聚合酶链反应对单一抗HBc阳性的乙型肝炎病毒携带者的检测*
作者：骆抗先 何超 周荣 阵伟华 何海棠 林汝洪 梁炽森
单位：第一军医大学南方医院Δ 骆抗先 何超 周荣 阵伟华 何海棠 林汝洪 梁炽森
关键词：聚合酶链反应；肝炎抗体；乙型肝炎病毒
中华医学杂志920103
摘要 用聚合酶链瓜对三个人群进行血清流行病学调查。人群单一抗HBc检出率分别为7.1%(21/294)、9.8%(193/1995)和6.1%(23/377)。在单一抗HBc(+)血清中，HBV DNA检出率分别为28.6%(6/21)、35.2%(68/193)和30.4%(7/23)。HBV DNA(+)者分别在0.5、4和2年后随访，仍有83.3%(5/6)、93.1%(54/58)和71.4%(5/7)持续HBV DNA(+)，似可以是HBsAg(-)的慢性无症状HBV携带者。
, 百拇医药
血清中检出单一抗HBc(+)者，可能是潜在的乙型肝炎病毒(HBV)感染者，其血清可有传染性，已为早年的输血后肝炎的调查所证明[1]，但尚缺少直接的病毒学证据。原因是习用的分子杂交技术的灵敏性(1×105病毒/ml)难以检出最低传染水平(1×102病毒/ml的病毒携带者。最近发展的聚合酶链反应(PCR)，可将病毒基因组的一个区段进行几何级数量扩增，可能检出一次试验样品中的数个病毒，与猩猩实验的传染性浓度近似[2]。为阐明上述潜在感染者在人群中的存在状态，并探讨是否构成另一类型的慢型无症状HBV携带者(AsC)，我们对一些人群以PCR进行血清流行病学调查和随访。
对象和方法
一、调查对象
(1)粤北某山村采血294人，占全村人口的92.6%，对其中血清单一抗HBc(+)/HBV DNA(+)(PCR)者6个月后进行随访。(2)4年前在海南某东省山村采血1995人，采血率95.1%，冻存的单一抗HBc(+)血清进行PCR，对检出HBV DNA者随访复检。(3)在某监狱历年肝炎普查后冻存的血清中，抽查有1987和1989年双份血清者337人，对其中单一抗HBc(+)者的血清进行PCR，分析双份血清的结果。以上病例在观察期间均无肝病相关症状，平行检测的血清谷丙转氨酶正常。
, 百拇医药
二、血清HBV标志物
HBsAg、抗HBs和抗HBc检测用固相放射免疫法，试剂盒本实验室自备，经与相应Abbott试剂盒参比，符合率95%~98%，HBsAg灵敏性0.5ng/ml。检测抗HBc时血清1：100稀释，抑制率>50%为有反应，范围51%~103%；同份血清复检用酶联免疫法，试剂盒由军事医学科学院提供，仍有反应者判定为阳性。
三、PCR
血清100µl，经蛋白酶K消化、饱和酚抽提、乙醇沉演后悬浮于TE缓冲液10µl中。引物为按HBV DNA/S基因区序列合成的一对寡核苷酸，分别占427~448位和R839~822位。在反应管中加入10×反应缓冲液(250mmol/L pH 8.2 Tris, 25 mmol/L MgC2，250mmol/L (NH4)2SO2，100mmol/L βME，2mg/ml明胶)2.5µl，一对引物各25pmol/L，dNTP(华美试剂公司)各10mmol/L，加水至19µl，最后加待检样品5µl。初次于93ºC水浴5分钟变性后，加FD-DNA聚合酶(复旦大学遗传研究所提供)2U/µl。以少量液体石蜡覆盖。循环周期依次为93ºC45秒(变性)、50ºC1分钟(退火)和70ºC2分钟(反应延伸)，35周期，最后反应10分钟结束。扩增产物在含0.5µg/ml溴乙啶的琼脂糖电泳后，紫外光下观察特定分子大小的区带荧光；并经Southern吸印转移后，以[32P]CTP(北京福瑞公司提供)标记的全基因探针(本室自备)杂交，胶片显影(附图)。
, 百拇医药
泳道
1
2
3
4
5
6
7
血清稀释
10-1
10-2
10-3
10-4
, 百拇医药
10-5
10-6
10-7
相当于未稀释血清
0.5µl
10.5nl
5nl
0.5nl
50pl
5pl
0.5pl
相当于病毒颗粒
, http://www.100md.com
1pg
0.1pg
10fg
1fg
0.1fg
10ag
1ag
泳道8为分子标志
上图 PCR-溴乙啶染 下图 PCR-southern吸印杂交
附图 一份含HBV DNA2ng/ml的血清PCR测定
结果
一、人群中抗HBc的存在状态(表1)
, http://www.100md.com
在粤北某山村、海南某山村和粤北某监狱普查总人数为2666人，从中检出HBsAg持续6个月以上者依次为65(22.1%)，231(11.6%)和95例(25.1%)，抗HBs阳性者依次为118、401和171例抗，抗HBsAg并存依次为51、196和86例，抗HBc与抗HBs并存依次为53、327和77例，单一抗HBc阳性依次为21(7.2%)、193(9.7%)和23例(5.1%)。有一项上HBV感染标志者依次为150、825和305例，感染率依次为51.0%，41.4%和81.1%。
表1 三个人群2 666人中血清抗HBc的存在状态 血清抗HBc的存在状态
例数
占抗HBc(+)
总数的%
占总人数
, http://www.100md.com
的%
抗HBc(+)/HBsAg(+)
333
32.4
12.5
抗HBc(+)/HBs(+)
457
44.5
17.1
单项抗HBc(+)
237
23.1
, 百拇医药 8.9
抗HBc(+)总数
1027
100.0
38.5
二、单一抗HBc(+)者中的HBV DNA检出结果(表2)
表2 单一抗HBc(+)者中HBV DNA的检出结果 调查人群
人数
例数(%)
抗HBc(+)
总数
单一抗
, 百拇医药
HBc(+)
HBV DNA
(+)
粤北某山村
294
124(42.5)
21(7.1)
6(2.0)
海南某山村
1 995
716(35.9)
193(9.7)
, http://www.100md.com
68(3.4)
粤北某监狱
377
185(49.3)
23(6.1)
7(1.9)
合计
2 666
1027(39.5)
237(8.9)
81(3.0)
在单一抗HBc(+)病例中以PCR检出HBV DNA者81例(占全人群的3.0%)，其中可以溴乙啶显示者51例(血清水平0.01~1pg/ml)，须再经Southern吸印杂交始能检出者30例(0.1~10fg/ml)。
, http://www.100md.com
三、HBV DNA(+)者的随访结果见表3。
表3 三个人群HBV DNA(+)者的随访结果 调查人群
初检HBV DNA阳性例数
随访
例数
复检血清阳性例数
HBV DNA
HBsAg
抗HBc
抗HBs
粤北某山村
6
, 百拇医药
6
5
0
6
0
海南某山村
68
58
54
1
54
0
粤北某山村
7
, 百拇医药
7
5
0
7
0
注：复检距初检时间依次为：0.5、4和1年
讨论
血清检出单一抗HBc，首先须肯定其特异性。有报告单一抗HBc在同一血清可重复检出者仅66%，0.5~3个月仍能检出者又仅是基中的73%[3]。抗HBc可有47%的假阳性[4]。本次普查中我们先用放射免疫法筛选，继用酶联免法复检，可比较真实地反映抗HBc(+)的存在。
PCR检测HBV DNA有极高的灵敏性。本组PCR直接电泳观察和转移杂交的灵敏性分别为1fg和0.01fg左右[5]。本实验中：(1)扩增片段符合预期的分子大小(引物427与830的扩增分子为413bp)；(2)HBV探针杂交(附图)；(3)每一操作步骤均设置平行的阴性对照；(4)严格操作规程，防止交叉污染[6]。因而，PCR具特异性。可以认为本结果(阳性和阴性)反映了人群中HBV DNA携带的真实情况。
, 百拇医药
单一抗HBc(+)血清用PCR检出HBV DNA者，我们观察的三个人群分别占28.6%、35.2%和30.4%，表明有低水平的病毒复制。三个人群分别在半年、4年和蔼年后随访，HBV DNA持续存在者依次占83.3%、93.1%和71.4%。这些病例并无肝病相关症状和血清丙氨酸转氨酶增高，亦未检出HBsAg，似有理由认定为HBsAg(-)的慢性无症状HBV携带者。
单一抗HBc(+)血清PCR未检出HBV DNA者，可能有两种情况：(1)曾经历短暂的亚临床HBV感染，抗HBc未同时产生或已先行消失，抗HBc成为既往感染的唯一标志物；(2)肝内有事例型HBV DNA而无病毒复制[7]。
本次血清流行病学调查中，粤北、海南和监狱的三个人群HBsAg(+)AsC分别为22.1%、11.6%和25.1%，另外在占受检总人数8.9%的单一抗抗HBc(+)者中34.2%(81/237)用PCR可检出HBV DNA，这类HBV DNA(+)者约占受检总人数的3%。这表明存在AsC的另一种类型，即HBsAg(-)AsC。将这两类AsC相加，才能比较接近实际地反映人群中存在的AsC总体。
, 百拇医药
参考文献
1.Hoofnagle JH, et al. Type B hepatitis after transfusion with blood containing antibody to hepatitis B core antigen. NEngl J Med 1978; 298:1379.
2.Ulrich PP. et al. Enzymatic amplification of hepatitis Bvirus DNAin serum compared with infectivity testing in chimpanzees. JInfect Dis 1989; 160:37.
3.Lok ASF, et al. Prevalence of isolated antibody to hepatitis Bcore antigen in an area endemic for hepatitis Bvirus infection: implications in hepatitis B vaccination programs. Hepatology 1988; 8:766.
, http://www.100md.com
4.Sällberg M, Magnius LO.Enzyme immunoassay for anti-hepatitis B core (HBc) immunlglobulin Gl and significance of low-level results in compertitive assays for anti-HBc.J Clin Miorobiol 1989; 27:849.
5.骆抗先，等.聚合酶链反应鉴定HBsAg阴性慢性活动性肝炎中的乙型肝炎病毒感染，中华内科杂志1991; 30:19.
6.Kwok S. Higuchi R. Avoiding false positives with PCR Nature 1989; 339:237.
7.Lai MY, et al. Identification and characterization of intrahepatic hepatitis Bvirus DNA in HBsAg-seronegative patients with chronic liver disease and hepatocellular carcinoma in Taiwan. Hepatology 1990; 12:575.
(1991年2月5日收稿 同年8月5日修回), http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院Δ 骆抗先 何超 周荣 阵伟华 何海棠 林汝洪 梁炽森
关键词：聚合酶链反应；肝炎抗体；乙型肝炎病毒
中华医学杂志920103
摘要 用聚合酶链瓜对三个人群进行血清流行病学调查。人群单一抗HBc检出率分别为7.1%(21/294)、9.8%(193/1995)和6.1%(23/377)。在单一抗HBc(+)血清中，HBV DNA检出率分别为28.6%(6/21)、35.2%(68/193)和30.4%(7/23)。HBV DNA(+)者分别在0.5、4和2年后随访，仍有83.3%(5/6)、93.1%(54/58)和71.4%(5/7)持续HBV DNA(+)，似可以是HBsAg(-)的慢性无症状HBV携带者。
, 百拇医药
血清中检出单一抗HBc(+)者，可能是潜在的乙型肝炎病毒(HBV)感染者，其血清可有传染性，已为早年的输血后肝炎的调查所证明[1]，但尚缺少直接的病毒学证据。原因是习用的分子杂交技术的灵敏性(1×105病毒/ml)难以检出最低传染水平(1×102病毒/ml的病毒携带者。最近发展的聚合酶链反应(PCR)，可将病毒基因组的一个区段进行几何级数量扩增，可能检出一次试验样品中的数个病毒，与猩猩实验的传染性浓度近似[2]。为阐明上述潜在感染者在人群中的存在状态，并探讨是否构成另一类型的慢型无症状HBV携带者(AsC)，我们对一些人群以PCR进行血清流行病学调查和随访。
对象和方法
一、调查对象
(1)粤北某山村采血294人，占全村人口的92.6%，对其中血清单一抗HBc(+)/HBV DNA(+)(PCR)者6个月后进行随访。(2)4年前在海南某东省山村采血1995人，采血率95.1%，冻存的单一抗HBc(+)血清进行PCR，对检出HBV DNA者随访复检。(3)在某监狱历年肝炎普查后冻存的血清中，抽查有1987和1989年双份血清者337人，对其中单一抗HBc(+)者的血清进行PCR，分析双份血清的结果。以上病例在观察期间均无肝病相关症状，平行检测的血清谷丙转氨酶正常。
, 百拇医药
二、血清HBV标志物
HBsAg、抗HBs和抗HBc检测用固相放射免疫法，试剂盒本实验室自备，经与相应Abbott试剂盒参比，符合率95%~98%，HBsAg灵敏性0.5ng/ml。检测抗HBc时血清1：100稀释，抑制率>50%为有反应，范围51%~103%；同份血清复检用酶联免疫法，试剂盒由军事医学科学院提供，仍有反应者判定为阳性。
三、PCR
血清100µl，经蛋白酶K消化、饱和酚抽提、乙醇沉演后悬浮于TE缓冲液10µl中。引物为按HBV DNA/S基因区序列合成的一对寡核苷酸，分别占427~448位和R839~822位。在反应管中加入10×反应缓冲液(250mmol/L pH 8.2 Tris, 25 mmol/L MgC2，250mmol/L (NH4)2SO2，100mmol/L βME，2mg/ml明胶)2.5µl，一对引物各25pmol/L，dNTP(华美试剂公司)各10mmol/L，加水至19µl，最后加待检样品5µl。初次于93ºC水浴5分钟变性后，加FD-DNA聚合酶(复旦大学遗传研究所提供)2U/µl。以少量液体石蜡覆盖。循环周期依次为93ºC45秒(变性)、50ºC1分钟(退火)和70ºC2分钟(反应延伸)，35周期，最后反应10分钟结束。扩增产物在含0.5µg/ml溴乙啶的琼脂糖电泳后，紫外光下观察特定分子大小的区带荧光；并经Southern吸印转移后，以[32P]CTP(北京福瑞公司提供)标记的全基因探针(本室自备)杂交，胶片显影(附图)。
, 百拇医药
泳道
1
2
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血清稀释
10-1
10-2
10-3
10-4
, 百拇医药
10-5
10-6
10-7
相当于未稀释血清
0.5µl
10.5nl
5nl
0.5nl
50pl
5pl
0.5pl
相当于病毒颗粒
, http://www.100md.com
1pg
0.1pg
10fg
1fg
0.1fg
10ag
1ag
泳道8为分子标志
上图 PCR-溴乙啶染 下图 PCR-southern吸印杂交
附图 一份含HBV DNA2ng/ml的血清PCR测定
结果
一、人群中抗HBc的存在状态(表1)
, http://www.100md.com
在粤北某山村、海南某山村和粤北某监狱普查总人数为2666人，从中检出HBsAg持续6个月以上者依次为65(22.1%)，231(11.6%)和95例(25.1%)，抗HBs阳性者依次为118、401和171例抗，抗HBsAg并存依次为51、196和86例，抗HBc与抗HBs并存依次为53、327和77例，单一抗HBc阳性依次为21(7.2%)、193(9.7%)和23例(5.1%)。有一项上HBV感染标志者依次为150、825和305例，感染率依次为51.0%，41.4%和81.1%。
表1 三个人群2 666人中血清抗HBc的存在状态 血清抗HBc的存在状态
例数
占抗HBc(+)
总数的%
占总人数
, http://www.100md.com
的%
抗HBc(+)/HBsAg(+)
333
32.4
12.5
抗HBc(+)/HBs(+)
457
44.5
17.1
单项抗HBc(+)
237
23.1
, 百拇医药 8.9
抗HBc(+)总数
1027
100.0
38.5
二、单一抗HBc(+)者中的HBV DNA检出结果(表2)
表2 单一抗HBc(+)者中HBV DNA的检出结果 调查人群
人数
例数(%)
抗HBc(+)
总数
单一抗
, 百拇医药
HBc(+)
HBV DNA
(+)
粤北某山村
294
124(42.5)
21(7.1)
6(2.0)
海南某山村
1 995
716(35.9)
193(9.7)
, http://www.100md.com
68(3.4)
粤北某监狱
377
185(49.3)
23(6.1)
7(1.9)
合计
2 666
1027(39.5)
237(8.9)
81(3.0)
在单一抗HBc(+)病例中以PCR检出HBV DNA者81例(占全人群的3.0%)，其中可以溴乙啶显示者51例(血清水平0.01~1pg/ml)，须再经Southern吸印杂交始能检出者30例(0.1~10fg/ml)。
, http://www.100md.com
三、HBV DNA(+)者的随访结果见表3。
表3 三个人群HBV DNA(+)者的随访结果 调查人群
初检HBV DNA阳性例数
随访
例数
复检血清阳性例数
HBV DNA
HBsAg
抗HBc
抗HBs
粤北某山村
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海南某山村
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注：复检距初检时间依次为：0.5、4和1年
讨论
血清检出单一抗HBc，首先须肯定其特异性。有报告单一抗HBc在同一血清可重复检出者仅66%，0.5~3个月仍能检出者又仅是基中的73%[3]。抗HBc可有47%的假阳性[4]。本次普查中我们先用放射免疫法筛选，继用酶联免法复检，可比较真实地反映抗HBc(+)的存在。
PCR检测HBV DNA有极高的灵敏性。本组PCR直接电泳观察和转移杂交的灵敏性分别为1fg和0.01fg左右[5]。本实验中：(1)扩增片段符合预期的分子大小(引物427与830的扩增分子为413bp)；(2)HBV探针杂交(附图)；(3)每一操作步骤均设置平行的阴性对照；(4)严格操作规程，防止交叉污染[6]。因而，PCR具特异性。可以认为本结果(阳性和阴性)反映了人群中HBV DNA携带的真实情况。
, 百拇医药
单一抗HBc(+)血清用PCR检出HBV DNA者，我们观察的三个人群分别占28.6%、35.2%和30.4%，表明有低水平的病毒复制。三个人群分别在半年、4年和蔼年后随访，HBV DNA持续存在者依次占83.3%、93.1%和71.4%。这些病例并无肝病相关症状和血清丙氨酸转氨酶增高，亦未检出HBsAg，似有理由认定为HBsAg(-)的慢性无症状HBV携带者。
单一抗HBc(+)血清PCR未检出HBV DNA者，可能有两种情况：(1)曾经历短暂的亚临床HBV感染，抗HBc未同时产生或已先行消失，抗HBc成为既往感染的唯一标志物；(2)肝内有事例型HBV DNA而无病毒复制[7]。
本次血清流行病学调查中，粤北、海南和监狱的三个人群HBsAg(+)AsC分别为22.1%、11.6%和25.1%，另外在占受检总人数8.9%的单一抗抗HBc(+)者中34.2%(81/237)用PCR可检出HBV DNA，这类HBV DNA(+)者约占受检总人数的3%。这表明存在AsC的另一种类型，即HBsAg(-)AsC。将这两类AsC相加，才能比较接近实际地反映人群中存在的AsC总体。
, 百拇医药
参考文献
1.Hoofnagle JH, et al. Type B hepatitis after transfusion with blood containing antibody to hepatitis B core antigen. NEngl J Med 1978; 298:1379.
2.Ulrich PP. et al. Enzymatic amplification of hepatitis Bvirus DNAin serum compared with infectivity testing in chimpanzees. JInfect Dis 1989; 160:37.
3.Lok ASF, et al. Prevalence of isolated antibody to hepatitis Bcore antigen in an area endemic for hepatitis Bvirus infection: implications in hepatitis B vaccination programs. Hepatology 1988; 8:766.
, http://www.100md.com
4.Sällberg M, Magnius LO.Enzyme immunoassay for anti-hepatitis B core (HBc) immunlglobulin Gl and significance of low-level results in compertitive assays for anti-HBc.J Clin Miorobiol 1989; 27:849.
5.骆抗先，等.聚合酶链反应鉴定HBsAg阴性慢性活动性肝炎中的乙型肝炎病毒感染，中华内科杂志1991; 30:19.
6.Kwok S. Higuchi R. Avoiding false positives with PCR Nature 1989; 339:237.
7.Lai MY, et al. Identification and characterization of intrahepatic hepatitis Bvirus DNA in HBsAg-seronegative patients with chronic liver disease and hepatocellular carcinoma in Taiwan. Hepatology 1990; 12:575.
(1991年2月5日收稿 同年8月5日修回), http://www.100md.com