人工合成丁型肝炎病毒抗原多肽片段的特性与临床应用
作者：郑红 李奇芬 林晓红 崔恒苒 吴纯清 崔大敷 丁明权 黄维德
单位：630038重庆市，第三军医大学西南医院传染科(郑红，李奇芬，吴纯清，丁明权)；中国科学院上海生物化学研究所(林晓红，崔恒苒，崔大敷，黄维德)
关键词：肽片段；肝炎病毒，丁型；抗原，丁型肝炎
中华医学杂志930506 摘要 用自行选择、设计并合成的天然丁型肝炎抗原(HDAg)上部分片段的27肽，建立检测丁型肝炎病毒抗体(抗HD)的酶联免疫测定法(ELISA)。实验表明，该多肽抗原：(1)具有天然HDAg上相应片段的抗原活性，能与天然HDAg竞争血清抗HD；(2)专一性强，与正常人血清、正常小鼠血清及单纯甲型、乙型、丙型肝炎抗体阳性血清无交叉免疫反应；(3)与36份曾经Abbott药盒检测抗HD的冻存血清对照比较检测，该ELISA法与Abbott药盒的结果符合率为97.2%。作者检测了1990～1992年部分献血员及各类肝病及HBV感染者血清抗HD，结果为：献血员1/300例(0.33%)抗HD阳性(其丙氨酸氨基转移酶增高2倍以上)；甲型肝炎62例，非乙型肝炎58例，抗HD均阴性；各型乙型肝炎病毒(HBV)感染者859例，抗HD阳性100例(11.64%)。其中无症状携带者13/410例阳性(3.17%)，急性黄疸性肝炎7/63例阳性(10.29%)，慢性迁延性肝炎1/9例阳性(11.11%)，慢性活动性肝炎22/121例阳性(18.18%)，重症肝炎15/75例阳性(20.00%)，肝炎肝硬化23/78例阳性(29.49%)，乙型肝炎病毒感染标志(HVBM)阳性原发性肝细胞癌19/98例阳性(19.39%)。
, http://www.100md.com
随着高科技的迅速发展，合成多肽已得到广泛应用。我们根据国外已发表的有关HDV核苷酸序列以及由此分布状况，自行选择、设计并合成了含天然HDAg上部分片段的27肽，并建立了检测抗HD的ELISA法；研究本肽段的生物学特性，检测了本地区各类人员血清中抗HD。现将结果报告如下。
材料和方法
一、人工合成HDAg27肽
我们参照有关文献自行选择设计，在中国科学院上海生物化学研究所Applied Biosystem 439A多肽合成仪上合成。
二、HDV合成肽抗原ELISA法的建立
纯肽(纯度为75%)包被聚乙烯微孔塑料板(浙江玉环县芦浦塑料化学器械厂生产)50μl/125ng*孔，4℃过夜，洗涤，0.5%明胶PBS封底，加待检原倍血标本50μl/孔，37℃反应1小时，洗涤，加羊抗人IgG-HRP 50μl/孔，37℃反应1小时，洗涤，加邻苯二胺(OPD)底物显色5～～10分钟，用2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪上492nm波长测吸光度值。
, 百拇医药
三、阻断实验
以已知HDAg阳性血清加入等量待检血清中，用ELISA法观察HDAg对血标本的抗HD的阻断状况。
四、专一性实验
取正常人血清(103份)，单纯甲型、乙型、丙型肝炎抗体阳性血清及正常小鼠血清各3份，以ELISA法观察本多肽抗原的专一性。
五、对照实验
取曾经Abbott药盒检测抗HD的冻存5～8年血标本36份，以本多肽抗原建立的ELISA法检测抗HD，比较两者的结果。
六、人工合成HDAg 27肽测抗HD结果的判断
参照Abbott试剂盒计算临界值(cutoff值)＝0.4×阴性对照吸光度增值+0.6×阳性对照吸光度均值。大于或等于cutoff值判为阳性结果；阳性对照与阴性对照吸光度值之差大于或等于0.4判为当次实验结果有效。
, 百拇医药
七、临床检测对象
1990～1992年本院献身员300名；同期HBV表面抗原(HBsAg)阳性无症状携带者410例(本市中心血站献血员筛选HBsAg阳性者183例，本院门诊及住院非肝炎HVBM阳性者227例)；甲型肝炎(HBVM阴性抗HAVIgM阳性)62例；非乙型肝炎(HBVM和抗HAVIgM均阴性)58例；HBVM阳性各类肝病患者(1990年10月～1992年6月住院患者)449例，其中，急性肝炎(AH)68例，慢性迁延型肝炎)CPH)9例，慢性活动型肝炎(CAH)121例，重型肝炎(SH)75例包括急性、亚急性及慢性重型肝炎)，肝炎肝硬化(LC)78例，HBVM阳性原发性肝细胞癌(PHC)98例。诊断标准按1990年上海全国病毒肝炎会议修定的方案。LC及PHC患者血标本主要由本院消化内科和矸胆外科提供。
结 果
一、天然HDAg对HDV合成肽抗原检测抗HD的阻断(表1)
, 百拇医药
表1 天然HDAg对HDV合成肽抗原检测抗HD的阻断 标本编号
合成肽抗原检测血清抗HD结果
血标本(1:2稀释)
血标本+HDAg阳性血清(1:1)
1
0.55
0.125
2
0.71
0.09
3
0.35
, 百拇医药
0.14
4
0.37
0.09
5
0.46
0.10
6
0.65
0.10
7
0.37
0.14
, 百拇医药
8
0.15
0.11
9
0.13
0.13
阳性对照
0.63/0.43
阴性对照
0.08/0.06
由表1可见，当被检抗HD阳性血清中加入HDAg阳性血清后，其吸光度值由阳性范围降至阴性范围；而抗HD阴性标本的吸光度值基本不变。
, 百拇医药 二、HDV多肽抗原的专一性(表2)
由表2可见，HDV合成肽抗原与正常人血清、正常小鼠血清以及单纯甲型、乙型、丙型肝炎患者血清交叉免疫反应。
表2 HDV合成肽抗原检测抗HD的免疫反应 组别
检测例数
抗HAVIgM阳性例数
抗HBcIgM阳性例数
抗HC阳性例数
抗HD阳性例数
正常人群
103
0
, 百拇医药
0
0
0
单纯甲肝
3
3
0
0
0
单纯乙肝
3
0
3
0
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0
单纯丙肝
3
0
0
3
0
丁型肝炎
3
0
3
2△
3
正常小鼠
, 百拇医药
3*
-
-
-
0
*酶标抗体为羊抗鼠IgG-HRP △为丙型，丁型肝炎混合感染
三、与Abbott试剂盒检测抗HD结果比较
原Abbott药盒检出的11份抗HD阳性冻存多年的血标本，采用本多肽抗原ELISA法检测，抗HD仍为阳性；24份抗HD阴性标本检测结果也是阴性，两种试剂检出结果相符35/36份，符合率为97.2%。
四、各类人员抗HD检测结果(表3)
, 百拇医药
由表3可见，献血员中仅1例抗HD阳性。该例同份血清经检测ALT较正常值升高2倍以上，揭示为现症患者；单纯甲型肝炎和非乙型肝炎均未检出抗HD阳性者。在449例各类HBVM阳性肝病患者中，抗HD阳性87例(19.4%)；410例无症状HBsAg携带者中抗HD阳性有13例(3.2%)。
表3 合成肽HDAg ELISA法检测各类人员血清抗HD结果 组别
检测例数
阳性例数
阳性率(%)
献血员
300
1
0.3
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甲型肝炎
62
0
0
非乙型肝炎
58
0
0
HBV感染者
859
100
11.6
ASC
, 百拇医药 410
13
3.2
AH
68
7
10.3
CPH
9
1
11.1
CAH
121
22
, 百拇医药
18.2
SH
75
15
20.0
LC
78
23
29.5
PHC
98
19
19.4
, 百拇医药 合 计
1279
101
7.9
讨 论
1986年以来，国际上先后发表了五个不同地区来源的HDV核苷酸部分和全序列，以及根据HDAg阅读框架上核苷酸序列推算的氨基酸序列〔1～4〕，为研究HDAg抗原特性提供了可参考的分子生物学依据。与此同时，Bergmann等〔5〕，Lin等〔6〕及Wang等〔7〕等学者又分析研究了HDAg抗原性的分布状态，发现HDAg的抗原性沿其氨基酸序列全长分布，但其中某些部位的抗原性较为明显，为我们设计、选择合成HDAg片段提供了重要依据。
人工合成多肽抗原的制备、应用始于七十年代、是与基因工程技术同时发展起来的分子生物学技术之一。其优点在于，人工合成肽片段的大小可人为控制，可分割研究分析蛋白质的不同的区域的生物学活性，且简便、安全。由于HDV本身固有的特点，较难获得稳定性好、纯度高的天然HDAg。实验证实，我们选择的HDAg片段能识别天然抗HD，可与天然HDAg竞争抗HD，具有天然HDAg上相应片段的抗原活性；其专一性强，与正常人血清，正常小鼠血清和单纯甲型、乙型、丙型肝炎患者血清都不发生交叉免疫反应；经与Abbott试剂检测过的36份冻存血清抗HD结果比较，多肽抗原ELISA法检测抗HD结果与之符合率为97.2%；HDV多肽抗原还具有纯度高、稳定性好，易于获得，使用简便、安全等优点。
, 百拇医药
采用本HDV多肽抗原包被聚乙烯微孔板，建立ELISA法，检测1279例各类人员中的抗HD，进一步证实重庆地区各类HBV感染者中，有相当数量患者合并感染了HDV，总检出率为11.64%。尤其是在各慢性HBV感染的肝病患者及重症患者中所占比例较高，提示HDV对HBV感染者慢性化及重症化的形成可能有关，影响HBV感染者的预后。本实验结果与我们已往采用其它试剂检测HBV感染者血清抗HD的结果基本一致。
HDV合成肽抗原的获得和应用，可部分替代天然HDV抗原，为HDAg生物学活性的深入研究，HDV感染的流行病学研究和丁型肝炎发病机理的研究提供了又一个条件。
承重庆中心血站检验科，本院血库、免疫室、消化内科及肝胆外科提供病历及血标本，特表谢意。
参考文献
1 Makino S,Chang MF,Shien ChK,et,al.Molecular cloning and sequence of a human HDV RNA.Nature,1987,329:343
, 百拇医药
2 Chao YCh,Chang MF,Gust I,et al.Sequence conservation and divergence of HDV RNA.Virol,1990,178:384.
3 Chao YCh,Lee Chm,Tang HSh,et al.Molecular choning and Characterization of an isolate of HDV from Taiwan.Hepatol.1991,13:345.
4 Imazeki F,Omata M,Ohto M.Heterogenity and evolution rates of delta virus RNA.J Virol,1990,64:5594.
5 Bergmann KF,Cote PT,Moriarty A,Et al.Antigenic structure and humoral immune response.J Immunol,1989,143:3714.
, http://www.100md.com
6 Lin JH,Chang MF,Baker SC,et al.Characterization of HDAg:Specific Binding to HDV RNA J Virol,1990,64:4051.
7 Wang JG,Jansen RW,Brown EA,et al. Immunoginic domains of HDV antigen:Peptido Mapping of epitopes recognized by human and wooduchuck antiboties.J Virol,1990,64:1108.
(收稿：1992-09-23 修回：1993-01-13), 百拇医药
单位：630038重庆市，第三军医大学西南医院传染科(郑红，李奇芬，吴纯清，丁明权)；中国科学院上海生物化学研究所(林晓红，崔恒苒，崔大敷，黄维德)
关键词：肽片段；肝炎病毒，丁型；抗原，丁型肝炎
中华医学杂志930506 摘要 用自行选择、设计并合成的天然丁型肝炎抗原(HDAg)上部分片段的27肽，建立检测丁型肝炎病毒抗体(抗HD)的酶联免疫测定法(ELISA)。实验表明，该多肽抗原：(1)具有天然HDAg上相应片段的抗原活性，能与天然HDAg竞争血清抗HD；(2)专一性强，与正常人血清、正常小鼠血清及单纯甲型、乙型、丙型肝炎抗体阳性血清无交叉免疫反应；(3)与36份曾经Abbott药盒检测抗HD的冻存血清对照比较检测，该ELISA法与Abbott药盒的结果符合率为97.2%。作者检测了1990～1992年部分献血员及各类肝病及HBV感染者血清抗HD，结果为：献血员1/300例(0.33%)抗HD阳性(其丙氨酸氨基转移酶增高2倍以上)；甲型肝炎62例，非乙型肝炎58例，抗HD均阴性；各型乙型肝炎病毒(HBV)感染者859例，抗HD阳性100例(11.64%)。其中无症状携带者13/410例阳性(3.17%)，急性黄疸性肝炎7/63例阳性(10.29%)，慢性迁延性肝炎1/9例阳性(11.11%)，慢性活动性肝炎22/121例阳性(18.18%)，重症肝炎15/75例阳性(20.00%)，肝炎肝硬化23/78例阳性(29.49%)，乙型肝炎病毒感染标志(HVBM)阳性原发性肝细胞癌19/98例阳性(19.39%)。
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随着高科技的迅速发展，合成多肽已得到广泛应用。我们根据国外已发表的有关HDV核苷酸序列以及由此分布状况，自行选择、设计并合成了含天然HDAg上部分片段的27肽，并建立了检测抗HD的ELISA法；研究本肽段的生物学特性，检测了本地区各类人员血清中抗HD。现将结果报告如下。
材料和方法
一、人工合成HDAg27肽
我们参照有关文献自行选择设计，在中国科学院上海生物化学研究所Applied Biosystem 439A多肽合成仪上合成。
二、HDV合成肽抗原ELISA法的建立
纯肽(纯度为75%)包被聚乙烯微孔塑料板(浙江玉环县芦浦塑料化学器械厂生产)50μl/125ng*孔，4℃过夜，洗涤，0.5%明胶PBS封底，加待检原倍血标本50μl/孔，37℃反应1小时，洗涤，加羊抗人IgG-HRP 50μl/孔，37℃反应1小时，洗涤，加邻苯二胺(OPD)底物显色5～～10分钟，用2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪上492nm波长测吸光度值。
, 百拇医药
三、阻断实验
以已知HDAg阳性血清加入等量待检血清中，用ELISA法观察HDAg对血标本的抗HD的阻断状况。
四、专一性实验
取正常人血清(103份)，单纯甲型、乙型、丙型肝炎抗体阳性血清及正常小鼠血清各3份，以ELISA法观察本多肽抗原的专一性。
五、对照实验
取曾经Abbott药盒检测抗HD的冻存5～8年血标本36份，以本多肽抗原建立的ELISA法检测抗HD，比较两者的结果。
六、人工合成HDAg 27肽测抗HD结果的判断
参照Abbott试剂盒计算临界值(cutoff值)＝0.4×阴性对照吸光度增值+0.6×阳性对照吸光度均值。大于或等于cutoff值判为阳性结果；阳性对照与阴性对照吸光度值之差大于或等于0.4判为当次实验结果有效。
, 百拇医药
七、临床检测对象
1990～1992年本院献身员300名；同期HBV表面抗原(HBsAg)阳性无症状携带者410例(本市中心血站献血员筛选HBsAg阳性者183例，本院门诊及住院非肝炎HVBM阳性者227例)；甲型肝炎(HBVM阴性抗HAVIgM阳性)62例；非乙型肝炎(HBVM和抗HAVIgM均阴性)58例；HBVM阳性各类肝病患者(1990年10月～1992年6月住院患者)449例，其中，急性肝炎(AH)68例，慢性迁延型肝炎)CPH)9例，慢性活动型肝炎(CAH)121例，重型肝炎(SH)75例包括急性、亚急性及慢性重型肝炎)，肝炎肝硬化(LC)78例，HBVM阳性原发性肝细胞癌(PHC)98例。诊断标准按1990年上海全国病毒肝炎会议修定的方案。LC及PHC患者血标本主要由本院消化内科和矸胆外科提供。
结 果
一、天然HDAg对HDV合成肽抗原检测抗HD的阻断(表1)
, 百拇医药
表1 天然HDAg对HDV合成肽抗原检测抗HD的阻断 标本编号
合成肽抗原检测血清抗HD结果
血标本(1:2稀释)
血标本+HDAg阳性血清(1:1)
1
0.55
0.125
2
0.71
0.09
3
0.35
, 百拇医药
0.14
4
0.37
0.09
5
0.46
0.10
6
0.65
0.10
7
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0.14
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8
0.15
0.11
9
0.13
0.13
阳性对照
0.63/0.43
阴性对照
0.08/0.06
由表1可见，当被检抗HD阳性血清中加入HDAg阳性血清后，其吸光度值由阳性范围降至阴性范围；而抗HD阴性标本的吸光度值基本不变。
, 百拇医药 二、HDV多肽抗原的专一性(表2)
由表2可见，HDV合成肽抗原与正常人血清、正常小鼠血清以及单纯甲型、乙型、丙型肝炎患者血清交叉免疫反应。
表2 HDV合成肽抗原检测抗HD的免疫反应 组别
检测例数
抗HAVIgM阳性例数
抗HBcIgM阳性例数
抗HC阳性例数
抗HD阳性例数
正常人群
103
0
, 百拇医药
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单纯甲肝
3
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0
单纯乙肝
3
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0
单纯丙肝
3
0
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丁型肝炎
3
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2△
3
正常小鼠
, 百拇医药
3*
-
-
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0
*酶标抗体为羊抗鼠IgG-HRP △为丙型，丁型肝炎混合感染
三、与Abbott试剂盒检测抗HD结果比较
原Abbott药盒检出的11份抗HD阳性冻存多年的血标本，采用本多肽抗原ELISA法检测，抗HD仍为阳性；24份抗HD阴性标本检测结果也是阴性，两种试剂检出结果相符35/36份，符合率为97.2%。
四、各类人员抗HD检测结果(表3)
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由表3可见，献血员中仅1例抗HD阳性。该例同份血清经检测ALT较正常值升高2倍以上，揭示为现症患者；单纯甲型肝炎和非乙型肝炎均未检出抗HD阳性者。在449例各类HBVM阳性肝病患者中，抗HD阳性87例(19.4%)；410例无症状HBsAg携带者中抗HD阳性有13例(3.2%)。
表3 合成肽HDAg ELISA法检测各类人员血清抗HD结果 组别
检测例数
阳性例数
阳性率(%)
献血员
300
1
0.3
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甲型肝炎
62
0
0
非乙型肝炎
58
0
0
HBV感染者
859
100
11.6
ASC
, 百拇医药 410
13
3.2
AH
68
7
10.3
CPH
9
1
11.1
CAH
121
22
, 百拇医药
18.2
SH
75
15
20.0
LC
78
23
29.5
PHC
98
19
19.4
, 百拇医药 合 计
1279
101
7.9
讨 论
1986年以来，国际上先后发表了五个不同地区来源的HDV核苷酸部分和全序列，以及根据HDAg阅读框架上核苷酸序列推算的氨基酸序列〔1～4〕，为研究HDAg抗原特性提供了可参考的分子生物学依据。与此同时，Bergmann等〔5〕，Lin等〔6〕及Wang等〔7〕等学者又分析研究了HDAg抗原性的分布状态，发现HDAg的抗原性沿其氨基酸序列全长分布，但其中某些部位的抗原性较为明显，为我们设计、选择合成HDAg片段提供了重要依据。
人工合成多肽抗原的制备、应用始于七十年代、是与基因工程技术同时发展起来的分子生物学技术之一。其优点在于，人工合成肽片段的大小可人为控制，可分割研究分析蛋白质的不同的区域的生物学活性，且简便、安全。由于HDV本身固有的特点，较难获得稳定性好、纯度高的天然HDAg。实验证实，我们选择的HDAg片段能识别天然抗HD，可与天然HDAg竞争抗HD，具有天然HDAg上相应片段的抗原活性；其专一性强，与正常人血清，正常小鼠血清和单纯甲型、乙型、丙型肝炎患者血清都不发生交叉免疫反应；经与Abbott试剂检测过的36份冻存血清抗HD结果比较，多肽抗原ELISA法检测抗HD结果与之符合率为97.2%；HDV多肽抗原还具有纯度高、稳定性好，易于获得，使用简便、安全等优点。
, 百拇医药
采用本HDV多肽抗原包被聚乙烯微孔板，建立ELISA法，检测1279例各类人员中的抗HD，进一步证实重庆地区各类HBV感染者中，有相当数量患者合并感染了HDV，总检出率为11.64%。尤其是在各慢性HBV感染的肝病患者及重症患者中所占比例较高，提示HDV对HBV感染者慢性化及重症化的形成可能有关，影响HBV感染者的预后。本实验结果与我们已往采用其它试剂检测HBV感染者血清抗HD的结果基本一致。
HDV合成肽抗原的获得和应用，可部分替代天然HDV抗原，为HDAg生物学活性的深入研究，HDV感染的流行病学研究和丁型肝炎发病机理的研究提供了又一个条件。
承重庆中心血站检验科，本院血库、免疫室、消化内科及肝胆外科提供病历及血标本，特表谢意。
参考文献
1 Makino S,Chang MF,Shien ChK,et,al.Molecular cloning and sequence of a human HDV RNA.Nature,1987,329:343
, 百拇医药
2 Chao YCh,Chang MF,Gust I,et al.Sequence conservation and divergence of HDV RNA.Virol,1990,178:384.
3 Chao YCh,Lee Chm,Tang HSh,et al.Molecular choning and Characterization of an isolate of HDV from Taiwan.Hepatol.1991,13:345.
4 Imazeki F,Omata M,Ohto M.Heterogenity and evolution rates of delta virus RNA.J Virol,1990,64:5594.
5 Bergmann KF,Cote PT,Moriarty A,Et al.Antigenic structure and humoral immune response.J Immunol,1989,143:3714.
, http://www.100md.com
6 Lin JH,Chang MF,Baker SC,et al.Characterization of HDAg:Specific Binding to HDV RNA J Virol,1990,64:4051.
7 Wang JG,Jansen RW,Brown EA,et al. Immunoginic domains of HDV antigen:Peptido Mapping of epitopes recognized by human and wooduchuck antiboties.J Virol,1990,64:1108.
(收稿：1992-09-23 修回：1993-01-13), 百拇医药