硬皮病患者抗血清及其抗原在细胞结构中的定位
作者：倪祖梅 苏立德 施履吉 钟叔平 曹根涛
单位：200031 中国科学院上海细胞生物学研究所(倪祖梅、施履吉、钟叔平、曹根涛)，上海市虹口区中心医院硬皮病科(苏立德)
关键词：硬皮病；自身抗体；抗原
中华医学杂志930505 摘要 对338例硬皮病患者的抗血清用间接免疫荧光法进行了细胞学检测，根据其各自所抗的细胞结构划分了抗血清的类型，主要分为6种：抗着丝粒、抗核仁、抗核质、抗异形染色质、抗染色体和抗中心体抗体。这6型中有几类可根据其所抗细胞结构的亚结构或化学成分(抗原)分为亚型。这些抗血清类型可能与硬皮病患者的症状及体征有关，并可能有助于临床诊断。
近年对硬皮病患者的多种自身抗体及其抗原的研究，除抗着丝粒及核仁外，未能彻底弄清它们与细胞结构的关系。鉴于细胞结构关系细胞正常生理生化过程，抗体对其组分的干扰，必然反映到临床表现，故我们着重研究它们在细胞结构中的定位。
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材料与方法
一、临床资料
为上海虹口区中心医院硬皮病科1988～1991年的硬皮病患者，共338例(其中系统性307例，局限型31例)，男：女为1∶66，年龄6～80岁，病程2～30年。
二、底物细胞
一般临床检测自家免疫抗体是用小鼠肝脏印片，这种印片中细胞分裂的各期时相很少看见。我们采用小鼠腹水癌细胞接种后4～5天可见多数分裂相，便于追踪抗原在各期细胞核结构中的定位。这种细胞和人类Hela细胞为底物所得的间接免疫荧光显微图无明显差异。
三、细胞样本的制备
接种癌细胞的小鼠于第4～5日取出腹水，加入磷酸盐缓冲液(PBS)内洗，离心1500xg，5分钟，反复3次。第3次离心后的压积细胞悬浮环于PBS液内，Xg离心40分钟倒盖玻片上，将带细胞的盖片浸入10%甲醛固定10分钟后，取出淋去多余固定液，浸入-10℃冷丙酮内10分钟浸入PBS液内备用。
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四、病人抗血清的预处理
采血，取血清，在56℃温浴内温育30分钟，取出冷却，加NaN3至0.02%，4℃冰箱保存备用。
五、间接免疫荧光法显示抗血清的抗原
将底物细胞盖片取出，淋去多余PBS后将病人血清用同样PBS液稀释，滴度从1∶40开始，如过浓再继续倍比稀释至适度为宜(适度指最后显示荧光图象清晰，特异荧光与背景的反差度好)。用病人的抗血清稀释液将细胞一部覆盖后，置37℃湿盒内温育1小时。1小时后用PBS深液洗3次，每次5～10分钟，再上羊抗人FITC标记的IgG，滴度：1∶16～1∶32。37℃温育1小时后，PBS同前洗3次。最后用DNA专一荧光染色剂Hoechst 33258 lμg/ml浓度复杂1分钟，PBS洗过。将样品盖片覆在载片上，其间用0.1%间苯二胺于1体积PBS、9体积甘油液封片，在Nikon落射式荧光镜下观察。
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结 果
共观察338例硬皮病患者血清的间接免疫荧光染片，得到330个抗细胞结构的抗血清，其中有些已报道[科学通报，1987；23∶1839和Proc Natl Acad Sci USA,1980;77:1627]。
1.抗着丝粒抗血清：用这种血清为第一抗体得到的免疫荧光图象特点是，每个中期染色体的初级缢痕处都有一对荧光颗粒，每个间期细胞的G1期核内部都有分散的单一的荧光亮点，而在G2期核中则有分散的成对的荧光点。
2.抗核仁特异抗血清：抗核仁抗体是在硬皮病患者血清中很常见的一种。用此抗血清染出的核仁，或呈致密的荧光块状，或以细颗粒占据核仁所在部位，核的其他部位只有极弱的荧光背景。在分裂期，则不同的抗核仁抗血清的抗原可分别分布于染色体周边、核仁组织者、细胞质内等，分散性很强，这与核仁是具有一、二百种蛋白质的细胞结构的事实相符合。
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3.抗核质特异抗血清：这种抗血清的免疫荧光染色的特点是整个间期核除核仁部位以外，均为微细荧光颗粒所覆盖，至分裂中期和后期时，所有被染成荧光的物质皆位于细胞质内，而染色体部分则不被染色成为负影。
4.抗染色体抗血清：这是一种以往国内外都没有报道过的硬皮病患者的抗血清，这种抗血清的免疫荧光图象是，在整个间期细胞核内均被覆了均一弥散的荧光，细胞质荧光背景极淡。而细胞分裂至中期时，染色体被染成很强的荧光，此时的细胞质内有较淡的弥散荧光，分裂后期和末期的情况与中期细胞相同(图1～6)。
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图1～6 分别为分裂中期侧面、正面及末期的小鼠腹水癌细胞。其中图1～3为Hoechst染色，染色体均被浓染；；图4～6为硬皮病46抗血清作免疫荧光染色，染色体均被着色。这两种染色体着色完全一致，说明硬皮病46抗血清内含抗染色体抗体。
5.抗异形染色质的特异抗血清：异形染色质的DNA是富含腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基的，能被Hoechst33258更强地染出。在间期核中当用这类病人的血清染细胞时所出现的荧光点与Hoechst33258所染出的总体上是对应的。而用这种抗血清染分裂期细胞时，荧光也在染色体的短臂处；以致这些荧光特质随中期染色体的排列而形成环状。在分裂后期也可看到Hoechst33258染出的染色体的全部而抗血清所染出的是短臂部位。
6.抗中心体抗血清：这是抗细胞质结构的抗血清。用这种抗血清染色的结果见图7～12。可见在间期核中接近核的胞质部位有被这种抗血清染出的荧光颗粒，有时一粒，有时为两粒。在分裂早期可看到两颗位置相近的斑点；在前中期时，有两颗距离较远的斑点；到后期出现两对相近的荧光斑点；到末期时两极(两个子细胞内)各有两个距离较远的荧光斑点(两个细胞各有两粒)。
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图7～12 为间期、中期后期的艾氏腹水癌细胞。其中图7～9为Hoechst染色，显示出染色质和染色体图象；图10～12为该抗体着染的中心体；图10可见中心体在核外的染色质内；图11的中心体重叠在核区；图12显示出染色体各有一对中心
讨 论
一、硬皮病抗血清抗细胞结构的类别
本组338例患者血清中共发现六大类抗细胞结构的特异抗血清。这六大类中有些类别还可进一步分成亚类，就抗核仁抗血清而论，至今为止就发现多种类型。这方面的研究还在深入探讨。
二、抗细胞结构抗血清的意义
以往我们的研究已发现了多种抗细胞结构的特异抗血清。细胞结构含有复杂的组分，且每种组分含量甚微，难于用常规生物化学进行分析鉴定，显然这些抗血清中的抗体将有助于对细胞结构的化学组分，如蛋白质组分的分析，和各组分在细胞分裂周期中的动态变化。这是本研究的细胞生物学意义。另一方面，就临床而言，如能找到这些抗血清与硬皮病患者的症状与体征间的一定关系，则有助于硬皮病类型的诊断、病情的估计及预的推测。目前就这六类抗体类型与硬皮病临床类型的关系已初见端倪。本组资料中有抗着丝粒抗体的病人13例，其中有11例(84.6%)表现为CREST症侯群；抗核仁阳性者88例，有59例(67%)属系统性红斑狼疮中的弥漫型，临床表现病情最重，内脏损害最多，死亡率最高。抗中心体阳性者6例，其中5例属局限性硬皮病，病情最轻，无内脏损害，预后均好。抗核质阳性者有194例，其中有123例(63.4%)属系统性硬皮病中的肢端形，病情较重，内脏损害多，病情介于抗核仁及抗中心体抗体阳性患者之间。如能找到这些抗血清的抗原在细胞结构中所具有的功能，和自身抗体对抗原功能的损害与患者病理生理间的关系，更将有助于对此病的治疗和对预后的预测，这一方面还需作更多更沈入的工作。
三、细胞结构特异抗血清的本质
以往研究说明这类病人抗血清一般均属多克隆抗体，它们的抗原也属于多组分的。由于以上各种抗血清是细胞结构专一的，所以各种抗血清的抗原不管其种类多少，必然都是其所抗细胞结构的组分。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
(收稿：1992-06-17 修回：1993-02-10), 百拇医药
单位：200031 中国科学院上海细胞生物学研究所(倪祖梅、施履吉、钟叔平、曹根涛)，上海市虹口区中心医院硬皮病科(苏立德)
关键词：硬皮病；自身抗体；抗原
中华医学杂志930505 摘要 对338例硬皮病患者的抗血清用间接免疫荧光法进行了细胞学检测，根据其各自所抗的细胞结构划分了抗血清的类型，主要分为6种：抗着丝粒、抗核仁、抗核质、抗异形染色质、抗染色体和抗中心体抗体。这6型中有几类可根据其所抗细胞结构的亚结构或化学成分(抗原)分为亚型。这些抗血清类型可能与硬皮病患者的症状及体征有关，并可能有助于临床诊断。
近年对硬皮病患者的多种自身抗体及其抗原的研究，除抗着丝粒及核仁外，未能彻底弄清它们与细胞结构的关系。鉴于细胞结构关系细胞正常生理生化过程，抗体对其组分的干扰，必然反映到临床表现，故我们着重研究它们在细胞结构中的定位。
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材料与方法
一、临床资料
为上海虹口区中心医院硬皮病科1988～1991年的硬皮病患者，共338例(其中系统性307例，局限型31例)，男：女为1∶66，年龄6～80岁，病程2～30年。
二、底物细胞
一般临床检测自家免疫抗体是用小鼠肝脏印片，这种印片中细胞分裂的各期时相很少看见。我们采用小鼠腹水癌细胞接种后4～5天可见多数分裂相，便于追踪抗原在各期细胞核结构中的定位。这种细胞和人类Hela细胞为底物所得的间接免疫荧光显微图无明显差异。
三、细胞样本的制备
接种癌细胞的小鼠于第4～5日取出腹水，加入磷酸盐缓冲液(PBS)内洗，离心1500xg，5分钟，反复3次。第3次离心后的压积细胞悬浮环于PBS液内，Xg离心40分钟倒盖玻片上，将带细胞的盖片浸入10%甲醛固定10分钟后，取出淋去多余固定液，浸入-10℃冷丙酮内10分钟浸入PBS液内备用。
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四、病人抗血清的预处理
采血，取血清，在56℃温浴内温育30分钟，取出冷却，加NaN3至0.02%，4℃冰箱保存备用。
五、间接免疫荧光法显示抗血清的抗原
将底物细胞盖片取出，淋去多余PBS后将病人血清用同样PBS液稀释，滴度从1∶40开始，如过浓再继续倍比稀释至适度为宜(适度指最后显示荧光图象清晰，特异荧光与背景的反差度好)。用病人的抗血清稀释液将细胞一部覆盖后，置37℃湿盒内温育1小时。1小时后用PBS深液洗3次，每次5～10分钟，再上羊抗人FITC标记的IgG，滴度：1∶16～1∶32。37℃温育1小时后，PBS同前洗3次。最后用DNA专一荧光染色剂Hoechst 33258 lμg/ml浓度复杂1分钟，PBS洗过。将样品盖片覆在载片上，其间用0.1%间苯二胺于1体积PBS、9体积甘油液封片，在Nikon落射式荧光镜下观察。
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结 果
共观察338例硬皮病患者血清的间接免疫荧光染片，得到330个抗细胞结构的抗血清，其中有些已报道[科学通报，1987；23∶1839和Proc Natl Acad Sci USA,1980;77:1627]。
1.抗着丝粒抗血清：用这种血清为第一抗体得到的免疫荧光图象特点是，每个中期染色体的初级缢痕处都有一对荧光颗粒，每个间期细胞的G1期核内部都有分散的单一的荧光亮点，而在G2期核中则有分散的成对的荧光点。
2.抗核仁特异抗血清：抗核仁抗体是在硬皮病患者血清中很常见的一种。用此抗血清染出的核仁，或呈致密的荧光块状，或以细颗粒占据核仁所在部位，核的其他部位只有极弱的荧光背景。在分裂期，则不同的抗核仁抗血清的抗原可分别分布于染色体周边、核仁组织者、细胞质内等，分散性很强，这与核仁是具有一、二百种蛋白质的细胞结构的事实相符合。
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3.抗核质特异抗血清：这种抗血清的免疫荧光染色的特点是整个间期核除核仁部位以外，均为微细荧光颗粒所覆盖，至分裂中期和后期时，所有被染成荧光的物质皆位于细胞质内，而染色体部分则不被染色成为负影。
4.抗染色体抗血清：这是一种以往国内外都没有报道过的硬皮病患者的抗血清，这种抗血清的免疫荧光图象是，在整个间期细胞核内均被覆了均一弥散的荧光，细胞质荧光背景极淡。而细胞分裂至中期时，染色体被染成很强的荧光，此时的细胞质内有较淡的弥散荧光，分裂后期和末期的情况与中期细胞相同(图1～6)。
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图1～6 分别为分裂中期侧面、正面及末期的小鼠腹水癌细胞。其中图1～3为Hoechst染色，染色体均被浓染；；图4～6为硬皮病46抗血清作免疫荧光染色，染色体均被着色。这两种染色体着色完全一致，说明硬皮病46抗血清内含抗染色体抗体。
5.抗异形染色质的特异抗血清：异形染色质的DNA是富含腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基的，能被Hoechst33258更强地染出。在间期核中当用这类病人的血清染细胞时所出现的荧光点与Hoechst33258所染出的总体上是对应的。而用这种抗血清染分裂期细胞时，荧光也在染色体的短臂处；以致这些荧光特质随中期染色体的排列而形成环状。在分裂后期也可看到Hoechst33258染出的染色体的全部而抗血清所染出的是短臂部位。
6.抗中心体抗血清：这是抗细胞质结构的抗血清。用这种抗血清染色的结果见图7～12。可见在间期核中接近核的胞质部位有被这种抗血清染出的荧光颗粒，有时一粒，有时为两粒。在分裂早期可看到两颗位置相近的斑点；在前中期时，有两颗距离较远的斑点；到后期出现两对相近的荧光斑点；到末期时两极(两个子细胞内)各有两个距离较远的荧光斑点(两个细胞各有两粒)。
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图7～12 为间期、中期后期的艾氏腹水癌细胞。其中图7～9为Hoechst染色，显示出染色质和染色体图象；图10～12为该抗体着染的中心体；图10可见中心体在核外的染色质内；图11的中心体重叠在核区；图12显示出染色体各有一对中心
讨 论
一、硬皮病抗血清抗细胞结构的类别
本组338例患者血清中共发现六大类抗细胞结构的特异抗血清。这六大类中有些类别还可进一步分成亚类，就抗核仁抗血清而论，至今为止就发现多种类型。这方面的研究还在深入探讨。
二、抗细胞结构抗血清的意义
以往我们的研究已发现了多种抗细胞结构的特异抗血清。细胞结构含有复杂的组分，且每种组分含量甚微，难于用常规生物化学进行分析鉴定，显然这些抗血清中的抗体将有助于对细胞结构的化学组分，如蛋白质组分的分析，和各组分在细胞分裂周期中的动态变化。这是本研究的细胞生物学意义。另一方面，就临床而言，如能找到这些抗血清与硬皮病患者的症状与体征间的一定关系，则有助于硬皮病类型的诊断、病情的估计及预的推测。目前就这六类抗体类型与硬皮病临床类型的关系已初见端倪。本组资料中有抗着丝粒抗体的病人13例，其中有11例(84.6%)表现为CREST症侯群；抗核仁阳性者88例，有59例(67%)属系统性红斑狼疮中的弥漫型，临床表现病情最重，内脏损害最多，死亡率最高。抗中心体阳性者6例，其中5例属局限性硬皮病，病情最轻，无内脏损害，预后均好。抗核质阳性者有194例，其中有123例(63.4%)属系统性硬皮病中的肢端形，病情较重，内脏损害多，病情介于抗核仁及抗中心体抗体阳性患者之间。如能找到这些抗血清的抗原在细胞结构中所具有的功能，和自身抗体对抗原功能的损害与患者病理生理间的关系，更将有助于对此病的治疗和对预后的预测，这一方面还需作更多更沈入的工作。
三、细胞结构特异抗血清的本质
以往研究说明这类病人抗血清一般均属多克隆抗体，它们的抗原也属于多组分的。由于以上各种抗血清是细胞结构专一的，所以各种抗血清的抗原不管其种类多少，必然都是其所抗细胞结构的组分。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
(收稿：1992-06-17 修回：1993-02-10), 百拇医药