肝炎综合征患儿尿液中分离出一株7型腺病毒
作者：王思智 施圣云 谢西平 李桦 唐伟
单位：210008南京市儿童医院病毒室(王恩智、施圣云、谢西平、李桦)；南京大学生化系(唐伟)
关键词：
中华医学杂志930518 1986～1989，我们对南京地区婴幼儿肝炎综合征进行了研究〔1〕。自122例患儿咽拭子和尿液中分离出29株病毒(23.8%)，经鉴定，28株为巨细胞病毒(CMV)，证实CMV为本病的主要病原。另一株经鉴定为特殊基因型Ad7病毒，现简报如下。
一、临床资料
患儿男，5月龄。于3.5月龄时发病。患儿高热38～40.6℃皮肤黄染，肝肋下4cm，脾肋下2.5cm，心肺未见异常。黄疸持续74天，病程82天。化验检查：红细胞3.62×1212/L(362万/mm3)白细胞5.9×109/L(5900/mm3)，淋巴细胞76%血小板60×109/L(6万/mm3)；肝功能试验：直接胆红素135μmol/L(11.39/dl),ALT145单位；两对半(-)，血清CMV-igM抗体(-)。临床诊断为肝炎综合征。患儿出生时为足月顺产，母乳喂养、生长发育一般，无其它病史，半年后随访，预后佳。
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二、材料与方法
1.病毒分离鉴定：采集患儿尿液，感染人胚肺细胞，出现CPE后用3、7、11型腺病毒免疫血清作中和试验鉴定。
2.Ad7特异性IgM抗体检测：采用α-ME法，按常规操作，用Ad3毒株同批检测作为对照。
3.病毒DNA提取：取病毒细胞培养物，经冻化、超声处理，PEG沉淀，核糖核酸酶、蛋白酶K、1%SDS消化、裂解处理后用酚试剂抽提3次，无水乙醇浓缩抽干备用。
4.DNA内切酶分析〔2〕：病毒DNA分别加BamHI、SmaI、EcoRI内切酶(各含100单位)，置水浴箱孵育3小时(BamHI、EcoRI 37℃，SmaI 30℃)，无水乙醇洗1次，离心沉淀后抽干，加少量TE溶解备用。
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5.电泳：用0.8%琼脂糖凝胶缓冲液为TAE，分子量标记为λDNA HindⅢ酶切片段，在电压75V，电流300A室温20℃条件下电泳1～2小时，观察结果并照像记录。
三、结果
1.病毒分离与鉴定：标本接种细胞后3天，细胞开始肿胀、增大，对光折射增强，逐渐聚集圆化，呈葡萄串样，迅速脱落。中和试验只能被Ad7血清中和，对Vero、Hep2、Hela、Hele细胞均敏感。电镜下见到细胞核内大量典型腺病毒颗粒。
2.患儿血清Ad7-IgM抗体检测：为患儿急性期单份血清，HI滴度为1∶80，用α-ME处理后降低4倍(1∶20)，Ad3对照组为阴性。说明为Ad7特异性IgM抗体。
3.酶谱分析：新分离毒株经BamHI酶切后获8条基因带，分子量0.7～18.0kb；参考档获9条带，分子量0.7～8.0kb。EcoRI酶切分离株获3条带，分子量4.4～23.5kb；参考株多1条带，分子量0.6～24.3kb；SmaI酶切分离株获8条带，分子量1.1～10.2kb；参考株获7条带，分子量1.1～9.7kb(附表)。3种酶切结果，分离株与参考株有明显不同。
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附表 新分离株及Ad7参考株酶切多片断分子量(kb)
BamHI
EcoRI
Smal
λDNAIII Hind
rvs
ivs
rvs
ivs
rvs
ivs
8.0
, 百拇医药
18.0
24.3
23.5
9.7
10.2
23.3
6.0
8.6
5.3
5.1
8.6
6.1
9.3
, 百拇医药
4.5
4.2
4.6
4.4
6.4
4.2
6.4
3.7
3.7
0.6
5.1
3.7
4.2
, 百拇医药
2.4
2.4
3.9
2.2
2.0
1.1
2.4
1.8
1.5
0.9
2.0
0.53
1.1
, 百拇医药
0.7
1.1
0.7
注:rvs:参考株;ivs新分离株
A:BamHI;B:EcoRI;C:SmaI;D、λDNA标记;r:参考株;n:新分离株
附图 新分离株与参考Ad7株酶谱分析
四、讨论
人类腺病毒至今已有41个血清型〔3〕，主要引起人呼吸道，肠道和眼部疾病，个别文献〔4〕曾提及腺病毒可引起小儿肝炎综合征，我们从1例肝炎综合征患儿尿液中分离出一株7型腺病毒并经血清学检测证实，说明腺病毒的确是肝炎综合征的病原之一。但患儿临床表现与CMV所致肝炎综合征无法区别，只有通过病毒分离才能确诊。
, 百拇医药
文献〔5〕报道，根据DNA同源性特性，腺病毒可分为A～G7个亚型。用多种限制性内切酶酶切又可分为若干不同基因型。Li等〔6〕报道，我国1958～1981年主要为Ad7b流行，1986年以后为Ad7d流行。1988年我们自1例病毒性肺炎患儿咽拭子中分离到一株Ad7，酶谱分析为Ad7d型，与文献〔7〕报道一致。但本实验自肝炎综合征患儿尿液中分离出的Ad7病毒株。基因图谱与文献〔5，6〕报道的各已知基因型图谱有较大的差异，与国内Ad7b、Ad7d型亦有明显的不同，是一种新的基因型。提示不同基因型的出现可能是相同血清型腺病毒引起不同疾病的内在因素。腺病毒的基因分型及其与疾病的关系尚有待进一步研究。本实验结果还提示，在腺病毒感染中，对基因型的识别比了解其血清分型更为重要。
参考文献
, 百拇医药
1 王思智，施圣方，谢西平等.婴幼儿巨细胞病毒感染实验诊断研究.江苏医药，1990，16：660.
2 Johansson M E, Brundin M,Adamson L,et al. Characterization of two genome type of adenovirus type31 isolated in Stockhlom during 1987. J Med Virol, 1989,28:63.
3 Adrian. T, Wadell G, Hierholzer JC,et al. DNA restriction analysis of adenovirus prototypes 1 to 41. Arch Virol, 1986,91:277.
4 张婉华，曹惠霖，张满仓等.EB病毒和巨细胞病毒抗体IgG与IgM检测在各类肝炎病例中的诊断意义.中国医学科学院学报，1982，4：189.
, 百拇医药
5 Wadell G,Cooney MK, da Costa Linhares A, et al. Molecular epidemology of adenovirus: global distribution of adenovirus 7 genome types. J Clin Microbiol,1985,21:403.
6 Li QG, Wadell G.Analysis of 15 different genome types of adeno virus type 7 isolated on five continents.J Virol,1986,60:331.
7 Fu WY,Wang ZL,Liu ZG et al.Molecular epidemiology of clinical study on adenovirus 3 and 7 in China. J Norman Bethune Univ Med Sci, 1990,16:330.
(收稿：1992-05-18 修回：1993-01-18), 百拇医药
单位：210008南京市儿童医院病毒室(王恩智、施圣云、谢西平、李桦)；南京大学生化系(唐伟)
关键词：
中华医学杂志930518 1986～1989，我们对南京地区婴幼儿肝炎综合征进行了研究〔1〕。自122例患儿咽拭子和尿液中分离出29株病毒(23.8%)，经鉴定，28株为巨细胞病毒(CMV)，证实CMV为本病的主要病原。另一株经鉴定为特殊基因型Ad7病毒，现简报如下。
一、临床资料
患儿男，5月龄。于3.5月龄时发病。患儿高热38～40.6℃皮肤黄染，肝肋下4cm，脾肋下2.5cm，心肺未见异常。黄疸持续74天，病程82天。化验检查：红细胞3.62×1212/L(362万/mm3)白细胞5.9×109/L(5900/mm3)，淋巴细胞76%血小板60×109/L(6万/mm3)；肝功能试验：直接胆红素135μmol/L(11.39/dl),ALT145单位；两对半(-)，血清CMV-igM抗体(-)。临床诊断为肝炎综合征。患儿出生时为足月顺产，母乳喂养、生长发育一般，无其它病史，半年后随访，预后佳。
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二、材料与方法
1.病毒分离鉴定：采集患儿尿液，感染人胚肺细胞，出现CPE后用3、7、11型腺病毒免疫血清作中和试验鉴定。
2.Ad7特异性IgM抗体检测：采用α-ME法，按常规操作，用Ad3毒株同批检测作为对照。
3.病毒DNA提取：取病毒细胞培养物，经冻化、超声处理，PEG沉淀，核糖核酸酶、蛋白酶K、1%SDS消化、裂解处理后用酚试剂抽提3次，无水乙醇浓缩抽干备用。
4.DNA内切酶分析〔2〕：病毒DNA分别加BamHI、SmaI、EcoRI内切酶(各含100单位)，置水浴箱孵育3小时(BamHI、EcoRI 37℃，SmaI 30℃)，无水乙醇洗1次，离心沉淀后抽干，加少量TE溶解备用。
, http://www.100md.com
5.电泳：用0.8%琼脂糖凝胶缓冲液为TAE，分子量标记为λDNA HindⅢ酶切片段，在电压75V，电流300A室温20℃条件下电泳1～2小时，观察结果并照像记录。
三、结果
1.病毒分离与鉴定：标本接种细胞后3天，细胞开始肿胀、增大，对光折射增强，逐渐聚集圆化，呈葡萄串样，迅速脱落。中和试验只能被Ad7血清中和，对Vero、Hep2、Hela、Hele细胞均敏感。电镜下见到细胞核内大量典型腺病毒颗粒。
2.患儿血清Ad7-IgM抗体检测：为患儿急性期单份血清，HI滴度为1∶80，用α-ME处理后降低4倍(1∶20)，Ad3对照组为阴性。说明为Ad7特异性IgM抗体。
3.酶谱分析：新分离毒株经BamHI酶切后获8条基因带，分子量0.7～18.0kb；参考档获9条带，分子量0.7～8.0kb。EcoRI酶切分离株获3条带，分子量4.4～23.5kb；参考株多1条带，分子量0.6～24.3kb；SmaI酶切分离株获8条带，分子量1.1～10.2kb；参考株获7条带，分子量1.1～9.7kb(附表)。3种酶切结果，分离株与参考株有明显不同。
, http://www.100md.com
附表 新分离株及Ad7参考株酶切多片断分子量(kb)
BamHI
EcoRI
Smal
λDNAIII Hind
rvs
ivs
rvs
ivs
rvs
ivs
8.0
, 百拇医药
18.0
24.3
23.5
9.7
10.2
23.3
6.0
8.6
5.3
5.1
8.6
6.1
9.3
, 百拇医药
4.5
4.2
4.6
4.4
6.4
4.2
6.4
3.7
3.7
0.6
5.1
3.7
4.2
, 百拇医药
2.4
2.4
3.9
2.2
2.0
1.1
2.4
1.8
1.5
0.9
2.0
0.53
1.1
, 百拇医药
0.7
1.1
0.7
注:rvs:参考株;ivs新分离株
A:BamHI;B:EcoRI;C:SmaI;D、λDNA标记;r:参考株;n:新分离株
附图 新分离株与参考Ad7株酶谱分析
四、讨论
人类腺病毒至今已有41个血清型〔3〕，主要引起人呼吸道，肠道和眼部疾病，个别文献〔4〕曾提及腺病毒可引起小儿肝炎综合征，我们从1例肝炎综合征患儿尿液中分离出一株7型腺病毒并经血清学检测证实，说明腺病毒的确是肝炎综合征的病原之一。但患儿临床表现与CMV所致肝炎综合征无法区别，只有通过病毒分离才能确诊。
, 百拇医药
文献〔5〕报道，根据DNA同源性特性，腺病毒可分为A～G7个亚型。用多种限制性内切酶酶切又可分为若干不同基因型。Li等〔6〕报道，我国1958～1981年主要为Ad7b流行，1986年以后为Ad7d流行。1988年我们自1例病毒性肺炎患儿咽拭子中分离到一株Ad7，酶谱分析为Ad7d型，与文献〔7〕报道一致。但本实验自肝炎综合征患儿尿液中分离出的Ad7病毒株。基因图谱与文献〔5，6〕报道的各已知基因型图谱有较大的差异，与国内Ad7b、Ad7d型亦有明显的不同，是一种新的基因型。提示不同基因型的出现可能是相同血清型腺病毒引起不同疾病的内在因素。腺病毒的基因分型及其与疾病的关系尚有待进一步研究。本实验结果还提示，在腺病毒感染中，对基因型的识别比了解其血清分型更为重要。
参考文献
, 百拇医药
1 王思智，施圣方，谢西平等.婴幼儿巨细胞病毒感染实验诊断研究.江苏医药，1990，16：660.
2 Johansson M E, Brundin M,Adamson L,et al. Characterization of two genome type of adenovirus type31 isolated in Stockhlom during 1987. J Med Virol, 1989,28:63.
3 Adrian. T, Wadell G, Hierholzer JC,et al. DNA restriction analysis of adenovirus prototypes 1 to 41. Arch Virol, 1986,91:277.
4 张婉华，曹惠霖，张满仓等.EB病毒和巨细胞病毒抗体IgG与IgM检测在各类肝炎病例中的诊断意义.中国医学科学院学报，1982，4：189.
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5 Wadell G,Cooney MK, da Costa Linhares A, et al. Molecular epidemology of adenovirus: global distribution of adenovirus 7 genome types. J Clin Microbiol,1985,21:403.
6 Li QG, Wadell G.Analysis of 15 different genome types of adeno virus type 7 isolated on five continents.J Virol,1986,60:331.
7 Fu WY,Wang ZL,Liu ZG et al.Molecular epidemiology of clinical study on adenovirus 3 and 7 in China. J Norman Bethune Univ Med Sci, 1990,16:330.
(收稿：1992-05-18 修回：1993-01-18), 百拇医药