胆汁清除超氧自由基的能力及其与胆色素结石形成的关系
作者：林 丛 沈 韬 傅贤波 周孝思
单位：100083 北京医科大学第三医院外科
关键词：胆结石；氧自由基；胆管阻塞
中华医学杂志930910 摘要 为了研究活性氧自由基在胆色素结石形成过程中的作用及维生素E、C预防结石的机理，采用以胆总管不全狭窄的方法制备的豚鼠胆色素结石动物模型进行了观察。手术结扎致胆总管狭窄1周后的豚鼠其胆色素结石成石率(14/16)，明显高于在胆管狭窄基础上，又腹腔注射维生素E和维生素C的用药组(5/14)和对照组(0/15)(均P<0.01)；而胆汁对超氧自由基的清除率却显著低于后两组(均P<0.05)；狭窄组和用药组胆汁中非结石胆红素(UCB)和Ca2+浓度均显著高于对照组(P均分别<0.05和0.01)，而前两组之间则差异无显著意义(均P>0.05)。提示胆道梗阻诱发胆色素结石的过程，除与胆汁中UCB和(UCB)和Ca2+浓度升高有关外，可能还需要氧自由基的参与
, 百拇医药
已知胆色素结石中含有较多的胆红素化合物，自由基可引发聚合反应，在胆色素结石中能检测出自由基信号，胆道梗阻可导致胆色素结石形成和氧自由基反应增强〔1〕。上述结果提示氧自由基可能与胆色素结石形成有关。我们用胆总管不全狭窄诱发豚鼠胆色素结石模型，研究活性氧自由基在胆色素结石形成过程中的作用以及维生素(Vit)E、C预防结石的机理。
材料和方法
一、实验分组
体重300～700g雄性豚鼠共45只，随机分为3组：(1)对照组(C)，共15只，仅开腹，不做胆总管不全狭窄术。于术前3天～术后1周每天腹腔内注入注射用水0.3ml/kg作对照剂；(2)狭窄组(S)，共16只，手术造成胆总管不全狭窄〔1〕，注射对照剂同C组；(3)狭窄加 VitE、C组(S+V)，共14只，术式同S组，于术前3天～术后1周每天腹腔内注射VitE、C各10mg/kg。
, 百拇医药
二、标本收集及其成分测定
术后1周时，禁食12小时，以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后剖腹。抽尽胆囊胆汁并记量，混匀后立即测定Ca2+浓度〔2〕；3 000r/min离心15分钟后取上清液测定总胆红素(TBr)、间接胆红素(IBr)浓度，以IBr代表非结合胆红素(UCB)，并测定胆汁对外源性超氧自由基(O-2)的清除率(SR)〔3，4〕。根据黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下，生成外源性
，作用于羟胺，生成亚硝酸盐(
)。加水的对照管(W)不含自由基清除剂，生成的为100%；加胆汁的样品管(B)由于部分被清除，生成的将减少。与对氨基苯磺酸和α-萘胺作用，生成重氮化合物，用751G型分光光度计测定其吸光度。以W和B管中生成的量计算SR。SR=(W-B)/W×100%。此外，直尺测量狭窄上方胆总管周长，观察胆囊及胆总管大体形态变化及成石情况。
, 百拇医药
结 果
一、胆总管不全梗阻形成的标志
胆囊容积：C组为1.5±0.6ml(
±s，下同)，S组为5.7±3.1ml，两者差异有显著意义(t=-4.990,P<0.01)；S+V组为7.0±1.9ml，与C组相比差异有显著意义(t=-10.485，P<0.01)。胆总管周长：C组
为0.4±0.1cm，S组为1.2±0.2cm，两者差异有显著意义(t=-13.170，P<0.01)；S+V组为1.1±0.2cm，与C组相比差异有显著意义(t=-14-473，P<0.01)。结扎胆总管在S组和S+V组均可造成梗阻，致使梗阻上方胆管极度扩张，胆囊明显增大。而结扎处胆管未完全闭塞，因此梗阻为不完全性。
二、成石标准及成石率
, 百拇医药
成石标准：肉眼观察胆囊和肝内、外胆管内及胆汁，如有成形的颗粒状物出现，便判为有结石形成(胆泥不算其内)。成石率C组无胆石形成，S组为88%(14/16)，显著高于C组(P<0.01，精确概率法，下同)；S+V组为36%(5/14)，明显低于S组(P<0.01)，而高于C组(P<0.05)。S组结石普遍比S+V组结石多且大，S组结石的直径约0.1～0.3cm，S+V组则在0.1cm以下。
三、胆囊胆汁成分测定(附表)
附表 胆囊胆汁成分测定结果(±s) 组别
Ca2+(10-5mol/L)
TBr(μmol/L)
, 百拇医药 UCB(μmol/L)
O-2(μmol/L)
C
28±11(11)
14±8(7)
5±3(7)
94±5(9)
S
77±44(16)
41±30(16)
13±9(16)
68±31(14)
, 百拇医药
S+V
72±30(14)
69±40(13)
17±12(13)
92±8(14)
S与C比较
t
-3.537
-2.301
-2.106
2.475
P
, 百拇医药 <0.01
<0.05
<0.05
<0.05
S与S+V 比较
t
0.315
-2.165
-1.124
-2.772
P
>0.05
<0.05
, 百拇医药
>0.05
<0.05
讨 论
在本实验中，S组胆汁中的Ca2+和UCB浓度都显著高于C组，同时，S组的成石率也显著增高，这些结果均可用文献[2]提出的关于胆色素结石成因的胆红素钙沉积-溶解平衡学说来解释。即：UCB和Ca2+中任何一者的浓度升高都能使两者的乘积增大，一旦超过其条件溶度积常数(K′sp)，将导致胆红素钙沉淀生成，反之可防沉淀生成。但是，S+V组的成石率显著低于S组，而两组间胆汁中Ca2+和 UCB 浓度却没有显著差异(附表)，S+V组的TBr(可水解成UCB)浓度反而更高(附表)，此实验结果无法简单地用胆红素钙的平衡学说来解释。值得注意的是，S组与C组相比，在胆管狭窄引起S组的成石率升高的同时，胆汁中SR显著降低；而S+V组胆汁中的SR显著回升，其成石率也由88%降至36%。胆管狭窄时胆汁中SR降低，可能是胆汁中因胆管狭窄而增多，消耗了清除活力的结果。增多后，必然要导致羟自由基(OH)生成。根据刘湘陶等〔5〕试管内实验结果，在胆酸钠存在的条件下，经、OH处理后的胆红素与Ca2+相互作用，生成胆红素钙的反应速度加快，条件溶度积减小，沉淀更易形成，沉淀颗粒也有所增大，且变化程度与不 处自由基源处理后的自旋浓度(即单位质量的胆红素在电子自旋共振波谱中自由基信号的强弱)高度平行。因此，认为氧自由基促进了胆红素钙沉淀的形成和聚集，从而有利于胆色素结石形成。本实验中，S+V组的成石率明显降低，可能是由于VitE、C增强了胆汁清除自由基的能力，因而有可能及时清除胆管狭窄时所增多的、OH，阻止了氧自由基对胆红素C钙沉淀过程和聚集过程的促进作用。因此，其胆汁中UCB和a2+浓度虽高却不易沉淀成石；S组则相反。由此可见，氧自由基也是通过对胆红素钙的沉淀-溶解平衡这一中心环节的影响而对胆色素结石的形成发挥其作用的，只不过它对这个平衡的影响，主要不在于增减UCB或Ca2+的浓度，而在于改变达到平衡的条件和反应速度。即：它使沉淀反应的速度更快，条件溶度积变小，更容易沉淀，沉淀颗粒更大。
, http://www.100md.com
此外，氧自由基还可能通过对糖蛋白的作用而促进成石。糖蛋白与胆红素钙结合成三元络合物，从而有利于胆色素结石形成。徐智等〔1〕实验的狭窄组和对照组分别与本实验的S组和C组条件完全相同，他曾测定过胆囊胆汁中糖蛋白含量，狭窄组比对照组明显增多。Hale等〔6〕用组织培养实验证明，氧自由基，尤其OH可促进胆囊上皮分泌的糖蛋白增多。联系到本实验的结果，S组胆汁的SR明显低于C组，反映体内不能被及时清除，可能是使其糖蛋白含量增高的原因之一；S+V组对的清除率高于S组，提示S+V组的、OH可被及时清除，进而有可能减少糖蛋白的分泌量，使得生成的胆红素钙不易凝聚成石。因此，S+V组的成石率比S组低，还可能与通过清除氧自由基而抑制糖蛋白的分泌有关。
, http://www.100md.com
本实验初步证实 VitE和VitC是作为抗氧化剂而起到预防胆色素结石的作用的。这种认识，为成石机理研究和寻找其他抗氧化剂防石药物的工作开拓了新的领域。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 徐 智，张挽华，傅贤波，等.胆色素类结石成石和防石过程中豚鼠胆汁成分的改变.中华外科杂志，1990，28∶558.
2 傅贤波，周孝思，张挽华，等.胆红素钙的沉淀过程及胆汁酸盐对其的影响.中华外科杂志，1984，22∶166.
3 Elstner EF,Heupel A.Inhibition of nitrite formation hydroxylammonium chloride:a simple assay for superoxide dismutase. Anal Biochem,1976,70∶616.
, 百拇医药
4 Oyanagui Y.Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity.Anal Biochem,1984,142∶290.
5 刘湘陶，唐 斌，王 ，胆酸钠存在下经自由基处理后的胆红素与钙离子相互作用的研究.北京医科大学学报.1990,22∶285.
6 Hale WB,Turner B,Lamont JT.Oxygen radicals stimulate guinea pig gallbladder glycoprotein secretion in vitro.Am J Physiol,1987,253∶627.
(收稿：1993-02-22 修回：1993-06.02), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学第三医院外科
关键词：胆结石；氧自由基；胆管阻塞
中华医学杂志930910 摘要 为了研究活性氧自由基在胆色素结石形成过程中的作用及维生素E、C预防结石的机理，采用以胆总管不全狭窄的方法制备的豚鼠胆色素结石动物模型进行了观察。手术结扎致胆总管狭窄1周后的豚鼠其胆色素结石成石率(14/16)，明显高于在胆管狭窄基础上，又腹腔注射维生素E和维生素C的用药组(5/14)和对照组(0/15)(均P<0.01)；而胆汁对超氧自由基的清除率却显著低于后两组(均P<0.05)；狭窄组和用药组胆汁中非结石胆红素(UCB)和Ca2+浓度均显著高于对照组(P均分别<0.05和0.01)，而前两组之间则差异无显著意义(均P>0.05)。提示胆道梗阻诱发胆色素结石的过程，除与胆汁中UCB和(UCB)和Ca2+浓度升高有关外，可能还需要氧自由基的参与
, 百拇医药
已知胆色素结石中含有较多的胆红素化合物，自由基可引发聚合反应，在胆色素结石中能检测出自由基信号，胆道梗阻可导致胆色素结石形成和氧自由基反应增强〔1〕。上述结果提示氧自由基可能与胆色素结石形成有关。我们用胆总管不全狭窄诱发豚鼠胆色素结石模型，研究活性氧自由基在胆色素结石形成过程中的作用以及维生素(Vit)E、C预防结石的机理。
材料和方法
一、实验分组
体重300～700g雄性豚鼠共45只，随机分为3组：(1)对照组(C)，共15只，仅开腹，不做胆总管不全狭窄术。于术前3天～术后1周每天腹腔内注入注射用水0.3ml/kg作对照剂；(2)狭窄组(S)，共16只，手术造成胆总管不全狭窄〔1〕，注射对照剂同C组；(3)狭窄加 VitE、C组(S+V)，共14只，术式同S组，于术前3天～术后1周每天腹腔内注射VitE、C各10mg/kg。
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二、标本收集及其成分测定
术后1周时，禁食12小时，以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后剖腹。抽尽胆囊胆汁并记量，混匀后立即测定Ca2+浓度〔2〕；3 000r/min离心15分钟后取上清液测定总胆红素(TBr)、间接胆红素(IBr)浓度，以IBr代表非结合胆红素(UCB)，并测定胆汁对外源性超氧自由基(O-2)的清除率(SR)〔3，4〕。根据黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下，生成外源性
，作用于羟胺，生成亚硝酸盐()。加水的对照管(W)不含自由基清除剂，生成的为100%；加胆汁的样品管(B)由于部分被清除，生成的将减少。与对氨基苯磺酸和α-萘胺作用，生成重氮化合物，用751G型分光光度计测定其吸光度。以W和B管中生成的量计算SR。SR=(W-B)/W×100%。此外，直尺测量狭窄上方胆总管周长，观察胆囊及胆总管大体形态变化及成石情况。, 百拇医药
结 果
一、胆总管不全梗阻形成的标志
胆囊容积：C组为1.5±0.6ml(
±s，下同)，S组为5.7±3.1ml，两者差异有显著意义(t=-4.990,P<0.01)；S+V组为7.0±1.9ml，与C组相比差异有显著意义(t=-10.485，P<0.01)。胆总管周长：C组为0.4±0.1cm，S组为1.2±0.2cm，两者差异有显著意义(t=-13.170，P<0.01)；S+V组为1.1±0.2cm，与C组相比差异有显著意义(t=-14-473，P<0.01)。结扎胆总管在S组和S+V组均可造成梗阻，致使梗阻上方胆管极度扩张，胆囊明显增大。而结扎处胆管未完全闭塞，因此梗阻为不完全性。
二、成石标准及成石率
, 百拇医药
成石标准：肉眼观察胆囊和肝内、外胆管内及胆汁，如有成形的颗粒状物出现，便判为有结石形成(胆泥不算其内)。成石率C组无胆石形成，S组为88%(14/16)，显著高于C组(P<0.01，精确概率法，下同)；S+V组为36%(5/14)，明显低于S组(P<0.01)，而高于C组(P<0.05)。S组结石普遍比S+V组结石多且大，S组结石的直径约0.1～0.3cm，S+V组则在0.1cm以下。
三、胆囊胆汁成分测定(附表)
附表 胆囊胆汁成分测定结果(
±s) 组别Ca2+(10-5mol/L)
TBr(μmol/L)
, 百拇医药 UCB(μmol/L)
O-2(μmol/L)
C
28±11(11)
14±8(7)
5±3(7)
94±5(9)
S
77±44(16)
41±30(16)
13±9(16)
68±31(14)
, 百拇医药
S+V
72±30(14)
69±40(13)
17±12(13)
92±8(14)
S与C比较
t
-3.537
-2.301
-2.106
2.475
P
, 百拇医药 <0.01
<0.05
<0.05
<0.05
S与S+V 比较
t
0.315
-2.165
-1.124
-2.772
P
>0.05
<0.05
, 百拇医药
>0.05
<0.05
讨 论
在本实验中，S组胆汁中的Ca2+和UCB浓度都显著高于C组，同时，S组的成石率也显著增高，这些结果均可用文献[2]提出的关于胆色素结石成因的胆红素钙沉积-溶解平衡学说来解释。即：UCB和Ca2+中任何一者的浓度升高都能使两者的乘积增大，一旦超过其条件溶度积常数(K′sp)，将导致胆红素钙沉淀生成，反之可防沉淀生成。但是，S+V组的成石率显著低于S组，而两组间胆汁中Ca2+和 UCB 浓度却没有显著差异(附表)，S+V组的TBr(可水解成UCB)浓度反而更高(附表)，此实验结果无法简单地用胆红素钙的平衡学说来解释。值得注意的是，S组与C组相比，在胆管狭窄引起S组的成石率升高的同时，胆汁中SR显著降低；而S+V组胆汁中的SR显著回升，其成石率也由88%降至36%。胆管狭窄时胆汁中SR降低，可能是胆汁中
因胆管狭窄而增多，消耗了清除活力的结果。增多后，必然要导致羟自由基(OH)生成。根据刘湘陶等〔5〕试管内实验结果，在胆酸钠存在的条件下，经、OH处理后的胆红素与Ca2+相互作用，生成胆红素钙的反应速度加快，条件溶度积减小，沉淀更易形成，沉淀颗粒也有所增大，且变化程度与不 处自由基源处理后的自旋浓度(即单位质量的胆红素在电子自旋共振波谱中自由基信号的强弱)高度平行。因此，认为氧自由基促进了胆红素钙沉淀的形成和聚集，从而有利于胆色素结石形成。本实验中，S+V组的成石率明显降低，可能是由于VitE、C增强了胆汁清除自由基的能力，因而有可能及时清除胆管狭窄时所增多的、OH，阻止了氧自由基对胆红素C钙沉淀过程和聚集过程的促进作用。因此，其胆汁中UCB和a2+浓度虽高却不易沉淀成石；S组则相反。由此可见，氧自由基也是通过对胆红素钙的沉淀-溶解平衡这一中心环节的影响而对胆色素结石的形成发挥其作用的，只不过它对这个平衡的影响，主要不在于增减UCB或Ca2+的浓度，而在于改变达到平衡的条件和反应速度。即：它使沉淀反应的速度更快，条件溶度积变小，更容易沉淀，沉淀颗粒更大。, http://www.100md.com
此外，氧自由基还可能通过对糖蛋白的作用而促进成石。糖蛋白与胆红素钙结合成三元络合物，从而有利于胆色素结石形成。徐智等〔1〕实验的狭窄组和对照组分别与本实验的S组和C组条件完全相同，他曾测定过胆囊胆汁中糖蛋白含量，狭窄组比对照组明显增多。Hale等〔6〕用组织培养实验证明，氧自由基，尤其OH可促进胆囊上皮分泌的糖蛋白增多。联系到本实验的结果，S组胆汁的SR明显低于C组，反映体内
不能被及时清除，可能是使其糖蛋白含量增高的原因之一；S+V组对的清除率高于S组，提示S+V组的、OH可被及时清除，进而有可能减少糖蛋白的分泌量，使得生成的胆红素钙不易凝聚成石。因此，S+V组的成石率比S组低，还可能与通过清除氧自由基而抑制糖蛋白的分泌有关。, http://www.100md.com
本实验初步证实 VitE和VitC是作为抗氧化剂而起到预防胆色素结石的作用的。这种认识，为成石机理研究和寻找其他抗氧化剂防石药物的工作开拓了新的领域。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 徐 智，张挽华，傅贤波，等.胆色素类结石成石和防石过程中豚鼠胆汁成分的改变.中华外科杂志，1990，28∶558.
2 傅贤波，周孝思，张挽华，等.胆红素钙的沉淀过程及胆汁酸盐对其的影响.中华外科杂志，1984，22∶166.
3 Elstner EF,Heupel A.Inhibition of nitrite formation hydroxylammonium chloride:a simple assay for superoxide dismutase. Anal Biochem,1976,70∶616.
, 百拇医药
4 Oyanagui Y.Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity.Anal Biochem,1984,142∶290.
5 刘湘陶，唐 斌，王 ，胆酸钠存在下经自由基处理后的胆红素与钙离子相互作用的研究.北京医科大学学报.1990,22∶285.
6 Hale WB,Turner B,Lamont JT.Oxygen radicals stimulate guinea pig gallbladder glycoprotein secretion in vitro.Am J Physiol,1987,253∶627.
(收稿：1993-02-22 修回：1993-06.02), http://www.100md.com