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编号:10239497
雌性激素对心钠素基因表达的影响*
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 1992年第1期
     作者:洪敏 燕秋 陈孝英 殷蓉蓉

    单位:白求恩医科大学生物化学教研室Δ

    关键词:钠利尿肽类,心房;雌二醇;孕酮激素类;核糖核酸

    中华医学杂志920109 摘要 给切除双侧卵巢的雌性大鼠分别注射不同剂量的雌二醇、孕酮或二者混合物,每日1次,连续7天。用α-32P标记的大鼠rANF-cDNA探针与各组大鼠心房总RNA做Northern blot和Dot blot杂交。结果表明,切除卵巢后,心房rANF-cRNA含量减少;雌二醇和孕酮可使rANF-cRNA含量增加,其作用表现出剂量依赖性和可能的协同性。提示雌性激素对体液平衡可能有双重作用。

    人心钠素(RNA)基因位于1号染色体短臂远端,长约2 100碱基对(bp),编码了151个氨基酸残基的心钠素前体原(prepro-ANF),其C未端28个氨基酸残基肽即是血浆中ANF,它是机体促进水钠排出维持体液稳定的重要因素[1]。女性经前期综合征、妊娠、口服避孕药等情况下,体内雌、孕激素含量大大增加,往往伴有水钠潴留。此时这两个激素对ANF的影响、作用机制及生理、病生理意义尚不清楚,各家报告结果亦不相同[2,3]。本实验旨在转录水平研究它们对ANF的影响。
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    材料与方法

    雌二醇(E2)和孕酮(P)分别为Merck及Sigma公司产品,两个激素均溶于橄榄油溶剂中。E2浓度分别为400ng/ml和400µg/ml,P浓度为1mg/m和l0mg/ml,混合剂为E2400ng和P1mg/ml。Nict Translation Kit和Bochringer Mannheim公司产品。限制性内切酸Pst I等均购自华美公司。α-32P-dATP为Free公司产品,质粒pNI-11。

    一、动物处理

    雌性Wistar大鼠(体重230~289g),7组,每组10只。乙醚麻醉下无菌手术。1组为伪手术组,切开皮肤后即缝合,保留卵巢;2~7组为手术组,摘除双侧卵巢。手术后48小时开始皮下注射激素溶液或橄榄油,每日1次,连续7天。药物剂量参照文献[4]确定,以每百克体重计量:1组和2组,0.2ml橄榄油;3组89ngE2;4组,80µgE2,5组0.2mg P;6组,2mg P:7组,80µgE2和0.02mg P混合液。
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    二、血清Na+浓度测定

    在最后一次注射后第2天,大鼠用乙醚麻醉,摘除眼球收集血液,分离血清。用Corning902火焰光度计测量Na+浓度。

    三、心房总RNA提取

    取血后,大鼠断头处死,迅速摘取双侧心房,吸去血渍,置液氮中保存至RNA提取。用修改后的冷酚法[5]提取RNA。最终RNA溶于1×TE溶液中(10mmol/L Tris-HCI,pH8.0,1mmol/L EDTA-2Na)。测定RNA溶液的260nm和280吸光盘,按1吸光度260nm=40µg/ml计算含量。

    四、rANF-cDNA探针制备

    大鼠rANF-cDNA克隆在pGEM-2的pstI位点中即pNI-11[6],长度约为650 bp,按Nick Translation Kit提供的方案制备α-32标记的rANF-cDNA探针。
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    五、分子杂交和放射自显影

    斑点吸印(Dot blot):在96孔培养板内,将RNA用10×SSC溶液(1.55mol/L氯化钠中,150mmol/L枸椽酸钠,pH7.2)连续加倍稀释至所需浓度。用Dot blot装置将RNA抽滤到0.45µm的硝酸纤维素膜(NC)上。

    RNA电泳转移吸印(Northern blot):5µl(20µl)RNA样品经甲醛变性处理后在甲醛变性胶中电泳。电泳后切下对照胸胶,溴乙啶染色,紫外灯下记录28 S和18S RNA的电泳距离。将其余样品胶中RNA用10×SSC溶液被动吸渍到NC膜上。Dot和Northern blot的NC膜80ºC烘烤2小时固定。

    分子杂交方法及液体成份见参考文献[5]。42ºC预杂交4小时;之后倒出预杂交液,加入rANF-cDNA探针,煮沸变性10分钟,冰浴速冷后再装入塑料袋中杂交,57ºC,20小时;用1×SSC、0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)室温漂洗4次,每次15分钟,然后用0.1×SSC、0.1%SDS65ºC漂洗2次,每次1小时。将漂洗后的NC膜在滤纸上干燥后用保鲜膜包被,覆盖X线胶片,加双增感屏,-60ºC曝光5~7天,放射自显影。
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    六、用LKB-2202激光密度扫描仪对斑点杂交信号进行密度扫描,比较各组杂交信号的强弱,结果表示成±s,按文献[7]方法进行统计学处理。

    结果

    RNA样品的吸光度260nm/吸光度280nm≥1.8,纯度合格。根据Northern blot试验中28S RNA、18S RNA和大鼠心钠素前体原mRNA(简称rANF-mDNA)泳距(图1),计算rANF-mDNA长约10碱基。此值与以往报告相似,表明提取过程中RNA未降解。

    A.28S RNA,3.1cm

, http://www.100md.com     B.18S RNA,4.3cm

    C.rANF-mRNA,4.7cm

    图1 样品RNA的Northern blot放射自显影

    图1中除了特异的rANF-mDNA杂交信号外,无其它杂交信号,也表明了Dot blot信号是特异性的。在northern blot试验中,各组rANF-mDNA泳距相同,但杂交信号强弱不同,表明各组试验因素影响了ANF基因转录产物的量而未影响转录物的长度。各组信号强弱与Dot blot相似。 Dot blot放射自显影见图2。以2组斑点杂交信号密度为100%(100±18%),1及3~7组的相对密度比依次为133±17%、110%±6%、197±8%、193±7%、230±20%、207%±14%。4、5、6、7组与2组比较,P均<0.05。±
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    每行斑点总RNA量(µg):A.25,B.

    12.5,C.6.25,D3.13,E.1.6

    图2 样品RNA的Dot blot放射自显影

    切除卵巢后心房rANF-mDNA含量减少,其值是伪手术组的75%(P<0.05);小剂量E2(80ng)对rANF-mDNA影响不大;大剂量E2(80µg)、小剂量P(0.2mg),大剂量P(2mg)以及小剂量激素混合液(80ngE2和0.2mgP)均使rANF-mDNA含量明显增多,分别人切除卵巢对照组的2.0、1.9、2.3和2.1倍,差异有显著意义(P<0.05)。

    1~7组血清Na+浓度分别为139±5、141±6、144±4、140±4、143±5、142±4和139±4mmol/L,各组间差异无显著意义(P>0.05)
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    讨论

    ANF基因是相当保守的,许多哺乳类动物ANF基因有很高的同源性。动物实验为ANF基因表达与调控研究提供了可能。本实验结果表明雌二醇和孕酮可明显增加rANF-mDNA含量,表现出一定程度的剂量依赖性,两者可能还有协同作用。一般说来细胞内mRNA含量的高低是决定其编码肽生物合成活跃程度的关键因素。因此,本结果支持那些在雌、孕激素含量增多时血中ANF也增加的报告[2,8]。雌、孕激素促进ANF基因表达可能有重要意义。在前述女性生理、病生理过程中,雌、孕激素既是引起水钠潴留的因素之一,另一方面它们又明显促进ANF基因表达,从而啬水钠排出,减少循环血量,这对于维持持液平衡及血压稳定都有重要作用。

    雌、孕激素促进ANF基因表达作用是来自于它们与相应受体结合促进转录,还是稳定已转录出来的mRNA,目前实验还不能区别出来。但现有理论倾向于前者,即促进转录[9]。我们曾证实糖皮质激素也可以促进ANF基因转录,看来此基因可受多种甾体激素影响。我们已经报告了盐负荷和脱水早期时ANF基因表达与血将Na+浓度无显著差异,表明rANF-mDNA含量改变与血清Na+无直接关系。
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    另外雌、孕激素对ANF基因表达影响虽然表现出剂量依赖性,但又不完全平行。这可能与受体含量及激素受体饱和度有关。实验表明过多激素反而造成相应受体含量减少[10]

    参考文献

    1.Blaine EH. Atrial natriuretic factor plays a significant role in body fluid homostasis. Hypertension 1990; 15:2.

    2. Gregoire I, et al. Plasma ANF and urinary excretion of a ouabain displacing factor and dopamine in normotensive pregnant women before and arter delivery. Am J Obstet Gynecol 1990; 162:71.
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    3.Hatjis CG, et al. Interrelationship between ANF concentrations and acute volume expansion in pregnant and nompregnant women. Am J Obster Gynecol 1990; 163:45.

    4.程秀娟,等.前列腺E2对小鼠蜕膜反应的抑制作用.生殖与避孕 1984;4:31.

    5.Hong M. et al. The effects of salt-loading and dehydration on ANP gene expression. Comp Biochem Physiol 1990;97B:205.

    6.洪敏,等.体外转录系统质粒pNI-11和pNI-12的构建.白求恩医科大学学报 1989;15:433.
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    7.Mercadier J, et al. Atrial natriuretic factor mRNA and peptide in the human heart during ontogenic development. Biochem Biophys Res Commun 1989; 159:777.

    8.Davidson B J, et al. ANP plasma renin activity and aldosterone in women on estrogen therapy and with premenstrual syndrome. Fertil Steril 1988; 50:743.

    9.Miguel Beato. Gene regulation by steroid hormones. Cell 1989; 56:335.

    10.Berthois Y, et al. Expression of estrogen receptor and its mRNA in the MCF-7 cell line: multiparametric analysis of its processing and regulation by estrogen Mol Cell Endocrinol 1990; 74:11.

    (1991年4月4日收稿 同年8月22日修回), http://www.100md.com