应用免疫学方法检测急性淋巴细胞白血病残留细胞的研究
作者：乐晓峰 杨天楹 陈 璋 汤美华 沈德诚 钱林生
单位：100034 北京医科大学血液病研究所(乐晓峰)；中国医学科学院血液学研究所(杨天楹、陈 障、汤美华、沈德诚、钱林生)
关键词：
中华医学杂志930121 微量残留白血病细胞(MRLC)的检测是急性白血病研究中的重要问题[1]。我们探索了以CD10为标志、应用双色免疫荧光技术(DCIF)和密度梯离心剂Percoll检测CD+10急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血中MRLC的条件，报告了10例患者的检测结果。
一、材料与方法
1.研究对象：(1)普通型ALL(C-ALL)10例，男7例，女3例，年龄4～48岁；(2)正常对照组14例，男8例，女6例，年龄20～40岁；(3)病例对照组3例，其中T细胞ALL(T-ALL)1例，急性髓性白血病(AML)2例，男2例，女1例，年龄20～29岁。
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2.Percoll富集白血病细胞试验：配制比重是1.075、1.070、1.065的Percoll不连续密度梯度柱，分离正常人(1例)格C-ALL(4例)患者外周血白层，取出各层单个核细胞(MNC)离心涂片、瑞色染色，镜检，以确定一个合适的富集白血病细胞比重，并观察这个比重下Percoll的富集的效果。
3.双色免疫荧光技术：Percoll分离得到的MNC经足量的正常兔血清封闭的30分钟(4℃)，每孔约1～5×105细胞，同时加入单抗HI98(CD15)、My4(CD14)、Leu3(cd4)及Ler2(CD8)，置4℃反应30分钟。用含0.1%NaN3的PBS洗两次后加异硫氰荧光素(FITC)标记的兔抗鼠免疫球蛋白，置4℃反应30分钟。同前法洗二次后加入过量的正常鼠血清(灭活补体)，置4℃反应30分钟。洗两次后加入藻红蛋白(PE)标记的J5单抗(CD10，购自美国Corlter公司，4℃反应30分钟。选两遍后加60%甘油的PBS点片镜检。先用荧光显微镜(Axioshop,OPTON)的15号滤板(激发波长546nm)观察红光(PE)，再换9号滤板(激发波长450～490nm)检查绿光(FITC)。每个标本分析1000个细胞，算出只有红光表达的CD+10细胞比例。
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二、结果
1.Percoll富集白血细胞的合适比重：白血病细胞(LC)在4个比重层均有分布，主要在1.070层，底层较少，正常人在1.060、1.065层未见白细胞，细胞集中在1.070、1.075及底层，1.075层有较多的单核细胞和核细胞。为尽可能去除外周血中成熟MNC和富集不成熟MNC，选择1.070为Percoll富集LC的合适比重。
2.Percoll富集白血病细胞的效果：不同ALL患者少量的LC与正常外周血混合后经比重为1.070(g/ml)的Percoll分离后的结果见附表。可见Percoll(1.070g/ml)可在外周血富集LC约9.9±5倍，优于Ficoll。
附表 外周血中少量白血病的富集 次数
分离前LC%(O)
Ficoll分离后LC%(F)
, 百拇医药
Percoll分离后LC%(P)
F/O
P/O
1
1.8
9.0
15.3
5.0
8.5
2
3.3
23.0
31.3
, 百拇医药
7.0
9.5
3
2.0
17.0
36.7
8.5
18.4
4
4.0
17.7
30.7
4.4
, 百拇医药
7.7
5
4.7
10.7
24.7
2.3
5.3
均数
3.2
15.5*
27.7*
5.4
9.9
, 百拇医药
* 两组比P <0.01
3.正常人和非CD+10ALL患者外周血中CD+10淋巴细胞“本底”：14例正常人外周血MNC中CD+10淋巴细胞比例是0.05%±0.03%，2例AML和1例T-ALL患者外周血中未见CD+10细胞。
4.双色免疫荧光技术的敏感度：选择1例确诊的C-ALL患者的LC与正常外周血MNC混合，配成一系列稀释度。发现在LC比正常MNC比例是10%～0.05%时，期望的和实际观察的CD+10细胞比例具有很好的相关性(R＝0.9997，n＝5)，显示DCIF检测CD+10细胞的敏感度是0.05%。因本组是Percoll预富集和DCIF联用，故总的检测水平是10-4。考虑到正常人外周血“本底”，只有当某一处于完全缓解期(CR)患者的外周血中CD+10细胞超过正常“本底”时才可认为是MRLC。
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5.10例C-ALL患者外周血MRLC的检测：本组有4例临床已判断CR的患者(例2～5)的外周血中检出大于0.08%的CD+10MRLC，其中例3在本法检出8%的MRLC后六周复发，三个月后死亡；4例临床未达CR的患者(例1，6～8)的外周血(形态学未发现幼稚细胞)中检出了与骨髓形态学检查相符合的CD+10MRLC(2～21%)；2例(例9，10)长期CR的儿童患者的外周血中未检出CD+10MRLC，与临床情况安全相符。
三、讨论
van Dongen和Ryan等[1，2]均报道正常外周血MNC中CD+10细胞很少，且表面表达CD10的强度弱，面CD+10ALL(包括C-ALL，前B-ALL及部分B-ALL)外周血LC多数是CD+10，且抗原密度大，即使在微量存在时也易被发现，因此根据外周血CD+10细胞比例可监测CR期CD+10ALL患者以下的MRLC。本组中采用DCIF，以髓系单抗标记样品单核细胞和核细胞以除外非特异性荧光吸附和弱CD10表达的中性核细胞干挠，以T细胞单抗体标记样品中T细胞在荧光显微镜下易发现CD+10细胞，从而显著提高了检测水平。本法在MRLC的临床和实验研究中有应用价值。
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注：本工作完成在中国医学科学院血液研究所
参考文献
1 van Dongen JJM,Hooijkaas H,Adriaansen HJ,et al.Detection of minimal residual acutelymphoblastic leukemia by immunological markers analysis;possbilities and limitations,in;Hagenbeek A,Lowenberg B,eds,Minimal Residual Disease in Acute Leudemia 1986,113-133.
2 Ryan DH,van Dongen JJM,Detection of residual disease in acute leukemia using immunological markers,in: Bennett JM,Foon kA,eds Immunological Approaches to the classification and management of lymphomas and leukemias.Kluwer Academic Publishers,1988,173-207.
(收稿：1992-02-29 修回：1992-08-20), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学血液病研究所(乐晓峰)；中国医学科学院血液学研究所(杨天楹、陈 障、汤美华、沈德诚、钱林生)
关键词：
中华医学杂志930121 微量残留白血病细胞(MRLC)的检测是急性白血病研究中的重要问题[1]。我们探索了以CD10为标志、应用双色免疫荧光技术(DCIF)和密度梯离心剂Percoll检测CD+10急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血中MRLC的条件，报告了10例患者的检测结果。
一、材料与方法
1.研究对象：(1)普通型ALL(C-ALL)10例，男7例，女3例，年龄4～48岁；(2)正常对照组14例，男8例，女6例，年龄20～40岁；(3)病例对照组3例，其中T细胞ALL(T-ALL)1例，急性髓性白血病(AML)2例，男2例，女1例，年龄20～29岁。
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2.Percoll富集白血病细胞试验：配制比重是1.075、1.070、1.065的Percoll不连续密度梯度柱，分离正常人(1例)格C-ALL(4例)患者外周血白层，取出各层单个核细胞(MNC)离心涂片、瑞色染色，镜检，以确定一个合适的富集白血病细胞比重，并观察这个比重下Percoll的富集的效果。
3.双色免疫荧光技术：Percoll分离得到的MNC经足量的正常兔血清封闭的30分钟(4℃)，每孔约1～5×105细胞，同时加入单抗HI98(CD15)、My4(CD14)、Leu3(cd4)及Ler2(CD8)，置4℃反应30分钟。用含0.1%NaN3的PBS洗两次后加异硫氰荧光素(FITC)标记的兔抗鼠免疫球蛋白，置4℃反应30分钟。同前法洗二次后加入过量的正常鼠血清(灭活补体)，置4℃反应30分钟。洗两次后加入藻红蛋白(PE)标记的J5单抗(CD10，购自美国Corlter公司，4℃反应30分钟。选两遍后加60%甘油的PBS点片镜检。先用荧光显微镜(Axioshop,OPTON)的15号滤板(激发波长546nm)观察红光(PE)，再换9号滤板(激发波长450～490nm)检查绿光(FITC)。每个标本分析1000个细胞，算出只有红光表达的CD+10细胞比例。
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二、结果
1.Percoll富集白血细胞的合适比重：白血病细胞(LC)在4个比重层均有分布，主要在1.070层，底层较少，正常人在1.060、1.065层未见白细胞，细胞集中在1.070、1.075及底层，1.075层有较多的单核细胞和核细胞。为尽可能去除外周血中成熟MNC和富集不成熟MNC，选择1.070为Percoll富集LC的合适比重。
2.Percoll富集白血病细胞的效果：不同ALL患者少量的LC与正常外周血混合后经比重为1.070(g/ml)的Percoll分离后的结果见附表。可见Percoll(1.070g/ml)可在外周血富集LC约9.9±5倍，优于Ficoll。
附表 外周血中少量白血病的富集 次数
分离前LC%(O)
Ficoll分离后LC%(F)
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Percoll分离后LC%(P)
F/O
P/O
1
1.8
9.0
15.3
5.0
8.5
2
3.3
23.0
31.3
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7.0
9.5
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2.0
17.0
36.7
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18.4
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4.0
17.7
30.7
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7.7
5
4.7
10.7
24.7
2.3
5.3
均数
3.2
15.5*
27.7*
5.4
9.9
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* 两组比P <0.01
3.正常人和非CD+10ALL患者外周血中CD+10淋巴细胞“本底”：14例正常人外周血MNC中CD+10淋巴细胞比例是0.05%±0.03%，2例AML和1例T-ALL患者外周血中未见CD+10细胞。
4.双色免疫荧光技术的敏感度：选择1例确诊的C-ALL患者的LC与正常外周血MNC混合，配成一系列稀释度。发现在LC比正常MNC比例是10%～0.05%时，期望的和实际观察的CD+10细胞比例具有很好的相关性(R＝0.9997，n＝5)，显示DCIF检测CD+10细胞的敏感度是0.05%。因本组是Percoll预富集和DCIF联用，故总的检测水平是10-4。考虑到正常人外周血“本底”，只有当某一处于完全缓解期(CR)患者的外周血中CD+10细胞超过正常“本底”时才可认为是MRLC。
, http://www.100md.com
5.10例C-ALL患者外周血MRLC的检测：本组有4例临床已判断CR的患者(例2～5)的外周血中检出大于0.08%的CD+10MRLC，其中例3在本法检出8%的MRLC后六周复发，三个月后死亡；4例临床未达CR的患者(例1，6～8)的外周血(形态学未发现幼稚细胞)中检出了与骨髓形态学检查相符合的CD+10MRLC(2～21%)；2例(例9，10)长期CR的儿童患者的外周血中未检出CD+10MRLC，与临床情况安全相符。
三、讨论
van Dongen和Ryan等[1，2]均报道正常外周血MNC中CD+10细胞很少，且表面表达CD10的强度弱，面CD+10ALL(包括C-ALL，前B-ALL及部分B-ALL)外周血LC多数是CD+10，且抗原密度大，即使在微量存在时也易被发现，因此根据外周血CD+10细胞比例可监测CR期CD+10ALL患者以下的MRLC。本组中采用DCIF，以髓系单抗标记样品单核细胞和核细胞以除外非特异性荧光吸附和弱CD10表达的中性核细胞干挠，以T细胞单抗体标记样品中T细胞在荧光显微镜下易发现CD+10细胞，从而显著提高了检测水平。本法在MRLC的临床和实验研究中有应用价值。
, 百拇医药
注：本工作完成在中国医学科学院血液研究所
参考文献
1 van Dongen JJM,Hooijkaas H,Adriaansen HJ,et al.Detection of minimal residual acutelymphoblastic leukemia by immunological markers analysis;possbilities and limitations,in;Hagenbeek A,Lowenberg B,eds,Minimal Residual Disease in Acute Leudemia 1986,113-133.
2 Ryan DH,van Dongen JJM,Detection of residual disease in acute leukemia using immunological markers,in: Bennett JM,Foon kA,eds Immunological Approaches to the classification and management of lymphomas and leukemias.Kluwer Academic Publishers,1988,173-207.
(收稿：1992-02-29 修回：1992-08-20), http://www.100md.com