应用人甲状腺培养细胞检测甲状腺刺激抗体的临床意义
作者：刘超 张忠邦 蒋须勤 陈家伟覃又文 刘翠萍 张静馨
单位：210029南京医学院第一附属医院内分泌科(刘超、张忠邦、蒋须勤、陈家伟、覃又文、刘翠萍)，核医学科(张静馨)
关键词：
中华医学杂志930125 甲状腺刺激抗体(TSAb)在Graves甲亢(GD)发病机理中起重要作用。本文探讨正常人甲状腺细胞检测(TSAb)的最适条件及临床意义。
一、材料和方法
1.甲状腺细胞培养：手术切取甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织，经胰酶和胶原酶消化60～90分钟，沉淀物经反复吹打过滤后，以2000r/min离心10分钟，弃去上清液，用Eagle培养液((Sigma产品)调整细胞含量。于24孔培养板(Linbro产品)加入甲状腺细胞悬液350μl/孔。置CO2孵箱培养。
, 百拇医药
2.粗制IgG的提取：采用PEG(Sigma产品)粗提IgG的方法，提取物以改良Hank＇s液溶解备用[1]。
3.cAMP测定：细胞培养72小时后，移去培养液，分别加入不同浓度的TgG悬液300μl/孔，刺激0、2、4或6小时，收集上清液200μl，-20℃冻存待测cAMP。后者以竞争性蛋白结合法(北京原子能所药盒)测定。实验的批间批内变异系数分别为13.7%～19.1%和6.8%～12.4%。TSAb活性(%)=(被检血清Ig刺激cAMP值/对照血清IgG刺激cAMP均值)×100%。
4.检测对象：(1)GD未治组：21例(男7例，女14例)，年龄20～66岁。(2)GD复发组：17例(男5例，女12例)，年龄18～51岁。(3)GD缓解组：35例(男10例，女25例)，年龄26～59岁。(4)单纯性甲状腺肿(单甲肿)组：6例(男2例，女4例)，年龄17～48岁。(5)正常对照组：21名(男8名，女13名)，年龄19～49岁。
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5.统计学处理：数据以X±SX表示，F、Q和X2检验。
二、结果
1.细胞含量对cAMP生成的影响：在细胞含量为0.1×105、2×105和1×106/孔时，以TSAb阳性血清250μl/孔提取的IgG刺激4小时后，cAMP值分别为1.57、2.86、7.23和15.94pmol/孔，各组比较P均<0.01。350μl/孔血清提取的IgG刺激4小时，cAMP值分别为1.62、3.43、11.20和20.07pmol/孔，各组差异均有显著性。
2.刺激时间对cAMP生成的影响：以250μl或350μl/孔血清提取的IgG刺激2、4和6小时，每孔细胞(2×105)cAMP释放值分别为基础值(1.2pmol/孔)的2.5、7.2和10.3倍(250μl血清组)以及3.9、10.2和12.1倍(350μl血清组)；正常血清250μl刺激各时相cAMP释放值无明显差异。
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3.血清和量对cAMP生成的影响：用150、250和350μl血清提取的IgG刺激4小时，甲状腺细胞(2×105/孔)释放cAMP的量分别为2.26、7.23和11.20pmol/孔，均明显高于无血清对照组，与150μl血清组比较，250和350μl血清cAMP产值显著升高(P均
4.临床各组TSAb检测结果：根据上述实验确定的最佳条件(细胞含量2×105/孔、血清用量250μl/孔、刺激时间4小时)，检测TSAb的正常值为68.8～160.4%，凡大于160.4%的值为TSAb阳性，结果见附表。
附表 各组TSAb检测结果(
) 组别
例数
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TSAb
活性(%)
阳性例数
阳性率
GD未治组
21
672.1±52.9**
19
90.5**
GD复发组
17
658.8±64.7**
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14
82.4**
GD缓解组
35
179.4±18.3*
17
48.6*
单甲肿组
6
117.5±4.6
0
0
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对照组
21
114.6±5.0
0
0
** 与GD缓解组、单甲肿组和对照组比较P <0.01；* 与其他组比较P<0.05
三、讨论
本实验结果表明以细胞含量2×105/孔，血清用量250μ1/孔，刺激时间4小时较为合适，以此检测TSAb，其在GD未治组与复发组的阳性率高达90.5%和82.4%，而单甲肿组和对照组均阴性，具有较好的敏感性和特异性。
我们采用PEG粗提血清IgG的方法，大大简化了实验流程。使用改良Hank＇s液，使甲状腺细胞释放的aAMP80%进入上清液，这样只需直接测定培养液中的aAMP，省去了提取细胞内aAMP的复杂步骤，从而提高了检测的实用性[1]。
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未治组及复发组GD患者TSAb均有较高的活性及阳性率，与多数报道一致[1～3]，提示这种抗体与GD的发生与复发密切相关。本组中6例单甲肿者TSAb均阴性，说明TSAb对GD有很高的特异性。GD经治疗缓解后，TSAb活性与阳性率显著降低，支持抗甲状腺药物具有免疫调节作用的观点[4]。TSAb检测对明确GD的发病机理，协助甲亢诊断与鉴别诊断以及指导治疗等均有重要的临床意义。
注：本文为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Kasagi K,Konishi J,Arai K,et al,A Sensitive and practical assay for thyroid-stimulating antibodies using crude immunoglobulin fractions precipitated with polyethylene glyco,J Clin Endocrinol Metab,1986,62:855.
, http://www.100md.com
2 Kraiem Z,Glaser B,Yigla M,et al,Bioassay of thyroid-stimulating immunoglubulin in cryopreserved human thyroid cells;optimization and clinical evaluation,Clin Cnem,1988,34:244.
3 McKenzie JM,Zakarija M,Clinical review 3;the clinical use of thyrotropin erceptor antibody measurements,J Clin Endocrinol Metab,1989,69:1093.
4 刘 超，抗甲状腺药物的免疫调节作用，国外医学内分泌分册，1990，4：180。, 百拇医药
单位：210029南京医学院第一附属医院内分泌科(刘超、张忠邦、蒋须勤、陈家伟、覃又文、刘翠萍)，核医学科(张静馨)
关键词：
中华医学杂志930125 甲状腺刺激抗体(TSAb)在Graves甲亢(GD)发病机理中起重要作用。本文探讨正常人甲状腺细胞检测(TSAb)的最适条件及临床意义。
一、材料和方法
1.甲状腺细胞培养：手术切取甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织，经胰酶和胶原酶消化60～90分钟，沉淀物经反复吹打过滤后，以2000r/min离心10分钟，弃去上清液，用Eagle培养液((Sigma产品)调整细胞含量。于24孔培养板(Linbro产品)加入甲状腺细胞悬液350μl/孔。置CO2孵箱培养。
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2.粗制IgG的提取：采用PEG(Sigma产品)粗提IgG的方法，提取物以改良Hank＇s液溶解备用[1]。
3.cAMP测定：细胞培养72小时后，移去培养液，分别加入不同浓度的TgG悬液300μl/孔，刺激0、2、4或6小时，收集上清液200μl，-20℃冻存待测cAMP。后者以竞争性蛋白结合法(北京原子能所药盒)测定。实验的批间批内变异系数分别为13.7%～19.1%和6.8%～12.4%。TSAb活性(%)=(被检血清Ig刺激cAMP值/对照血清IgG刺激cAMP均值)×100%。
4.检测对象：(1)GD未治组：21例(男7例，女14例)，年龄20～66岁。(2)GD复发组：17例(男5例，女12例)，年龄18～51岁。(3)GD缓解组：35例(男10例，女25例)，年龄26～59岁。(4)单纯性甲状腺肿(单甲肿)组：6例(男2例，女4例)，年龄17～48岁。(5)正常对照组：21名(男8名，女13名)，年龄19～49岁。
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5.统计学处理：数据以X±SX表示，F、Q和X2检验。
二、结果
1.细胞含量对cAMP生成的影响：在细胞含量为0.1×105、2×105和1×106/孔时，以TSAb阳性血清250μl/孔提取的IgG刺激4小时后，cAMP值分别为1.57、2.86、7.23和15.94pmol/孔，各组比较P均<0.01。350μl/孔血清提取的IgG刺激4小时，cAMP值分别为1.62、3.43、11.20和20.07pmol/孔，各组差异均有显著性。
2.刺激时间对cAMP生成的影响：以250μl或350μl/孔血清提取的IgG刺激2、4和6小时，每孔细胞(2×105)cAMP释放值分别为基础值(1.2pmol/孔)的2.5、7.2和10.3倍(250μl血清组)以及3.9、10.2和12.1倍(350μl血清组)；正常血清250μl刺激各时相cAMP释放值无明显差异。
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3.血清和量对cAMP生成的影响：用150、250和350μl血清提取的IgG刺激4小时，甲状腺细胞(2×105/孔)释放cAMP的量分别为2.26、7.23和11.20pmol/孔，均明显高于无血清对照组，与150μl血清组比较，250和350μl血清cAMP产值显著升高(P均
4.临床各组TSAb检测结果：根据上述实验确定的最佳条件(细胞含量2×105/孔、血清用量250μl/孔、刺激时间4小时)，检测TSAb的正常值为68.8～160.4%，凡大于160.4%的值为TSAb阳性，结果见附表。
附表 各组TSAb检测结果(
) 组别例数
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TSAb
活性(%)
阳性例数
阳性率
GD未治组
21
672.1±52.9**
19
90.5**
GD复发组
17
658.8±64.7**
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14
82.4**
GD缓解组
35
179.4±18.3*
17
48.6*
单甲肿组
6
117.5±4.6
0
0
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对照组
21
114.6±5.0
0
0
** 与GD缓解组、单甲肿组和对照组比较P <0.01；* 与其他组比较P<0.05
三、讨论
本实验结果表明以细胞含量2×105/孔，血清用量250μ1/孔，刺激时间4小时较为合适，以此检测TSAb，其在GD未治组与复发组的阳性率高达90.5%和82.4%，而单甲肿组和对照组均阴性，具有较好的敏感性和特异性。
我们采用PEG粗提血清IgG的方法，大大简化了实验流程。使用改良Hank＇s液，使甲状腺细胞释放的aAMP80%进入上清液，这样只需直接测定培养液中的aAMP，省去了提取细胞内aAMP的复杂步骤，从而提高了检测的实用性[1]。
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未治组及复发组GD患者TSAb均有较高的活性及阳性率，与多数报道一致[1～3]，提示这种抗体与GD的发生与复发密切相关。本组中6例单甲肿者TSAb均阴性，说明TSAb对GD有很高的特异性。GD经治疗缓解后，TSAb活性与阳性率显著降低，支持抗甲状腺药物具有免疫调节作用的观点[4]。TSAb检测对明确GD的发病机理，协助甲亢诊断与鉴别诊断以及指导治疗等均有重要的临床意义。
注：本文为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Kasagi K,Konishi J,Arai K,et al,A Sensitive and practical assay for thyroid-stimulating antibodies using crude immunoglobulin fractions precipitated with polyethylene glyco,J Clin Endocrinol Metab,1986,62:855.
, http://www.100md.com
2 Kraiem Z,Glaser B,Yigla M,et al,Bioassay of thyroid-stimulating immunoglubulin in cryopreserved human thyroid cells;optimization and clinical evaluation,Clin Cnem,1988,34:244.
3 McKenzie JM,Zakarija M,Clinical review 3;the clinical use of thyrotropin erceptor antibody measurements,J Clin Endocrinol Metab,1989,69:1093.
4 刘 超，抗甲状腺药物的免疫调节作用，国外医学内分泌分册，1990，4：180。, 百拇医药