应用14对引物多重聚合酶链反应作假肥大肌营养不良症的产前基因诊断
作者：吴元清 孙念怙 吴玉珍 王凤云 宁 扬
单位：100730 北京协和医院
关键词：肌营养障碍；聚合酶链反应；染色体缺失；产前诊断
中华医学杂志930906 摘要 用14对引物作多重聚合酶链反应(PCR)对27例假肥大肌营养不良症患儿进行了产前基因检查。结果，发现缺失型为16例，缺失热点位于 exon43～exon52附近，这一部位的缺失往往影响了阅读框架，从而不翻译或仅翻译出部分不稳定的抗肌萎缩蛋白，导致假肥大肌营养不良发病。此外作者还用这14对引物 PCR 对22例高危孕妇进行了产前基因诊断。
假肥大肌营养不良症(DMD/BMD)的分子生物学研究近年来进展迅速，已知其基因位于Xp2.1，约2 400kb，有70个外显子。我们应用14对引物，两组多重 PCR，对27例患者作了 DNA 诊断，对其中 22 例高危胎儿作了产前诊断，现报道如下。
, 百拇医药
材料与方法
一、资料
我院门诊 DMD 发病患儿，共27例，均为男性，年龄5～11岁。临床病史典型并经血肌酐磷酸激酶(CRK)、肌电图及肌活检病理确诊。27例中22例患儿的母亲此时再次妊娠，孕8～20周，患儿母亲要求作产前诊断。
二、方法
取患儿血提取 DNA，进行第一组9对引物多重 PCR，如未见基因缺失者，再进行第二组5对引物 PCR，进一步检测是否为基因缺失型DMD/BMD。22例高危孕妇取早、中孕期绒毛或羊水细胞，培养得染色体，并提取 DNA 用Y3、4探针诊断胎儿性别，凡男胎均进行产前基因诊断。如先证者基因缺失阳性者，绒毛提取DNA 行多重 PCR；如亦为阳性病例，经胎肌病理核实后引产。对先证者为非缺失型者，则直接在胎儿镜下取胎肌做病理诊断。
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9对引物组包括：外显子(exon)4、8、12、17、19、44、45、48及51；5对引物组包括：Pm(Pm含全部启动子和1/4exon)、exon13、43、50及52，两组 14 对引物由美国 Baylor 医学研究院 Caskey 医生提供。
结 果
一、DMD患儿
27 例 DMD 患儿中9对引物 PCR 测得的缺失型病例为11例，占41%。缺失的部位集中在 exon45、exon48和exon51。其它16例再经5对引物 PCR 检测发现缺失型为5例，占19%，以 exon52 部位为主。总缺失型例数16例，占60%。
二、高危胎儿
22例高危胎儿中男性12例，女性 10例。12 例男性胎儿中，先证者为缺失型的6例，其对应的高危男胎用14对引物 PCR 诊断后4例有基因缺失，缺失部位与先证者相同，2例无基因缺失(图1～3)。阳性发现均由胎肌病理证实。对于另外6例非缺失型的先证者所对应的高危男性胎儿，我们做了胎儿镜下的胎肌活检，并进行胎肌病理诊断，发现1例为发病胎儿。
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图1的A5缺第3条带，A6缺第5条带，A7缺第1条带；图2A1和A3缺第1条带；图3A5缺第5条带，F3缺2,5条带，A4缺1,2,5条带
图1～3 两组多重 PCR 检出的先证者(A)及胎儿(F)的电泳带型
讨 论
Dunnen〔1〕用交变场电泳法可检测 DMD 基因缺失率为50%。Darras 等〔2〕1988年报告 DMD 基因缺失率最高达66%。曾溢涛等〔3〕用9对引物 PCR 测和 DMD 基因缺失率为52%。本组资料14对引物 PCR 测出 DMD 基因缺失率近60%，与国外报道相符。
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关于缺失热点，Kunkel等〔4〕认为有两个：(1)位于 cDNA1b 区即 pERT87/XJ 区域，占基因缺失型的28%；(2)位于 cDNA8 的部位即 JBir 和J66-H1区，占基因缺失型的51%。本组结果示基因缺失主要位于 exon43→exon52区域，即cDNA7～8区，占缺失型总数的94%，这与Kunkel观点基本一致。用9对引物 PCR 检测这一区域基因缺失率为41%，用5对引物 PCR 检测这一区域的基因缺失检出率为19%。由此看来5对引物 PCR 结果并未改变基因缺失的热点部位，只是通过热点区域内增加了5个 exon 部位的引物，使基因缺失检出率增加了5个。因此我们认为第二组5对引物是非常重要的。
DMD患儿有基因缺失时其缺失片段大小和部位常有明显不同。本组27例患儿中有13例仅缺失1个外显子，1例缺失2个外显子，2例缺失3个外显子(共16例缺失)，缺失部位各不相同，但这些病例在临床表现上没有明显差别，这说明病情轻重与基因缺失片段大小和部位无关。所以有学者认为病情轻重取决于基因缺失对阅读框架的影响。若基因缺失打断或改变阅读框架则产生典型的 DMD，若保持阅读框架则临床表现为 BMD。
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对于散发病例的产前诊断一直是人们的关注的问题。有人用单体型分析法进行产前诊断，但方法复杂，而需要有做为标记的多态性酶切位点，故相当困难。也有人认为散发病例的再发风险小，不是产前诊断的重点。本组22例产前诊断病例均为散发病例，患儿家长强烈要求作胎儿诊断。从产前诊断结果看，4例胎儿为基因缺失型，1例胎儿为非基因缺失型发病者(靠胎肌病理诊断)，说明 DMD 再发风险是高的。因此，我们认为用 PCR 法做产
前诊断尤其是对散发病例是可行的并有其优越性。此外，我们作胎肌病理检查证实了 PCR 诊断结果是可靠的，并为今后探索抗肌萎缩蛋白的组织化学改变提供了条件。
参考文献
1 Den Dunnen JT,Bakker E,Breteler EG,et al.Direct detection of more than 50% Duchenne musculer dystrophy mutations by field inversion gels.Nature,1987,329∶640.
, 百拇医药
2 Darras BT,Francke U.Normal human genomic restriction-fragment patterns and polymorphisms revealed by hybridization with the entire dystrophin cDNA.Am JHum Genet,1988,43∶612.
3 曾溢涛，陈美钰，任兆瑞，等.应用多重PCR扩增法快速诊断中国人 DMD 基因缺失.遗传与疾病，1991，8∶33.
4 Kunkel LM,Monaco AP,Middlesworth W,et al.Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male with an X chromosome deletion.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82∶4778.
(收稿：1992-07-20 修回：1993-05-05), 百拇医药
单位：100730 北京协和医院
关键词：肌营养障碍；聚合酶链反应；染色体缺失；产前诊断
中华医学杂志930906 摘要 用14对引物作多重聚合酶链反应(PCR)对27例假肥大肌营养不良症患儿进行了产前基因检查。结果，发现缺失型为16例，缺失热点位于 exon43～exon52附近，这一部位的缺失往往影响了阅读框架，从而不翻译或仅翻译出部分不稳定的抗肌萎缩蛋白，导致假肥大肌营养不良发病。此外作者还用这14对引物 PCR 对22例高危孕妇进行了产前基因诊断。
假肥大肌营养不良症(DMD/BMD)的分子生物学研究近年来进展迅速，已知其基因位于Xp2.1，约2 400kb，有70个外显子。我们应用14对引物，两组多重 PCR，对27例患者作了 DNA 诊断，对其中 22 例高危胎儿作了产前诊断，现报道如下。
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材料与方法
一、资料
我院门诊 DMD 发病患儿，共27例，均为男性，年龄5～11岁。临床病史典型并经血肌酐磷酸激酶(CRK)、肌电图及肌活检病理确诊。27例中22例患儿的母亲此时再次妊娠，孕8～20周，患儿母亲要求作产前诊断。
二、方法
取患儿血提取 DNA，进行第一组9对引物多重 PCR，如未见基因缺失者，再进行第二组5对引物 PCR，进一步检测是否为基因缺失型DMD/BMD。22例高危孕妇取早、中孕期绒毛或羊水细胞，培养得染色体，并提取 DNA 用Y3、4探针诊断胎儿性别，凡男胎均进行产前基因诊断。如先证者基因缺失阳性者，绒毛提取DNA 行多重 PCR；如亦为阳性病例，经胎肌病理核实后引产。对先证者为非缺失型者，则直接在胎儿镜下取胎肌做病理诊断。
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9对引物组包括：外显子(exon)4、8、12、17、19、44、45、48及51；5对引物组包括：Pm(Pm含全部启动子和1/4exon)、exon13、43、50及52，两组 14 对引物由美国 Baylor 医学研究院 Caskey 医生提供。
结 果
一、DMD患儿
27 例 DMD 患儿中9对引物 PCR 测得的缺失型病例为11例，占41%。缺失的部位集中在 exon45、exon48和exon51。其它16例再经5对引物 PCR 检测发现缺失型为5例，占19%，以 exon52 部位为主。总缺失型例数16例，占60%。
二、高危胎儿
22例高危胎儿中男性12例，女性 10例。12 例男性胎儿中，先证者为缺失型的6例，其对应的高危男胎用14对引物 PCR 诊断后4例有基因缺失，缺失部位与先证者相同，2例无基因缺失(图1～3)。阳性发现均由胎肌病理证实。对于另外6例非缺失型的先证者所对应的高危男性胎儿，我们做了胎儿镜下的胎肌活检，并进行胎肌病理诊断，发现1例为发病胎儿。
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图1的A5缺第3条带，A6缺第5条带，A7缺第1条带；图2A1和A3缺第1条带；图3A5缺第5条带，F3缺2,5条带，A4缺1,2,5条带
图1～3 两组多重 PCR 检出的先证者(A)及胎儿(F)的电泳带型
讨 论
Dunnen〔1〕用交变场电泳法可检测 DMD 基因缺失率为50%。Darras 等〔2〕1988年报告 DMD 基因缺失率最高达66%。曾溢涛等〔3〕用9对引物 PCR 测和 DMD 基因缺失率为52%。本组资料14对引物 PCR 测出 DMD 基因缺失率近60%，与国外报道相符。
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关于缺失热点，Kunkel等〔4〕认为有两个：(1)位于 cDNA1b 区即 pERT87/XJ 区域，占基因缺失型的28%；(2)位于 cDNA8 的部位即 JBir 和J66-H1区，占基因缺失型的51%。本组结果示基因缺失主要位于 exon43→exon52区域，即cDNA7～8区，占缺失型总数的94%，这与Kunkel观点基本一致。用9对引物 PCR 检测这一区域基因缺失率为41%，用5对引物 PCR 检测这一区域的基因缺失检出率为19%。由此看来5对引物 PCR 结果并未改变基因缺失的热点部位，只是通过热点区域内增加了5个 exon 部位的引物，使基因缺失检出率增加了5个。因此我们认为第二组5对引物是非常重要的。
DMD患儿有基因缺失时其缺失片段大小和部位常有明显不同。本组27例患儿中有13例仅缺失1个外显子，1例缺失2个外显子，2例缺失3个外显子(共16例缺失)，缺失部位各不相同，但这些病例在临床表现上没有明显差别，这说明病情轻重与基因缺失片段大小和部位无关。所以有学者认为病情轻重取决于基因缺失对阅读框架的影响。若基因缺失打断或改变阅读框架则产生典型的 DMD，若保持阅读框架则临床表现为 BMD。
, http://www.100md.com
对于散发病例的产前诊断一直是人们的关注的问题。有人用单体型分析法进行产前诊断，但方法复杂，而需要有做为标记的多态性酶切位点，故相当困难。也有人认为散发病例的再发风险小，不是产前诊断的重点。本组22例产前诊断病例均为散发病例，患儿家长强烈要求作胎儿诊断。从产前诊断结果看，4例胎儿为基因缺失型，1例胎儿为非基因缺失型发病者(靠胎肌病理诊断)，说明 DMD 再发风险是高的。因此，我们认为用 PCR 法做产
前诊断尤其是对散发病例是可行的并有其优越性。此外，我们作胎肌病理检查证实了 PCR 诊断结果是可靠的，并为今后探索抗肌萎缩蛋白的组织化学改变提供了条件。
参考文献
1 Den Dunnen JT,Bakker E,Breteler EG,et al.Direct detection of more than 50% Duchenne musculer dystrophy mutations by field inversion gels.Nature,1987,329∶640.
, 百拇医药
2 Darras BT,Francke U.Normal human genomic restriction-fragment patterns and polymorphisms revealed by hybridization with the entire dystrophin cDNA.Am JHum Genet,1988,43∶612.
3 曾溢涛，陈美钰，任兆瑞，等.应用多重PCR扩增法快速诊断中国人 DMD 基因缺失.遗传与疾病，1991，8∶33.
4 Kunkel LM,Monaco AP,Middlesworth W,et al.Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male with an X chromosome deletion.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82∶4778.
(收稿：1992-07-20 修回：1993-05-05), 百拇医药