大黄对体外肾小管细胞增殖的影响
作者：郑 丰 黎磊石
单位：210002 南京金陵医院全军肾病中心
关键词：大黄；肾小管；细胞培养
中华医学杂志930608 摘要 在建立体外肾小管细胞培养的基础上，以3H-TdR掺入量为指标，观察大黄对肾小管细胞增殖的影响。结果发现：(1)服大黄的大鼠的血清加入肾小管细胞培养液中可抑制细胞增殖，抑制作用随大鼠服药剂量增加和时间延长而相应增加。(2)将大黄的生物活性成份大黄素纯品直接加入肾小管细胞培养液中亦可抑制细胞增殖。大黄抑制肾小管细胞增殖可能是其治疗慢性肾功能衰竭的机现。
我们以往的观察已证实，中药大黄对于延缓慢性肾功能不全的进展具有良好的效果〔1〕。但其具体作用机制还不十分明了。鉴于肾小管在慢性肾功能不全的发生、发展中具有重要作用，本实验采用体外肾小管细胞培养的方法，观察大黄对肾小管细胞增殖的影响，以探索其作用机制。
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材料和方法
1.动物：幼年SD大鼠，60～80g，雌雄不限。
2.细胞培养液LRPMI 1640加L-谷氨酰胺2mmol/L加青、链霉素各100U/ml加10%灭活的小牛血清，pH用HEPEs缓冲液(25mmol/L)及NaHCO3调至7.5左右。渗透压285mOsm/kg。
3.大黄、3H-TdT：大黄醇提膏、大黄素纯品(纯度>90%)由中国医科大学陈琼华教授提供。大黄素纯品需加碱方可溶解。取大黄素0.1加0.1mol/L NaoH 2ml，1640稀释至10ml，pH7.9。以不同剂量加入96孔细胞培养板后，pH7.7，渗透压290mOsm/kg，因肾小管体外细胞培养条件本身以pH7.5为佳〔2〕，而设立NaOH为对照。3H-TdR购自中国原子能研究所。
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4.肾小管细胞培养：采用机械网筛滤过的方法。无菌条件下摘除大鼠肾脏，取皮质剪碎，研磨后依次通过280μm、150μm、98μm网筛，洗下98μm网筛面上肾小管，再次滤过98μm，加压冲洗，最后收获肾小管。经1640漂洗，镜检肾小管纯度>90%后，将其置入含10%小牛血清的1640培养液中，放入37℃，5%CO2孵箱中培养，约3天贴壁，第4天见上皮样细胞环绕肾小管层层向外生长，第7天细胞基本铺满培养瓶。
5.肾小管上皮细胞增殖测定：原代培养第6天肾小管上皮细胞，经0.01%胰蛋白酶消化，用含10%小牛血清的1640培养液调整细胞密度至1×105ml，以每孔100μl加入96孔培养板，培养24小时，细胞完全贴壁后，吸除培养液，加入100μl含25%待测样品或血清的1640培养液(每份样品设4个复孔)，24小时后加入2H-TdR0.5Ci，继续培养24小时，收集细胞于49型玻璃纤维滤液上，经80℃烘干，置适量闪烁液中，以国产YST-F6型液闪器测定每份样品每分钟脉冲数(cpm)，为使各次实验数据能统一比较(实验重复6次)，实验结果以3J-TdR掺入率表示(实验组cpm值或实验对照组cpm值除以正常培养液对照组cpm值)。
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结 果
一、肾小管上皮细胞的鉴定
1.相关显微镜下形态学：镜下见上皮形态细胞层层环绕肾小管生长，有dome形成〔2〕，见图1。
图1 上皮形态细胞层层环绕肾小管生长,有dome形成
2.酶组织化学染色：根据肾组织细胞的特异性酶学分布〔3〕。用Gomoni法显示碱性磷酸酶，本实验培养细胞碱性磷酸酶染色均阳性，表明细胞来源于肾近端小管。
二、大黄对肾小管上皮细胞增殖的影响
采取体内、外对照的方法。“体内”以大黄醇提膏喂饲大鼠，取服药后大鼠血清稀释到25%浓度，加入96孔细胞培养板，观察其对细胞增殖的影响，并以假饲大鼠血清及培养用小牛血清作双重对照；“体外”将大黄素纯品直接加入培养液中。“体内外”实验后细胞均作活性染色。
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1.服药后不同时间血清对细胞增殖的影响：大鼠灌服大黄100mg/100g后不同时间采血，3小时标本对细胞增殖出现明显抑制作用，9小时最强(3H-TdR掺入率为38±10%P<0.01)，12小时开始减弱(图2)。
图2 服大黄后不同时间血清对细胞增殖的影响
2.不同剂量服药后血清对细胞增殖的影响：大鼠灌服不同剂量大黄2周后采血，25mg灌服剂量即对细胞增殖出现明显抑制作用(3H-TdR掺入率65±99%，P<0.01)，随剂量增加抑制作用增强(图3)。
图3 服不同剂量大黄后血清对细胞增殖的影响
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3.急、慢性给药对细胞增殖的影响：大鼠急性给药后，继续灌服大黄100mg/100g每日一次，2周后采血，结果慢性给药对肾小管上皮细胞增殖的抑制作用(3H-TdR掺入率41%)较同剂量急性给药强(3H-TdR掺入率65%)，两者差异有显著意义。与假饲大鼠血清(3H-TdR掺入率96%，正常培养液对照100%，P<0.05)比较。无论在急性或慢性给药后获得的大鼠血清对细胞增殖均呈抑制作用。
4.大黄素纯品对细胞增殖的直接影响：以不同剂量大黄素纯品加入96孔培养板细胞培养液中注意pH，渗透压等培养条件严格对照，发现大黄素25μg/ml时即对细胞增殖出现明显抑制作用(3H-TdR掺入率为65±10%，P<0.01)以后随剂量的增加而增加(图4)。
图4 大黄素纯品对细胞增殖的直接影响
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5.大黄对细胞活性的影响：为了了解大黄对细胞增殖的抑制作用是否为直接毒杀细胞所致，服大黄后大鼠血清及大黄素纯品与细胞共育24小时后用台盼蓝染色观察细胞活性，结果加大黄对细胞活性没有影响，阳性着色率与对照组无明显差异。
讨 论
目前，肾小管细胞培养已广泛应用于肾脏生理、病理、细胞生物学等方面的研究，由于培养细胞、特别是原代培养细胞的某些性状同体内条件基本相似〔4〕，因而本实验在国内建立和应用这一技术以观察大黄对肾小管细胞增殖的影响，以求比较真实地反映大黄体内作用的某些机理。
中药大黄具有各种不同的药理效应。据研究，大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素和大黄酸等5种蒽醌衍生物是体内的活性成分〔5〕。大鼠喂饲大黄后4～8小时血中活性浓度达高峰，此时活性成分主要分布在肾、肝和胆囊〔6〕。本实验发现：灌服大黄的大鼠血清对肾小管细胞增殖的抑制使用以服药后6小时最为明显，而大黄生物活性成分——大黄素纯品直接加入肾小管细胞培养液中对细胞增殖的抑制使用也很强烈，应用台盼蓝染色证明这两种情况下细胞仍存活，因此药物对细胞增殖的影响均非直接杀伤作用。服药后大黄血清对细胞增殖的抑制是大黄活性成分本身在分子水平上作用的结果。有报道大黄的抗菌、抗肿瘤作用与其活性物质抑制细胞呼吸、抑制氨基酸和糖代射中间产物的氧化和脱氢、抑制DNA、RNA和蛋白质生物合成等有关〔7〕，大黄对肾小管上皮细胞增殖的抑制是否由于上述机制或另有其它途径尚待阐明。
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从急、慢性给药的结果比较看，长期口服大黄后血清对肾小管上皮细胞的抑制较单剂量一次给药强，可能意味着大黄在体内的积蓄作用。
目前认为，在慢性肾功能衰竭的发生与发展过程中，肾小管并不是处于被动的代偿性适应以及单纯受损状态，而是积极参与了肾功能持续减退的发展过程。体内、外对比研究残余肾的细胞生物学表明，大量肾单位减少后残余肾的细胞生物学表明，大量肾单位减少于残余肾肾小管细胞发生了一系列结构及功能变化，其中包括肾小管细胞肥大、细胞更新速度加快(生理条件下每天约需更新2×106个细胞)等结构改变和肾小管细胞氧耗增加，代谢活跃等功能改变，使得残余肾单位很快因高负荷遭受新的损伤，最后导致肾功能进一步恶化。应用大黄可抑制肾小管细胞肥大、增殖，缓解细胞的高代谢状态，从而延缓慢性肾功能不全的进展。这可能是大黄治疗慢性肾衰重要的机理之一。细胞代谢分析、离体器官灌注和整体动物实验观察大黄对慢性肾衰肾小管功能和病理形态改变的影响，初步证明了这一点〔8〕。
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参考文献
1 Zhang JH,Lis LI.Clinical effects of Rheum and Captopril on preventing progression of chronic renal failure.Chinese Med J,1990,103:788.
2 Taub M.Kidney cell cultures in hormonally defined serum free medium.In Mather JP eds.Mammalian cell culture,New York,1985,139.
3 Detrisac CJ,Sens MA,Carvin AJ,et al.Tissure culture of human kidney epithelial cells of proximal origin.Kid Int,1984,25:383.
, 百拇医药
4 Tannen RL,Tang MJ,Sahai A.Phenotypic characteristic of cultured proximal tubular epithelium.In Davison AM eds.London:Nephrology,1988,384.
5 西冈五夫.大黄的生物活性及有效成份.国外医学中医中药分册，1986，155：27.
6 陈琼华.大黄的实验研究和临床应用.新医学杂志，1974，5：34.
7 焦东海，蒋小维，阮宜吾.单味大黄研究的新进展.实际用中西医结合杂志，1989，2：32.
8 黎磊石，刘志红，张景红，等.大黄延缓慢性肾衰的临床及实验研究.中国中西医结合杂志，1991，11：392.
(收稿：1992-05-18 修回：1993-02-23), 百拇医药
单位：210002 南京金陵医院全军肾病中心
关键词：大黄；肾小管；细胞培养
中华医学杂志930608 摘要 在建立体外肾小管细胞培养的基础上，以3H-TdR掺入量为指标，观察大黄对肾小管细胞增殖的影响。结果发现：(1)服大黄的大鼠的血清加入肾小管细胞培养液中可抑制细胞增殖，抑制作用随大鼠服药剂量增加和时间延长而相应增加。(2)将大黄的生物活性成份大黄素纯品直接加入肾小管细胞培养液中亦可抑制细胞增殖。大黄抑制肾小管细胞增殖可能是其治疗慢性肾功能衰竭的机现。
我们以往的观察已证实，中药大黄对于延缓慢性肾功能不全的进展具有良好的效果〔1〕。但其具体作用机制还不十分明了。鉴于肾小管在慢性肾功能不全的发生、发展中具有重要作用，本实验采用体外肾小管细胞培养的方法，观察大黄对肾小管细胞增殖的影响，以探索其作用机制。
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材料和方法
1.动物：幼年SD大鼠，60～80g，雌雄不限。
2.细胞培养液LRPMI 1640加L-谷氨酰胺2mmol/L加青、链霉素各100U/ml加10%灭活的小牛血清，pH用HEPEs缓冲液(25mmol/L)及NaHCO3调至7.5左右。渗透压285mOsm/kg。
3.大黄、3H-TdT：大黄醇提膏、大黄素纯品(纯度>90%)由中国医科大学陈琼华教授提供。大黄素纯品需加碱方可溶解。取大黄素0.1加0.1mol/L NaoH 2ml，1640稀释至10ml，pH7.9。以不同剂量加入96孔细胞培养板后，pH7.7，渗透压290mOsm/kg，因肾小管体外细胞培养条件本身以pH7.5为佳〔2〕，而设立NaOH为对照。3H-TdR购自中国原子能研究所。
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4.肾小管细胞培养：采用机械网筛滤过的方法。无菌条件下摘除大鼠肾脏，取皮质剪碎，研磨后依次通过280μm、150μm、98μm网筛，洗下98μm网筛面上肾小管，再次滤过98μm，加压冲洗，最后收获肾小管。经1640漂洗，镜检肾小管纯度>90%后，将其置入含10%小牛血清的1640培养液中，放入37℃，5%CO2孵箱中培养，约3天贴壁，第4天见上皮样细胞环绕肾小管层层向外生长，第7天细胞基本铺满培养瓶。
5.肾小管上皮细胞增殖测定：原代培养第6天肾小管上皮细胞，经0.01%胰蛋白酶消化，用含10%小牛血清的1640培养液调整细胞密度至1×105ml，以每孔100μl加入96孔培养板，培养24小时，细胞完全贴壁后，吸除培养液，加入100μl含25%待测样品或血清的1640培养液(每份样品设4个复孔)，24小时后加入2H-TdR0.5Ci，继续培养24小时，收集细胞于49型玻璃纤维滤液上，经80℃烘干，置适量闪烁液中，以国产YST-F6型液闪器测定每份样品每分钟脉冲数(cpm)，为使各次实验数据能统一比较(实验重复6次)，实验结果以3J-TdR掺入率表示(实验组cpm值或实验对照组cpm值除以正常培养液对照组cpm值)。
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结 果
一、肾小管上皮细胞的鉴定
1.相关显微镜下形态学：镜下见上皮形态细胞层层环绕肾小管生长，有dome形成〔2〕，见图1。
图1 上皮形态细胞层层环绕肾小管生长,有dome形成
2.酶组织化学染色：根据肾组织细胞的特异性酶学分布〔3〕。用Gomoni法显示碱性磷酸酶，本实验培养细胞碱性磷酸酶染色均阳性，表明细胞来源于肾近端小管。
二、大黄对肾小管上皮细胞增殖的影响
采取体内、外对照的方法。“体内”以大黄醇提膏喂饲大鼠，取服药后大鼠血清稀释到25%浓度，加入96孔细胞培养板，观察其对细胞增殖的影响，并以假饲大鼠血清及培养用小牛血清作双重对照；“体外”将大黄素纯品直接加入培养液中。“体内外”实验后细胞均作活性染色。
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1.服药后不同时间血清对细胞增殖的影响：大鼠灌服大黄100mg/100g后不同时间采血，3小时标本对细胞增殖出现明显抑制作用，9小时最强(3H-TdR掺入率为38±10%P<0.01)，12小时开始减弱(图2)。
图2 服大黄后不同时间血清对细胞增殖的影响
2.不同剂量服药后血清对细胞增殖的影响：大鼠灌服不同剂量大黄2周后采血，25mg灌服剂量即对细胞增殖出现明显抑制作用(3H-TdR掺入率65±99%，P<0.01)，随剂量增加抑制作用增强(图3)。
图3 服不同剂量大黄后血清对细胞增殖的影响
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3.急、慢性给药对细胞增殖的影响：大鼠急性给药后，继续灌服大黄100mg/100g每日一次，2周后采血，结果慢性给药对肾小管上皮细胞增殖的抑制作用(3H-TdR掺入率41%)较同剂量急性给药强(3H-TdR掺入率65%)，两者差异有显著意义。与假饲大鼠血清(3H-TdR掺入率96%，正常培养液对照100%，P<0.05)比较。无论在急性或慢性给药后获得的大鼠血清对细胞增殖均呈抑制作用。
4.大黄素纯品对细胞增殖的直接影响：以不同剂量大黄素纯品加入96孔培养板细胞培养液中注意pH，渗透压等培养条件严格对照，发现大黄素25μg/ml时即对细胞增殖出现明显抑制作用(3H-TdR掺入率为65±10%，P<0.01)以后随剂量的增加而增加(图4)。
图4 大黄素纯品对细胞增殖的直接影响
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5.大黄对细胞活性的影响：为了了解大黄对细胞增殖的抑制作用是否为直接毒杀细胞所致，服大黄后大鼠血清及大黄素纯品与细胞共育24小时后用台盼蓝染色观察细胞活性，结果加大黄对细胞活性没有影响，阳性着色率与对照组无明显差异。
讨 论
目前，肾小管细胞培养已广泛应用于肾脏生理、病理、细胞生物学等方面的研究，由于培养细胞、特别是原代培养细胞的某些性状同体内条件基本相似〔4〕，因而本实验在国内建立和应用这一技术以观察大黄对肾小管细胞增殖的影响，以求比较真实地反映大黄体内作用的某些机理。
中药大黄具有各种不同的药理效应。据研究，大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素和大黄酸等5种蒽醌衍生物是体内的活性成分〔5〕。大鼠喂饲大黄后4～8小时血中活性浓度达高峰，此时活性成分主要分布在肾、肝和胆囊〔6〕。本实验发现：灌服大黄的大鼠血清对肾小管细胞增殖的抑制使用以服药后6小时最为明显，而大黄生物活性成分——大黄素纯品直接加入肾小管细胞培养液中对细胞增殖的抑制使用也很强烈，应用台盼蓝染色证明这两种情况下细胞仍存活，因此药物对细胞增殖的影响均非直接杀伤作用。服药后大黄血清对细胞增殖的抑制是大黄活性成分本身在分子水平上作用的结果。有报道大黄的抗菌、抗肿瘤作用与其活性物质抑制细胞呼吸、抑制氨基酸和糖代射中间产物的氧化和脱氢、抑制DNA、RNA和蛋白质生物合成等有关〔7〕，大黄对肾小管上皮细胞增殖的抑制是否由于上述机制或另有其它途径尚待阐明。
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从急、慢性给药的结果比较看，长期口服大黄后血清对肾小管上皮细胞的抑制较单剂量一次给药强，可能意味着大黄在体内的积蓄作用。
目前认为，在慢性肾功能衰竭的发生与发展过程中，肾小管并不是处于被动的代偿性适应以及单纯受损状态，而是积极参与了肾功能持续减退的发展过程。体内、外对比研究残余肾的细胞生物学表明，大量肾单位减少后残余肾的细胞生物学表明，大量肾单位减少于残余肾肾小管细胞发生了一系列结构及功能变化，其中包括肾小管细胞肥大、细胞更新速度加快(生理条件下每天约需更新2×106个细胞)等结构改变和肾小管细胞氧耗增加，代谢活跃等功能改变，使得残余肾单位很快因高负荷遭受新的损伤，最后导致肾功能进一步恶化。应用大黄可抑制肾小管细胞肥大、增殖，缓解细胞的高代谢状态，从而延缓慢性肾功能不全的进展。这可能是大黄治疗慢性肾衰重要的机理之一。细胞代谢分析、离体器官灌注和整体动物实验观察大黄对慢性肾衰肾小管功能和病理形态改变的影响，初步证明了这一点〔8〕。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Zhang JH,Lis LI.Clinical effects of Rheum and Captopril on preventing progression of chronic renal failure.Chinese Med J,1990,103:788.
2 Taub M.Kidney cell cultures in hormonally defined serum free medium.In Mather JP eds.Mammalian cell culture,New York,1985,139.
3 Detrisac CJ,Sens MA,Carvin AJ,et al.Tissure culture of human kidney epithelial cells of proximal origin.Kid Int,1984,25:383.
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4 Tannen RL,Tang MJ,Sahai A.Phenotypic characteristic of cultured proximal tubular epithelium.In Davison AM eds.London:Nephrology,1988,384.
5 西冈五夫.大黄的生物活性及有效成份.国外医学中医中药分册，1986，155：27.
6 陈琼华.大黄的实验研究和临床应用.新医学杂志，1974，5：34.
7 焦东海，蒋小维，阮宜吾.单味大黄研究的新进展.实际用中西医结合杂志，1989，2：32.
8 黎磊石，刘志红，张景红，等.大黄延缓慢性肾衰的临床及实验研究.中国中西医结合杂志，1991，11：392.
(收稿：1992-05-18 修回：1993-02-23), 百拇医药