素标记的二抗应用，可能这种方法更为适用。因为从理论上讲，它最大限度地限制了“溢出“的危险并极大地减少了爆光时间。以我们的经验，一抗4℃孵育过液，而BAS室温1小时即可得到满意的结果，延长孵育时间并不能提高敏感性。如果抗原量小时，可适当延长孵育时间以提高其敏感性。本法所用材料简单，经济有效，敏感性和特异性较强。且操作容易，又不需昂贵仪器，便于在普通实验室推广使用。
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A，B：BAS法染色；
C，D：传统方法染色
附图 滤纸夹心法与传统方法检测硝酸纤维膜上抗原结果的比较
参考文献
1.Douglas GC, King BF.A filter paper sandwich methold using small volumes of reagents for the detection of antigens electrophoretically transferred onto nitrocellulose, J Immuno Methods 1984; 75:333.
2.Laemmli Uk.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Natur(London)1970;227:680.
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3.Towbin H,et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets; procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979;76:4350.
4.Burnette WN."Western blotting":electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.Anal Biochem 1981;112:195.
(1991年6月11日收稿), 百拇医药(张云飞*)