系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中白细胞介素1与转化生长因子β的mRNA基因表达
作者：赵志辉 王海燕 章友康 李健 鄂洁
单位：(北京医科大学第一医院肾脏病中心，100034)
关键词：白细胞介素1；转化生长因子；肾上球肾炎
中华医学杂志920402
摘要 应用分子杂交技术研究了系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中白细胞介素1(IL 1)与转化生长因子β(TGFβ)的mRNA基因表达。证实IL1与TGFβmRNA基因表达与肾小球的病理改变及细胞外基质积聚密切相关。
肾小球系膜细胞(MSC)及细胞外基质的积聚是肾小球硬化的重要病理特征。现已证明系膜细胞自身产生的IL1可促进系膜细胞增殖[1]，提示IL1的自分泌和旁分泌作用在肾小球炎症、硬化过程中起着重要作用[2]。近年来发现转化生长因子β(TGFβ)在细胞外基质的合成中起着一定作用。本研究旨在探讨系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中IV型胶原，纤维连结蛋白(FN)，层粘连蛋白(LN)合成的动态变化和IL-1与TGFβmRNA基因表达及其间的关系。
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材料和方法
1、系膜增殖性肾炎模型的制作[3]：将雄性SD大鼠(120～150g)随机分为2组：(1)系膜增殖性(ATS)肾炎组：35只大鼠尾静脉注射抗胸腺细胞抗血清(由美国华盛顿大学Johnson博士惠赠)0.7ml/100g体重；(2)20只大鼠为正常对照。分别在实验的3、7、14、28和60天处死动物，摘取双侧肾脏。
在注射前2周，每天测定24小时尿蛋白(三氯醋酸法)，以后每周测定1次。
2、病理学检查：取肾组织分别作光镜和间接免疫荧光检查。兔抗大鼠IV型胶原、LN抗血清、兔抗牛FN抗血清由北京医科大学细胞生物教研室提供，荧光标记的羊抗兔荧光抗体购自军事医学科学院。每组取3个不同肾组织作间接免疫荧光，观察IV型胶原、FN、LN的动态变化。
3、酶联免疫吸附法(ELISA)测定IV型胶原、FN、LN的含量[4]：(1)提取肾组织中IV型胶原、FN、LN：摘取肾脏，分离肾皮质，浸入丙酮内脱脂，干燥，磨碎，将肾组织干粉加入0.5mol/L醋酸抽提，4℃、10000r/min离心20分钟，取上清液。(2)按经典方法制作标准曲线及测定IV型胶原、FN、LN。由于肾组织中IV型胶原、FN、LN不能用本方法完全抽提出，所以用每克总蛋白含的毫克数来表示肾组织中IV型胶原、FN、LN的含量。
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4、质粒DNA扩增、纯化、探针的标记[5]：用碱变性法扩增pIL11301cDNA探针(美国Hoffmann-La Roche Inc惠赠)，TGFβ质粒DNA(澳大利亚Monash大学惠赠)。分别用BamHI和EcoRI限制性酶切(德国柏林格曼海姆公司)，低溶点胶回收DNA，其片段为1.9Kb和2.0Kb。用α-32P-dCTP(Du Pont公司)以随机引物法(美国Promaga公司)标记IL1、TGFβcDNA探针，标记DNA放射性可达1～2×108cpm/μg。
5、肾小球内总RNA的提取：按常规方法[6]分离肾小球，用异硫氰酸胍方法提取肾小球内总RNA。用紫外分光光度计测量RNA的量及纯度，吸光度260nm/吸光度280nm比值约在1.8～2.0。
6、Northern blot[5]：经乙二醛变性RNA进行凝胶电泳，转膜，将尼龙膜放入聚乙烯杂交袋中，加入预杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSPE(含氯化钠，磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸二钠盐)，1×Denhandt's溶液(含聚蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，牛血清白蛋白第V部分)，0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)，变性鲑鱼精子DNA，弃气泡，置42℃水浴24小时，倾出预杂交液，加入新鲜配制的杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSPE，0.1%SDS，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1×Denhardt's溶液，10%硫酸葡聚糖，及经100℃，5分钟处理的鲑精子DNA，32P标记的IL1或TGFβcDNA探针1～2×106cpm/ml，于42℃水浴杂交24小时。洗膜：倾出杂交液，用2×SSC(含氯化钠，枸橼酸钠)，0.1%SDS于室温轻轻振动20分钟3次，然后用0.2×SSC，0.1%SDS于50℃20分钟3次。-70℃进行放射自显影。电子计算机密度扫描处理。
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结 果
1、光镜检查：发现在ATS肾炎发病的第3天，肾小球有轻度系膜细胞增殖，到第7、14天有中、重度系膜细胞增殖，并伴有系膜基质的扩张，到第28、60天可见系膜基质扩张和局灶、节段性肾小球硬化。经间接免疫荧光检查发现，从ATS肾炎发病的第7天开始IV型胶原、FN、LN合成积聚明显增加，一直持续到第60天。
2、肾组织中IV型胶原、FN、LN的动态变化：从ATS肾炎发病第7天开始IV型胶原、LN、FN积聚明显增加，与对照组相比差异有非常显著意义(P<0.01)，一直持续到第60天(表1)。
表1 ATS肾炎发病过程中IV型胶原、LN、FN动态变化(
，mg/g) 组别
IV胶原
, 百拇医药
LN
FN
对照组
2.64±0.89
2.93±0.18
4.91±0.77
肾
炎
组
3(天)
1.45±0.22
2.32±0.67
2.39±0.79
, 百拇医药
7
29.39±2.40*
20.46±1.53*
17.95±1.05*
14
31.48±3.34*
23.66±1.65*
18.00±0.73*
28
21.19±1.31*
, 百拇医药
15.15±2.61*
19.55±0.42*
60
25.15±2.92*
19.02±0.33*
16.91±0.61*
注：与对照组比较 *P<0.01， n=4
3、ATS肾炎发病过程中IL1、TGFβmRNA基因表达：在ATS肾炎发病的第7天和第14天，IL1mRNA基因表达增加(图1)，经计算机图象分析，比对照组增加2～3倍(表2)。到第28天和60天与对照组相比无明显差异。同理，TGFβmRNA基因表达结果与IL1结果相同，比对照组增加2倍左右(图2，表2)。
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表2 ATS肾炎发病中IL1与TGFβmRNA基因表达*(IOD) 组别
IL1
TGFβ
对照组
691
2808
肾
炎
组
3(天)
891
3495
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7
2708
6381
14
1345
4865
28
988
4077
60
897
2302
* 计算机密度扫描
, 百拇医药
讨 论
肾小球硬化发病机理的研究是肾脏病学者共同关注的重要课题。1986年Sterze等[7]报告延长培养肾小球MSC可形成集落(Hillocrs)，类似于人类的肾小球硬化，分析其成分主要由I、III、IV型胶原，FN，LN等组成。作者认为细胞因子在集落形成过程中起着重要的调节作用。已知肾小球MSC可分泌多种细胞因子，而这些细胞因子又作用于MSC，调控MSC的生长、增殖、分泌及其它功能，因此，细胞因子及其自分泌和和旁分泌在肾小球炎症及硬化的发生发展过程中起着重要作用。
近年的研究表明，系膜硬化区主要由在正常肾小球就存在的细胞外基质成分(IV型胶原、FN、LN)等组成。在老龄大鼠肾小球硬化区发现有IV型胶原的沉积，说明肾小球内细胞也是细胞外基质的来源。近来许多作者研究认为IL1与胶原、LN、FN、蛋白多糖的合成分泌密切相关，是一个重要的细胞外基质合成的调节因子。Lovett等[8]证明培养的MSC能分泌IL1，而IL1又可刺激MSC增殖，证实IL1在IgA肾病的发病过程中起着重要的免疫调节作用[9]。Matsumoto等[10]，认为IL1可能在局灶、节段性肾小球硬化的发展过程中起着一定作用。
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图1 ATS肾炎发病过程中IL1mRNA基因表达
图2 ATS肾炎发病过程中TGFβmRNA基因表达
TGFβ是近年来人们所感兴趣的另一生长因子，TGFβ有着广泛的生物学活性，最为引人注目的是TGFβ可以促进细胞外基质的合成积聚。在培养的MSC内加入基因重组的TGFβ，或从系膜增殖性肾小球肾炎分离的肾小球培养上清液中均可诱导MSC合成分泌蛋白多糖。在ATS肾炎模型中加入抗TGFβ抗血清可减少蛋白多糖的合成[11]。
本研究结果表明，在静脉注射抗胸腺细胞抗血清后，病理学上发现有MSC增殖，系膜基质扩张，局灶节段性肾小球硬化。在ATS肾炎发病的第7天和14天，IL1与TGFβmRNA基因表达明显增加，较对照组高2～3倍，并伴有IV型胶原、FN、LN合成增加，当IL1与TGFβmRNA基因表达降至正常后，仍存在着细胞外基质的积聚。提示在ATS肾炎的进展过程中，IL1与TGFβmRNA基因表达的IV型胶原、FN、LN的合成积聚密切相关，并可能在肾小球硬化过程中起着重要作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Chen YP, et al. Self-regulation of mesangial cell proliferation by mesangial cell-derived IL-1 and PGE2. XI th International Congress of Nephrology, 1990:38A.
2 Shultz DJ, et al. The glomerular mesangium Role in initiation and progression of renal injure. Am J Kidney Dis 1991:17:8.
3 ramamoto T, et al. Quantitative and qualitative studies of antibody induced mesangial cell damage in the rat. Kidney Int 1987;32:514.
, 百拇医药
4 李玉瑞。细胞外间质的生物化学及研究方法，北京：人民卫生出版社，1982：232。
5 Sambrook J, et al. Gel electrophoresis of DNA. Molecular Cloning I. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;6 3-6 34.
6 Chomczynski P, et al. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 1987;162:156.
7 Sterzel RB, et al. Mesangial cell hillocks:Nodular foci of exaggerated growth of cells and matrix in prolonged culture. Am J Pathol 1986;125:130.
, 百拇医药
8 Lovett DH, et al. Stimulation of rat mesangial cell prolifertion by macrophage interleukin 1. J Immunol 1983;131:2830.
9 赵志辉等，白细胞介素1在系膜IgA沉积中的作用。中华肾脏病杂志 1991；7：70。
10 Matsumoto K, et al. Glomerular cells and macrophages in the progress of experimental focal and segmental glomerulosclerosis. Am J Pathol 1989;134:933.
11 Border WA, et al. Suppression of experimental glomerulonephritis by antiserum against transforming growth factor betal. Nature 1990;346:371., 百拇医药
单位：(北京医科大学第一医院肾脏病中心，100034)
关键词：白细胞介素1；转化生长因子；肾上球肾炎
中华医学杂志920402
摘要 应用分子杂交技术研究了系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中白细胞介素1(IL 1)与转化生长因子β(TGFβ)的mRNA基因表达。证实IL1与TGFβmRNA基因表达与肾小球的病理改变及细胞外基质积聚密切相关。
肾小球系膜细胞(MSC)及细胞外基质的积聚是肾小球硬化的重要病理特征。现已证明系膜细胞自身产生的IL1可促进系膜细胞增殖[1]，提示IL1的自分泌和旁分泌作用在肾小球炎症、硬化过程中起着重要作用[2]。近年来发现转化生长因子β(TGFβ)在细胞外基质的合成中起着一定作用。本研究旨在探讨系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中IV型胶原，纤维连结蛋白(FN)，层粘连蛋白(LN)合成的动态变化和IL-1与TGFβmRNA基因表达及其间的关系。
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材料和方法
1、系膜增殖性肾炎模型的制作[3]：将雄性SD大鼠(120～150g)随机分为2组：(1)系膜增殖性(ATS)肾炎组：35只大鼠尾静脉注射抗胸腺细胞抗血清(由美国华盛顿大学Johnson博士惠赠)0.7ml/100g体重；(2)20只大鼠为正常对照。分别在实验的3、7、14、28和60天处死动物，摘取双侧肾脏。
在注射前2周，每天测定24小时尿蛋白(三氯醋酸法)，以后每周测定1次。
2、病理学检查：取肾组织分别作光镜和间接免疫荧光检查。兔抗大鼠IV型胶原、LN抗血清、兔抗牛FN抗血清由北京医科大学细胞生物教研室提供，荧光标记的羊抗兔荧光抗体购自军事医学科学院。每组取3个不同肾组织作间接免疫荧光，观察IV型胶原、FN、LN的动态变化。
3、酶联免疫吸附法(ELISA)测定IV型胶原、FN、LN的含量[4]：(1)提取肾组织中IV型胶原、FN、LN：摘取肾脏，分离肾皮质，浸入丙酮内脱脂，干燥，磨碎，将肾组织干粉加入0.5mol/L醋酸抽提，4℃、10000r/min离心20分钟，取上清液。(2)按经典方法制作标准曲线及测定IV型胶原、FN、LN。由于肾组织中IV型胶原、FN、LN不能用本方法完全抽提出，所以用每克总蛋白含的毫克数来表示肾组织中IV型胶原、FN、LN的含量。
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4、质粒DNA扩增、纯化、探针的标记[5]：用碱变性法扩增pIL11301cDNA探针(美国Hoffmann-La Roche Inc惠赠)，TGFβ质粒DNA(澳大利亚Monash大学惠赠)。分别用BamHI和EcoRI限制性酶切(德国柏林格曼海姆公司)，低溶点胶回收DNA，其片段为1.9Kb和2.0Kb。用α-32P-dCTP(Du Pont公司)以随机引物法(美国Promaga公司)标记IL1、TGFβcDNA探针，标记DNA放射性可达1～2×108cpm/μg。
5、肾小球内总RNA的提取：按常规方法[6]分离肾小球，用异硫氰酸胍方法提取肾小球内总RNA。用紫外分光光度计测量RNA的量及纯度，吸光度260nm/吸光度280nm比值约在1.8～2.0。
6、Northern blot[5]：经乙二醛变性RNA进行凝胶电泳，转膜，将尼龙膜放入聚乙烯杂交袋中，加入预杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSPE(含氯化钠，磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸二钠盐)，1×Denhandt's溶液(含聚蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，牛血清白蛋白第V部分)，0.1%SDS(十二烷基硫酸钠)，变性鲑鱼精子DNA，弃气泡，置42℃水浴24小时，倾出预杂交液，加入新鲜配制的杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSPE，0.1%SDS，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1×Denhardt's溶液，10%硫酸葡聚糖，及经100℃，5分钟处理的鲑精子DNA，32P标记的IL1或TGFβcDNA探针1～2×106cpm/ml，于42℃水浴杂交24小时。洗膜：倾出杂交液，用2×SSC(含氯化钠，枸橼酸钠)，0.1%SDS于室温轻轻振动20分钟3次，然后用0.2×SSC，0.1%SDS于50℃20分钟3次。-70℃进行放射自显影。电子计算机密度扫描处理。
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结 果
1、光镜检查：发现在ATS肾炎发病的第3天，肾小球有轻度系膜细胞增殖，到第7、14天有中、重度系膜细胞增殖，并伴有系膜基质的扩张，到第28、60天可见系膜基质扩张和局灶、节段性肾小球硬化。经间接免疫荧光检查发现，从ATS肾炎发病的第7天开始IV型胶原、FN、LN合成积聚明显增加，一直持续到第60天。
2、肾组织中IV型胶原、FN、LN的动态变化：从ATS肾炎发病第7天开始IV型胶原、LN、FN积聚明显增加，与对照组相比差异有非常显著意义(P<0.01)，一直持续到第60天(表1)。
表1 ATS肾炎发病过程中IV型胶原、LN、FN动态变化(
，mg/g) 组别IV胶原
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LN
FN
对照组
2.64±0.89
2.93±0.18
4.91±0.77
肾
炎
组
3(天)
1.45±0.22
2.32±0.67
2.39±0.79
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7
29.39±2.40*
20.46±1.53*
17.95±1.05*
14
31.48±3.34*
23.66±1.65*
18.00±0.73*
28
21.19±1.31*
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15.15±2.61*
19.55±0.42*
60
25.15±2.92*
19.02±0.33*
16.91±0.61*
注：与对照组比较 *P<0.01， n=4
3、ATS肾炎发病过程中IL1、TGFβmRNA基因表达：在ATS肾炎发病的第7天和第14天，IL1mRNA基因表达增加(图1)，经计算机图象分析，比对照组增加2～3倍(表2)。到第28天和60天与对照组相比无明显差异。同理，TGFβmRNA基因表达结果与IL1结果相同，比对照组增加2倍左右(图2，表2)。
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表2 ATS肾炎发病中IL1与TGFβmRNA基因表达*(IOD) 组别
IL1
TGFβ
对照组
691
2808
肾
炎
组
3(天)
891
3495
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7
2708
6381
14
1345
4865
28
988
4077
60
897
2302
* 计算机密度扫描
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讨 论
肾小球硬化发病机理的研究是肾脏病学者共同关注的重要课题。1986年Sterze等[7]报告延长培养肾小球MSC可形成集落(Hillocrs)，类似于人类的肾小球硬化，分析其成分主要由I、III、IV型胶原，FN，LN等组成。作者认为细胞因子在集落形成过程中起着重要的调节作用。已知肾小球MSC可分泌多种细胞因子，而这些细胞因子又作用于MSC，调控MSC的生长、增殖、分泌及其它功能，因此，细胞因子及其自分泌和和旁分泌在肾小球炎症及硬化的发生发展过程中起着重要作用。
近年的研究表明，系膜硬化区主要由在正常肾小球就存在的细胞外基质成分(IV型胶原、FN、LN)等组成。在老龄大鼠肾小球硬化区发现有IV型胶原的沉积，说明肾小球内细胞也是细胞外基质的来源。近来许多作者研究认为IL1与胶原、LN、FN、蛋白多糖的合成分泌密切相关，是一个重要的细胞外基质合成的调节因子。Lovett等[8]证明培养的MSC能分泌IL1，而IL1又可刺激MSC增殖，证实IL1在IgA肾病的发病过程中起着重要的免疫调节作用[9]。Matsumoto等[10]，认为IL1可能在局灶、节段性肾小球硬化的发展过程中起着一定作用。
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图1 ATS肾炎发病过程中IL1mRNA基因表达
图2 ATS肾炎发病过程中TGFβmRNA基因表达
TGFβ是近年来人们所感兴趣的另一生长因子，TGFβ有着广泛的生物学活性，最为引人注目的是TGFβ可以促进细胞外基质的合成积聚。在培养的MSC内加入基因重组的TGFβ，或从系膜增殖性肾小球肾炎分离的肾小球培养上清液中均可诱导MSC合成分泌蛋白多糖。在ATS肾炎模型中加入抗TGFβ抗血清可减少蛋白多糖的合成[11]。
本研究结果表明，在静脉注射抗胸腺细胞抗血清后，病理学上发现有MSC增殖，系膜基质扩张，局灶节段性肾小球硬化。在ATS肾炎发病的第7天和14天，IL1与TGFβmRNA基因表达明显增加，较对照组高2～3倍，并伴有IV型胶原、FN、LN合成增加，当IL1与TGFβmRNA基因表达降至正常后，仍存在着细胞外基质的积聚。提示在ATS肾炎的进展过程中，IL1与TGFβmRNA基因表达的IV型胶原、FN、LN的合成积聚密切相关，并可能在肾小球硬化过程中起着重要作用。
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参考文献
1 Chen YP, et al. Self-regulation of mesangial cell proliferation by mesangial cell-derived IL-1 and PGE2. XI th International Congress of Nephrology, 1990:38A.
2 Shultz DJ, et al. The glomerular mesangium Role in initiation and progression of renal injure. Am J Kidney Dis 1991:17:8.
3 ramamoto T, et al. Quantitative and qualitative studies of antibody induced mesangial cell damage in the rat. Kidney Int 1987;32:514.
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4 李玉瑞。细胞外间质的生物化学及研究方法，北京：人民卫生出版社，1982：232。
5 Sambrook J, et al. Gel electrophoresis of DNA. Molecular Cloning I. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;6 3-6 34.
6 Chomczynski P, et al. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 1987;162:156.
7 Sterzel RB, et al. Mesangial cell hillocks:Nodular foci of exaggerated growth of cells and matrix in prolonged culture. Am J Pathol 1986;125:130.
, 百拇医药
8 Lovett DH, et al. Stimulation of rat mesangial cell prolifertion by macrophage interleukin 1. J Immunol 1983;131:2830.
9 赵志辉等，白细胞介素1在系膜IgA沉积中的作用。中华肾脏病杂志 1991；7：70。
10 Matsumoto K, et al. Glomerular cells and macrophages in the progress of experimental focal and segmental glomerulosclerosis. Am J Pathol 1989;134:933.
11 Border WA, et al. Suppression of experimental glomerulonephritis by antiserum against transforming growth factor betal. Nature 1990;346:371., 百拇医药