正常人腰间盘纤维软骨胶原含量测定
作者：朱庆三 杨有庚 许则民 姜鸿志 周秋丽 常淑芳 白秀起 候立忠
单位：130021长春白求恩医科大学第三临床医学院骨科(朱庆三、杨有庚、许则民、姜鸿志)，地方病研究所生化室(周秋丽、常淑芳、白秀起、侯立忠)
关键词：
中华医学杂志930118 测定了59例急死健康中国人腰间盘纤维软骨胶原含量，意义在于确立了健康中国人腰间血纤维软骨胶原含量的正常值范围，为探讨脊椎疾患进软骨的变化奠定了基础，提供了正常对照参数；比较了不同部位腰间盘纤维软骨胶原含量的差异，并从生物力学、生化构成等方面进一步探讨了引起差异的原因。
一、材料与方法
1.材料：健康男性中国人，18～54岁，30岁以下者占90%，头部外伤急死后4～6小时取材，样本取下后即刻用生理盐水冲去血迹，切去间盘两侧透明软骨板，纤维软骨胶原含量的正常值范围，为探讨脊椎疾患时软骨的变化奠定了基础，提供了正常对照参数；比较了不同部位腰间盘纤维软骨胶原含量的差异，并从生物力学、生化构成等方面进一步探讨了引起差异的原因。
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一、材料与方法
1.材料：健康男性中国人，18～54岁，30岁以下者占90%，头部外伤急死后4～6小时取材，样本取下后即刻用生理盐水冲去血迹，切去间盘两侧透明软骨板，纤维软骨置淮氮中保存至应用，共59例样本，L3～430例，L4～529例。
2.方法：(1)软骨脱脂：将软骨片切成薄片，置20ml试管中，加丙酮两交各6小时弃去，最后乙醚脱脂1次，放置过夜。将已脱脂的软骨剪碎成细小碎块，置于50℃恒温箱中干燥4小时。(2)提取胶原：干燥后，每份样品称取50mg，置10ml带盖试管中，加入0.3mol/L三氯醋酸(TCA)溶液3ml，置90℃恒温箱内3小时，冷却后离心(3500r/min)5分钟，上清液置20ml洁净试管中；沉淀中再加入0.3mol/L TCA 2ml，依上法提取1次，合并上清于前一提取液中。将盛有提取液的试管置烘笨中120℃蒸干。(3)待测样品制备：蒸干后的试管中加入60mol/LHCl溶液2ml，溶解全部剩余物后，移入5ml洁净安瓶中，封口，120℃水解10小时。取水解液20μl，加蒸馏水6000μl。振荡后配成待测样本。(4)羟脯氨酸(HPR)测定：取待测样品1ml，加入0.05mol/L GuSO4及10%NaOH溶液各0.50ml，再加入6%H2O2溶液0.50ml，置30℃水浴10分钟。放置期间振荡3次。加入无水乙醇0.50ml，再放置20分钟，其间振荡3次；加入6mol/LHCl 1ml，再加5%对二甲氨基苯甲醛ml摇匀，于60℃水浴15分钟，自然冷却后，测540mn的吸光值。(5)标准液配制：取2mg标准HPR，深于50ml容量瓶中，配成储备液。实验时，按0、2、4、6、8……16μg/ml稀释成不同浓度，与待测样品同步测定吸光值。(7)计算HPR浓度及胶原含量：样品HPR浓度＝标准HPR浓度×所测样品OD值/标准HPR此浓度OD值；样品中胶原百分含量＝样品HPR浓度/组织量×7.46×100[1]。
, 百拇医药
二、结果与讨论
有关软骨胶原含量的研究始于50年代，由于健康人软骨取材方面的限制，国内外一直没有大样本正常人软骨胶原含量的报告。故在疾病研究中缺乏正常对照。本实验共测定健康中国人腰间盘纤维软骨59例，取材于临床上疾病好发的L4～5及L3～4间盘，标本鹇，年龄集中，18～30岁占90%。全部数据经统计学处理认为达到可以作为正常值应用的例数。故得出腰间盘纤维软骨胶原含量正常值范围内450.7～544.6mg/g。本实验比较了L3～4及L4～5间盘纤维软骨的胶原含量，发现L4～5间盘胶原含量明显高于L3～4间盘，差异有显著意义(见附表)。
附表 不同部位腰间盘纤维软骨胶原含量比较 腰间盘部位
例数
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胶原含量(
，mg/g)
(1)L3～4
30
489±23*
(2)L4～5
29
507±22
总计
59
498±24
注：(1)与(2)相比较，* P<0.01
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腰间盘中含有Ⅰ型和Ⅱ型两种类型胶原，不同环层两种胶原含量各异[2]；且两种类型胶原功能也不同。Ⅰ型提供纤维环的张力尤如肌腱，Ⅱ型承受压力强度。从生物力学角度分析，人站立时，下位间盘承受的压力大于上位间盘。有人计算，体重70kg的人站立时，腰间盘的负荷为70kg，是被测部位以上体重的2倍。此负荷中，纤维环起主要承受压力应力作用，且应力的一部分转换成张力吸收之[3]。同时L4～5间盘的活动范围在腰段脊柱中最大，故其承受的各方向活动时的张力也大，我们认为这是L4～5间盘纤维软骨胶原含量高于L3～4的一个重要因素(附表。
Adams和David报告，腰间盘外层的胶原含量高于内层，下位间盘胶原含量高于上位间盘，但不清楚这是否与年龄相关，或是一个解剖学特性[4]。本组将59例分为20岁以上(44例)及20岁以下(15例)两组进行比较，发现两组胶原含量差异无显著意认(P>0.05)。Mc Devitt测定了胚胎时期、出生后10周、25周、3岁及5岁龄猪关节软骨的胶原含量，分别为19.6%、38.2%、49.0%、52.7%和54.6%，规律比较明显。而Anderson等报行10～50岁人关节软骨胶原含量随年龄增长稍增加，60岁以后逐渐降低，但变化缓慢。由此可见，哺乳动物软骨从胚胎时期至成年以前处于生长代谢、逐渐趋于成熟的最活跃阶段，随年龄增长胶原含量增多；从成年到发生退变(Degeneration)以前处于相对稳定时期，胶原含量无明显变化；老年阶段，由于骨、软骨退变，胶原含量轻度降低。胶原含量的减少与结构的变化，构成了骨、软骨退变的基础。
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参考文献
1 Meuman RE,Logan MA.The determination of collagen and in tissue.J Biol Chem,1950,186:849
2 李书忠，胡有谷，陈培勋，椎间盘胶原分布的研究，中华骨科杂南，1992；12：213。
3 胡有谷，主编，腰椎间盘突出症，北京：人民卫生出版社，1985：77。
4 Adams P,Muir H.Quantitative change with age of proteoglycans of human Lumbar discs.Ann Rheum Dis,1976,35:289.
(收稿：1992-04-23 修回：1992-08-14), http://www.100md.com
单位：130021长春白求恩医科大学第三临床医学院骨科(朱庆三、杨有庚、许则民、姜鸿志)，地方病研究所生化室(周秋丽、常淑芳、白秀起、侯立忠)
关键词：
中华医学杂志930118 测定了59例急死健康中国人腰间盘纤维软骨胶原含量，意义在于确立了健康中国人腰间血纤维软骨胶原含量的正常值范围，为探讨脊椎疾患进软骨的变化奠定了基础，提供了正常对照参数；比较了不同部位腰间盘纤维软骨胶原含量的差异，并从生物力学、生化构成等方面进一步探讨了引起差异的原因。
一、材料与方法
1.材料：健康男性中国人，18～54岁，30岁以下者占90%，头部外伤急死后4～6小时取材，样本取下后即刻用生理盐水冲去血迹，切去间盘两侧透明软骨板，纤维软骨胶原含量的正常值范围，为探讨脊椎疾患时软骨的变化奠定了基础，提供了正常对照参数；比较了不同部位腰间盘纤维软骨胶原含量的差异，并从生物力学、生化构成等方面进一步探讨了引起差异的原因。
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一、材料与方法
1.材料：健康男性中国人，18～54岁，30岁以下者占90%，头部外伤急死后4～6小时取材，样本取下后即刻用生理盐水冲去血迹，切去间盘两侧透明软骨板，纤维软骨置淮氮中保存至应用，共59例样本，L3～430例，L4～529例。
2.方法：(1)软骨脱脂：将软骨片切成薄片，置20ml试管中，加丙酮两交各6小时弃去，最后乙醚脱脂1次，放置过夜。将已脱脂的软骨剪碎成细小碎块，置于50℃恒温箱中干燥4小时。(2)提取胶原：干燥后，每份样品称取50mg，置10ml带盖试管中，加入0.3mol/L三氯醋酸(TCA)溶液3ml，置90℃恒温箱内3小时，冷却后离心(3500r/min)5分钟，上清液置20ml洁净试管中；沉淀中再加入0.3mol/L TCA 2ml，依上法提取1次，合并上清于前一提取液中。将盛有提取液的试管置烘笨中120℃蒸干。(3)待测样品制备：蒸干后的试管中加入60mol/LHCl溶液2ml，溶解全部剩余物后，移入5ml洁净安瓶中，封口，120℃水解10小时。取水解液20μl，加蒸馏水6000μl。振荡后配成待测样本。(4)羟脯氨酸(HPR)测定：取待测样品1ml，加入0.05mol/L GuSO4及10%NaOH溶液各0.50ml，再加入6%H2O2溶液0.50ml，置30℃水浴10分钟。放置期间振荡3次。加入无水乙醇0.50ml，再放置20分钟，其间振荡3次；加入6mol/LHCl 1ml，再加5%对二甲氨基苯甲醛ml摇匀，于60℃水浴15分钟，自然冷却后，测540mn的吸光值。(5)标准液配制：取2mg标准HPR，深于50ml容量瓶中，配成储备液。实验时，按0、2、4、6、8……16μg/ml稀释成不同浓度，与待测样品同步测定吸光值。(7)计算HPR浓度及胶原含量：样品HPR浓度＝标准HPR浓度×所测样品OD值/标准HPR此浓度OD值；样品中胶原百分含量＝样品HPR浓度/组织量×7.46×100[1]。
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二、结果与讨论
有关软骨胶原含量的研究始于50年代，由于健康人软骨取材方面的限制，国内外一直没有大样本正常人软骨胶原含量的报告。故在疾病研究中缺乏正常对照。本实验共测定健康中国人腰间盘纤维软骨59例，取材于临床上疾病好发的L4～5及L3～4间盘，标本鹇，年龄集中，18～30岁占90%。全部数据经统计学处理认为达到可以作为正常值应用的例数。故得出腰间盘纤维软骨胶原含量正常值范围内450.7～544.6mg/g。本实验比较了L3～4及L4～5间盘纤维软骨的胶原含量，发现L4～5间盘胶原含量明显高于L3～4间盘，差异有显著意义(见附表)。
附表 不同部位腰间盘纤维软骨胶原含量比较 腰间盘部位
例数
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胶原含量(
，mg/g)(1)L3～4
30
489±23*
(2)L4～5
29
507±22
总计
59
498±24
注：(1)与(2)相比较，* P<0.01
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腰间盘中含有Ⅰ型和Ⅱ型两种类型胶原，不同环层两种胶原含量各异[2]；且两种类型胶原功能也不同。Ⅰ型提供纤维环的张力尤如肌腱，Ⅱ型承受压力强度。从生物力学角度分析，人站立时，下位间盘承受的压力大于上位间盘。有人计算，体重70kg的人站立时，腰间盘的负荷为70kg，是被测部位以上体重的2倍。此负荷中，纤维环起主要承受压力应力作用，且应力的一部分转换成张力吸收之[3]。同时L4～5间盘的活动范围在腰段脊柱中最大，故其承受的各方向活动时的张力也大，我们认为这是L4～5间盘纤维软骨胶原含量高于L3～4的一个重要因素(附表。
Adams和David报告，腰间盘外层的胶原含量高于内层，下位间盘胶原含量高于上位间盘，但不清楚这是否与年龄相关，或是一个解剖学特性[4]。本组将59例分为20岁以上(44例)及20岁以下(15例)两组进行比较，发现两组胶原含量差异无显著意认(P>0.05)。Mc Devitt测定了胚胎时期、出生后10周、25周、3岁及5岁龄猪关节软骨的胶原含量，分别为19.6%、38.2%、49.0%、52.7%和54.6%，规律比较明显。而Anderson等报行10～50岁人关节软骨胶原含量随年龄增长稍增加，60岁以后逐渐降低，但变化缓慢。由此可见，哺乳动物软骨从胚胎时期至成年以前处于生长代谢、逐渐趋于成熟的最活跃阶段，随年龄增长胶原含量增多；从成年到发生退变(Degeneration)以前处于相对稳定时期，胶原含量无明显变化；老年阶段，由于骨、软骨退变，胶原含量轻度降低。胶原含量的减少与结构的变化，构成了骨、软骨退变的基础。
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参考文献
1 Meuman RE,Logan MA.The determination of collagen and in tissue.J Biol Chem,1950,186:849
2 李书忠，胡有谷，陈培勋，椎间盘胶原分布的研究，中华骨科杂南，1992；12：213。
3 胡有谷，主编，腰椎间盘突出症，北京：人民卫生出版社，1985：77。
4 Adams P,Muir H.Quantitative change with age of proteoglycans of human Lumbar discs.Ann Rheum Dis,1976,35:289.
(收稿：1992-04-23 修回：1992-08-14), http://www.100md.com