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编号:10226470
基因重排分析在淋巴瘤诊断中的应用
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 1993年第8期
     作者:张建中 晏良遂 白 炎 牛元晓 王建安 郑建强 马民慧 沈倍奋

    单位:630038重庆第三军医大学(张建中(研究生,现在中国人民解放军北京五一四医院,邮政编码100101)、晏良遂),军事医学科学院(白 炎、朱元晓、郑建强、王建安、沈倍奋),河南医科大学(马民慧)

    关键词:淋巴瘤,非何杰金氏;基因重排;聚合酶链反应

    中华医学杂志930806 摘要 应用Sorthern blot分析了31例非何杰金氏淋巴瘤(NHL)抗原受体的基因重排。结果显示,30例出现IgH和/或Igk和/或TCRβ基因克隆性重排,2例出现IgH和TCRβ基因双重排,3例免疫表型不能分类的肿瘤均出现IgH/Igk基因重排;而反应性淋巴组织增生时则上述基因呈胚系状态。聚合酶反应(PCR)分析显示,77%B-NHL出现IgH基因克隆性重排条带,91%T-NHL出现TCRγ基因重排条带。本组结果提示,抗原受体基因重排是确立NHL克隆性和细胞源性的敏感而可靠的标记,是对淋巴瘤形态学诊断和免疫表型分析的重要补充。
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    目前,非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的病理学诊断和分型仍存在许多困难[1~3]。我们采用分子生物学技术分析了免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因克隆性重排,以探讨其在NHL诊断现鉴别诊断中的实际价值。

    材料与方法

    一、标本

    38例患者的新鲜组织,其中NHL27例、反应性淋巴组织增生(RH)11例。石蜡包坦组织:NHL51例、RH10例,经形态学和ABC法免疫表型分析,按1985年成都全国淋巴瘤协作组的标准进行分类。细胞系:白血病/淋巴瘤细胞系Jurkat、Molt-4、JM-1、Raji、Nalm-6以及3T3细胞等作为对照。

    二、DNA提取

    新鲜组织DNA按常规方法提取,并增加蛋白酶K浓度至200~500μg/ml、十二烷基硫酸钠2%,延长孵育时间12~20小时,以期提高DNA纯度。石蜡包埋组织DNA的提取参考Drbeau方法并略作改良。
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    三、探针的制备

    重组质粒pTβ、HuJH和HuCk分别由英国ICRF实验室和哈佛大学Leder博士惠赠。重组质粒经转化、扩增、提取和酶切等步骤,用32P和随机引物法标记DNA探针。

    四、Southern印迹杂交

    提纯DNA8~10μg经BanHI、EcoRI和Hind Ⅲ消化,电泳分离酶切片段并转移至硝酸纤维膜上,然后加标记探针在42℃下进行杂交和放射自显影分析。

    五、聚合酶链反应(PCR)

    Ig重链基因引物FR3A(V区)、LJH和VLJH(J区)以及TCRγ基因5个V区(V2~4,8,9)和3个J区引物序列根据文献[5,6]合成。IgH基因重排分析采用半重叠PCR:第一轮引物用FR3A和LJH,乾地30个周期循环,扩增产物经1:1000稀释后,改用FR3A和VLJH引物进行第二轮20个周期扩增。TCRγ基因扩增采用45个周期一轮混合引物PCR。取10μlPCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察。
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    结 果

    一、淋巴瘤免疫表型见表1。

    表1 NHL免疫表现分析(例数) 标本

    T细胞

    B细胞

    组织细胞

    不能分类

    新鲜

    13

    11

    0

    3

    石蜡
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    16

    24

    1

    10

    合计

    29

    35

    1

    13

    二、提取DNA质量及酶切鉴定

    新鲜组织和细胞系提取的DNA,其吸光度260/280比值为1.8~2.0,分子量在50kb以上,无降解。酶切后呈均匀连续涂片状,酶切带头平。石蜡包埋组织提取的DNA大部分有明显降解,仅11例提取DNA大于30kb,酶切效果好。
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    三、TCRβ、IgH和Igk基因的胚系构型(germline)

    TCRβ基因胚系构型在BamHI酶切下为22.6kb,EcoRI酶切为10.5kb和3.7kb,HindⅢ酶切为8.0和3.0kb;IgH胚系基因在BamHI、EcoRI和HindⅢ酶切下,其片段长度分别为17kb、16kb、11kb;Igk胚系基因12kb片段只能在EcoRI酶切时显示。3T3细胞、胎盘组织和RH之抗原受体基因均为胚系构型。

    四、NHL基因重排分析

    上述胚胎基因以外的新带出现或原胚系条带的缺失均意味着该基因发生了重排。27例新鲜NHL标本中,除1例为胚胎构型外,其余均在BamH1、EcoRI或HindⅢ酶切下出现一条或两条以上的TCRβ和/或IgH和/或Ig基因重排带或胚胎条带的缺失,其中TCRβ和/或IgH基因的重排检出率为93%(25/27).(1)T-NHL:13例T细胞免疫表型的肿瘤中,有11例显示TCRβ基因重排(图1),2例为TCRβ胚系构型。(2)B-NHL:11例B细胞表型NHL中,有10例出现IgH基因重排(图2),其中6例同时伴有Igk基因重排;1例仅见Igk基因重排。此外,3例免疫表型不能分类的NHL增多显示IgH和/或Igk基因重排;2例T-NHL出现TCRβ和IgH基因双重排;1例淋巴组织不典型增生检出TCRβ基因重排。7例石蜡包埋组织NHL中,有4例检出TCRβ基因重排,3例有IgH/Igk基因重排。
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    BamHI酶切,Southern blot杂交。图示第2、3、6、7、8、9、11、12道出现TCRβ基因重排,第1道为3T3细胞对照。

    图1 淋巴瘤中TCRβ基因重排分析放射自显影图

    BamHI酶切,Southern blot杂交。图示第1、5、7、8、9道出现IgH基因重排,P为胎盘DNA对照。

    图2 NHL中IgH基因重排分析放射自显影图

    五、PCR扩增IgH和TCRγ基因克隆性重排片段

    1.IgH基因:阳性扩增条带为100~120bp。经Southern印迹杂交检出IgH基因重排的13例NHL新鲜标本中,10例出现单克隆性扩增条带(图3)。15例B-NHL石蜡包埋组织中有11例扩增出阳性条带。T-NHL未见阳性条带。大多数淋巴组织RH呈浅淡的弥漫带,但有1例眶内淋巴组织增生(假性淋巴瘤)出现克隆性条带。
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    图示1、2道为B-NHL阳性扩增条带,8道为nalm-6细胞

    阳性对照,5道为pBR322/HaeIII分子量标记

    图3 PCR扩增IgH基因重排电泳图

    2.TCRγ基因:该基因重排的阳性扩增条带在170~230bp之间,一般为1~2条。11例T-NHL新鲜组织中有10例、13例石蜡标本中有11例可见阳性克隆性条带。B-NHL中亦有3例为阳性。血管免疫母细胞性淋巴腺病及淋巴组织不典型增生各1例亦可见克隆性扩增条带(表2)。

    表2 PCR扩增Ig和TCR基因重排(阳性例数/总例数) 标本

    B-NHL

    T-NHL

, 百拇医药     淋巴组织增生

    非淋巴性肿瘤

    IgH基因重排

    新鲜标本

    10/13

    0/11

    0/8

    0/2

    石蜡标本

    11/15

    0/13

    1/9

    0/5
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    TCRγ基因重排

    新鲜标本

    2/13

    10/11

    0/8

    0/2

    石蜡标本

    1/15

    11/13

    2/9

    0/5

    讨 论

    淋巴细胞在分化过程中,Ig和TCR基因不断发生有序的重排,使散在的各基因片段连接成能够表达的V-D-J基因。多克隆性淋巴组织增生时,抗原受体基因结构是高度不均一的,即每一克隆选择的重排位点和片段长度各不相同,无单一优势克隆;而淋巴瘤为单克隆性增生,组成细胞在基因构型上具有高度的一致性。这种优势克隆细胞数量只要超过1%,即可用Southern印迹杂交和PCR检测出特异性抗原受体基因的重排[2,5]。本研究结果表明,对于绝大多数T和B细胞肿瘤,Ig和TCR基因重排的检出具有重要诊断价值。27例NHL新鲜标本中Ig和/或TCR基因重排的检出率高达95%以上,而10例RH未检出上述基因重排,提示基因重排分析是确定肿瘤单克隆性增生的极敏感的指标之一。11例B细胞性NHL均检出Ig基因重排,而13例T细胞性NHL有11例检出TCR基因重排;3例免疫组化不能分类的NHL均显示Ig基因重排,提示B细胞源性。说明基因重排分析对确定肿瘤细胞的来源亦很有帮助,而且优于免疫组化的方法。
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    对于大多数B-NHL,Ig轻链表达的限制性即可确立诊断,而再做基因分型显得临床价值不大。但是,基因重排分析对于确定下列病变的克隆性具有重要价值:(1)淋巴组织不典型和弥漫性增生(特别是结外部位)与早期淋巴瘤的区别。本组病例中有2例结外淋巴组织增生,出现IgH基因克隆性重排,随访提示为恶性肿瘤。因此,基因重排分析有助于这部分早期病变的发现。(2)缺乏音一轻链限制性表达的肿瘤。我们发现确有相当数量的B-NHL不能显示Ig轻链的限制性表达,特别是缺乏新鲜组织的病例。(3)T细胞优势性B-NHL。我们曾遇到1例免疫标记显示T细胞占优势,而出现IgH基因克隆性重排,提示了肿瘤的B细胞源性。

    T细胞性NHL在我国高发,本组资料从基因水平上也证实了这一点。T-NHL在免疫表型上缺乏确切的克隆性标记,而基因构型上亦在明显的异质性[3,7],故对此类肿瘤均有必要进行基因重排分析。但文献报告[8]和本研究发现确有少数T-NHL为TCRβ或γ基因胚系构型。最近研究提示,TCRσ基因可先于αβ链基因在T细胞早期阶段即发生重排[9,10]。因此,TCRσ基因分析可能有助于对T细胞肿瘤的深入理解。
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    由于Southern印迹杂交技术相对烦杂,耗资费时,而且需要大量高质量DNA和同位素,从而使其在临床上的实用价值受限。与之相比,PCR技术较简便快速,不需同位素,可用细胞学标本和固定组织等多种材料。因此,PCR在NHL基因重排分析中更具有实用性。但是,由于淋巴瘤本身的复杂性,决定了进行多指标综合研究的必要性。基因重排分析不能作为排除诊断的唯一标准,对于某些复杂的病例,详尽的免疫表型分析乃至形态学研究仍不失为重要的诊断手段。

    本研究承蒙史景泉、程天民、陈意生、朱梅刚、和严庆汉的指导和帮助,张哉根、柳凤轩等协助收集标本,特此致谢

    注:本课题为国家自然科学基金资助项目

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    (收稿:1992-09-21 修回:1993-05-23), 百拇医药