石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒DNA的检测
作者：骆抗先 梁炽森 何海棠 侯金林 陈伟华 章廉
单位：510516 广州,第一军医大学南方医院
关键词：
940122.htm 检测肝内乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)，一般从组织匀浆中提取DNA，用斑点或Southern吸印转移杂交。我们曾报告109例慢性无症状HBV携带者(AsC)，经southern杂交仅检出肝内HBV DNA82例(75.5%)[1]。而且，肝活检组织除石蜡包埋供病理诊断外，常无多余组织满足吸印转移需要。近年发展的聚合酶链反应(PCR)技术，叮将HBV DNA的一。个区段在体外扩增1×106倍[2]，仅需含少数病毒拷贝的微量样品即可满足试验，因而有可能用档案保存的蜡块切取少数薄片作为检材。作者对不同感染水平的病例，以不同方法准备DNA后以PCR技术，与用冻结组织吸印杂交、或用地高辛素(Digoxigenin)探针蜡片原位杂交，对比研究肝组织HBV DNA的检测，试图利用存档的经甲醛固定、石蜡包埋的肝组织进行分子病毒学研究。
, 百拇医药
材料和方法
一、肝组织
AsC 22例、HBsAg(+)的慢性活动性肝炎(CAm20例、恢复期急性肝炎(AH)2例、乙肝表面抗原(HBsAg)(-)的CAH 8例和肝癌5例，正常肝组织2例，均经病理诊断。AsC的肝组织在1984年经活检吸印杂交[1]后，部分组织由液氮保存，石蜡包埋组织亦为当时存档。肝炎和肝癌的肝组织为近4年中病理诊断后存档的蜡块。
二、聚合酶链反应
样品准备：(1)液氮冻存肝组织恒冷切片5pm3～4片，经蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀后重悬于TE缓冲液15pl；(2)石蜡切片5llm 3～4片，二甲苯脱蜡后，乙醇去二甲苯，加pH7.5的Tris缓冲液2001L1，10%SDs10，蛋白酶K2，置70C温育1小时后，以同浓度蛋白酶K42C消化过夜，DNA提取同上；(3)石蜡薄切片脱蜡后进行PCR。PCR方法见文献n。将HBV/s区段引物(nt273～294和nt688～668R，上海细胞学研究所合成)、dNTP和Taq DNA聚合酶(北京华美试剂公司)与样品5反应35周。PCR产物以合溴乙啶的琼脂糖电泳，观察预期的4l6bp条带。
, 百拇医药
表1 肝组织经不同处理后进行PCR检出HBV DNA的例数 肝胆组来源
例数
血清HBV标准物
肝HBV DNA
肝组织不同处理后PCR
HBsAg(+)
HBeAg(+)
游离型
整合型
冻结匀浆
蜡片抽提
蜡片直接
, 百拇医药
AsC
5
5
5
5
0
5
5
2
5
5
0
1
1
, 百拇医药
5
5
0
CAH
4
4
2
1
0
3
3
1
AH恢复期
2
, http://www.100md.com
1
0
0
0
1
0
0
表2 用PCR法自不同感染水平的AsC的蜡埋肝中检出HBV DNA的例数 组别*
例数
血清
冻结肝组织
蜡埋肝中
PCR检出
, 百拇医药
HBV例数
HBsAg
(反向血凝12n)
HBeAg
(酶免役法)
HBV DNA
(斑点杂交)
酶组化法
酶组化法
吸印转移
A
6
, 百拇医药 6~12
+
+
+
+
游离
6
B
5
6~10
-
-
+
+或-
, 百拇医药
游离或整合
5
C
11
3~8
-
-
+
-
-
10
对照
2
0
, http://www.100md.com
-
-
-
-
-
0
**A组为HBsAg均(+);B组HBsAg(+)、HBeAg(-);C组为HBsAg、HBeAg均(-),表3同
*2n对倍稀释滴度，高组抵限与低组高限间有重叠 试验内标志：β珠蛋白基因片段，引物5＇GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG、5＇TGGTCTCCTTAAACCTCTCTTG(R)，与HBV引物同时加入反应，靶序列262bp[4]，以保证样品DNA量和反应系统的效率。
聚合酶抑制物：为除去石蜡包埋组织中可能存在的抑制物，将初检HBVDNA(一)的PCR产物稀释为100，煮沸5分钟后立即SephadexG25层析，收集最初100，乙醇沉淀，溶解后再次PCR。
, 百拇医药
防止实验污染：严格遵守Gerken等[6]提出的操作规程。此外，肝组织切片用消毒过的刀片，丢弃最初切下的已暴露过的组织。
三、分子杂交
冻结组织Southern杂交和蜡片原位杂交方法见文献[1，7]。
结 果
一、不同处理方法对样品PCR灵敏性的影响
同一肝组织以四种方法处理：(1)冻结组织或(2)蜡埋组织抽提DNA后PC巳(3)脱蜡切片直接PCR，(4)吸印杂交。四种方法处理后进行PCR检测结果比较见表1。
二、AsC蜡埋组织中的HBVDNA
所有HBsAg(+)者，经PCR均可自其蜡埋组织中检出HBVDNA(表2)，正常对照组仅能检出儿珠蛋白基因条带。
, 百拇医药
三、HBsAg(+)CAH蜡埋组织中的HBvDNA
CAH临床肝活检标本仅够石蜡包埋以供病理诊断。蛤埋组织PCR与原位杂交对比，在20例中杂交恰出HBVDNAI7例，PCR检出13例(表3)。初检HBVDNA(一)7例的PCR产物，经去抑制物后再次PCR，均叮检出HBVDNA和β-珠蛋白基因。
表3 自不同感染水平的CAH的蜡埋肝中，PCR检出HBV DNA例数的比较 组别
例数
肝组织HBV DNA(+)例数
原位杂交
PCR
除抑制物后PCR
, 百拇医药
A
14
13
10
14
B
5
4
3
5
C
1*
0
0
, 百拇医药
1
合计
20
17
13
20
*AH恢复期 四、HBsAg(一)慢性肝病蜡埋组织中的HBVDNA
CAH8例中检出HBVDNA6例，其中有抗HBc(+)和抗HBs(+)各1例；原发性肝癌癌旁组织5例中检出4例，其中2例抗HBs(+)(表4)。
表4 HBsAg(-)慢性肝病的蜡埋肝中，PCR检出HBV DNA例数的比较 组别
例数
, 百拇医药
血清
肝组织HBV DNA(+)例数
抗HBc
抗HBs
吸印杂交
PCR
除抑制物后PCR
CAH
4
-
-
0
4
, http://www.100md.com
1
+
-
0
1
3
-
+
0
1
肝癌
3
-
-
, http://www.100md.com
1
0
2
2
-
+
1
0
2
讨 论
由蜡埋组织与由冻结组织提取DNA，其PCR结果近似。档案保存的蜡块可用于病毒学研究，极大地扩展了检材来源。蜡埋组织中的HBv DNA室温贮存数年，又经消化抽提等系列处理，大多成为较小分子的断片(100～500bp))，难以用Southern吸印杂交的方法检出[8]；而PCR扩增的仅是基因组中的一个区段，分子降解对其影响较小，这可能是PCR能由蜡埋组织中检出HBVDNA的原因。石蜡包埋切片经脱蜡后可直接进行PCRM，说明在液相中进行的反应，是可以用存在于组织中而暴露于切片表面的病毒作模板的，这可大大简化试验过程，但仅能检出感染水平较高的个例。
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PCR琼脂糖电泳可检出血清中10fg/样品的HBV DNA[3]。肝组织中含较多的细胞DNA(约6.4pg/细胞)，从混杂DNA 500ng的样品中检出特异DNA，其灵敏性仅1pg/样品4。因而P(H检测肝内HBvDNA远不及检测血清灵敏。我们在22例AsC中2l例检出病毒，而在20例HBsAg(OCAH中初检仅13例。可能由于CAH处于感染复制一炎症清除阶段，病毒水平一般较低，而炎性渗出中含较多酶抑制物，因而易于出现假阴性。用简单的凝胶层析，有效地除去了抑制物，能检出几乎所有HBsAG(+)的HBV感染。
另一种假阴性是由于样品量不足。石蜡包埋组织曾经甲醛固定，较谁酶解和抽提，如含DNA量低于1µg/样品，常难获得阳性结果。为此，要同时扩增β-珠蛋白基因(含1拷贝/细胞)作为试验内标志，以保证PCR样品的DNA含量[4]。
经上述处理，以PCK检测经石蜡包埋、甲醛固定肝组织中的HBVDNA，其灵敏性可高达l拷贝/5000细胞，比分子杂交检测冻存肝细胞中的HBVDNA灵敏500倍[10]。但是，PCR只能检出病毒基因组的一个区段，不能鉴定组织中存在的分子状态：游离或整合及其分子大小。PCR仅能证明H8v感染的存在，对血清HBsAg(刊的病例，PCR似乎并不必要。本组HBsAg(+)CAH8例中6例、原发性肝癌5例中4例，以除去酶抑制物后的PCR作出了病原学诊断。在我国，HBsAg(-)的HBV感染可能并不少见[11]，而肝组织PCR最适合极微量感染的鉴定。
, 百拇医药
参考文献
l梁炽森，骆抗先，王昌才，等。慢性HBV无症状感染者病毒复制状态与组织病变的关系。中华医学杂志， 1987，67 ： 560
2 LarzuI D， Guigue F， Sninsky JJ， et al. Detection of hepatitis B virus scquences in serum by using in vitro enzvmatic amplification。J VlroI Meth，1988，20 ： 227
3 骆抗先，周 荣，梁炽森，等聚合酶链反应鉴定HBsAg阴 性慢性活动性肝炎中的乙型肝炎病毒感染。中华内科杂 志,1991，30:20。
4 进藤道子,奥野忠雄，新井簧，他.B型扫上0非A4卜B型慢 性肝炎o/子1*)包埋肝粗阔切片和弓OH3vDNA o怖贾肝*， 1990.31＝875。
, http://www.100md.com
5 de Franchis R，Cross NCP，Foulkcs NS，et al.A pOtent inhibitor of Taq polymerase copurifles with human genomic DNA。Nuc Acid Res，1988，16 ：l0 355。
6 Gecken G，Gerlich WH，Brechot C，et al.Biological standards for hepatitis B virus assay J Hepatol,1992， 15：25L
7侯金林，骆抗光Molecular pathogel1csis of hepat ocellular carcinoma andChfonic liver disases:An in situ hybridization study with digoxigenin-labelled probes(abstr)1GasteroenteroI H epatol，l991，6l suppl ：50
, 百拇医药
8 Impraim CC，Saiki RK，Erlich HA， et aL Analvsis of DNA extracted from formalin-fixed,paraffin-em- beddOdtissues bv enzym atic ampliflcation and hvbridlzation with sequence-specific oligonucleotides Biochem Biophys Res Commun，1987，142 ：710
9 Shibata DK、Arnhdeim N。Martin WJ，Detection of human papilloma virus in paraffin-embedded tissue using the polymerase chain reaction J Exp Med， 1988,167：225。
10 Lo Y-MD，Mehal WZ，Fleming KA In vitro amplifica- tion of hepatitis B virus sequences from liver trmour DNA and from paramn wax embedded tissues using the polymerase chain reaction J CIin Patho1， l989，42：840
11 骆抗先，周荣，何超，et aL Hcpatitis B virus DNA in sera of virus carriers positive exclusively for antlbodies tO thC hepatitis B core antigen。 J McdVirol， l991，35 ： 55
(收稿：1992-11-23 修回： 1993-10-07), http://www.100md.com
单位：510516 广州,第一军医大学南方医院
关键词：
940122.htm 检测肝内乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)，一般从组织匀浆中提取DNA，用斑点或Southern吸印转移杂交。我们曾报告109例慢性无症状HBV携带者(AsC)，经southern杂交仅检出肝内HBV DNA82例(75.5%)[1]。而且，肝活检组织除石蜡包埋供病理诊断外，常无多余组织满足吸印转移需要。近年发展的聚合酶链反应(PCR)技术，叮将HBV DNA的一。个区段在体外扩增1×106倍[2]，仅需含少数病毒拷贝的微量样品即可满足试验，因而有可能用档案保存的蜡块切取少数薄片作为检材。作者对不同感染水平的病例，以不同方法准备DNA后以PCR技术，与用冻结组织吸印杂交、或用地高辛素(Digoxigenin)探针蜡片原位杂交，对比研究肝组织HBV DNA的检测，试图利用存档的经甲醛固定、石蜡包埋的肝组织进行分子病毒学研究。
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材料和方法
一、肝组织
AsC 22例、HBsAg(+)的慢性活动性肝炎(CAm20例、恢复期急性肝炎(AH)2例、乙肝表面抗原(HBsAg)(-)的CAH 8例和肝癌5例，正常肝组织2例，均经病理诊断。AsC的肝组织在1984年经活检吸印杂交[1]后，部分组织由液氮保存，石蜡包埋组织亦为当时存档。肝炎和肝癌的肝组织为近4年中病理诊断后存档的蜡块。
二、聚合酶链反应
样品准备：(1)液氮冻存肝组织恒冷切片5pm3～4片，经蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀后重悬于TE缓冲液15pl；(2)石蜡切片5llm 3～4片，二甲苯脱蜡后，乙醇去二甲苯，加pH7.5的Tris缓冲液2001L1，10%SDs10，蛋白酶K2，置70C温育1小时后，以同浓度蛋白酶K42C消化过夜，DNA提取同上；(3)石蜡薄切片脱蜡后进行PCR。PCR方法见文献n。将HBV/s区段引物(nt273～294和nt688～668R，上海细胞学研究所合成)、dNTP和Taq DNA聚合酶(北京华美试剂公司)与样品5反应35周。PCR产物以合溴乙啶的琼脂糖电泳，观察预期的4l6bp条带。
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表1 肝组织经不同处理后进行PCR检出HBV DNA的例数 肝胆组来源
例数
血清HBV标准物
肝HBV DNA
肝组织不同处理后PCR
HBsAg(+)
HBeAg(+)
游离型
整合型
冻结匀浆
蜡片抽提
蜡片直接
, 百拇医药
AsC
5
5
5
5
0
5
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2
5
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0
1
1
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5
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CAH
4
4
2
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3
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1
AH恢复期
2
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1
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0
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表2 用PCR法自不同感染水平的AsC的蜡埋肝中检出HBV DNA的例数 组别*
例数
血清
冻结肝组织
蜡埋肝中
PCR检出
, 百拇医药
HBV例数
HBsAg
(反向血凝12n)
HBeAg
(酶免役法)
HBV DNA
(斑点杂交)
酶组化法
酶组化法
吸印转移
A
6
, 百拇医药 6~12
+
+
+
+
游离
6
B
5
6~10
-
-
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+或-
, 百拇医药
游离或整合
5
C
11
3~8
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-
10
对照
2
0
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0
**A组为HBsAg均(+);B组HBsAg(+)、HBeAg(-);C组为HBsAg、HBeAg均(-),表3同
*2n对倍稀释滴度，高组抵限与低组高限间有重叠 试验内标志：β珠蛋白基因片段，引物5＇GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG、5＇TGGTCTCCTTAAACCTCTCTTG(R)，与HBV引物同时加入反应，靶序列262bp[4]，以保证样品DNA量和反应系统的效率。
聚合酶抑制物：为除去石蜡包埋组织中可能存在的抑制物，将初检HBVDNA(一)的PCR产物稀释为100，煮沸5分钟后立即SephadexG25层析，收集最初100，乙醇沉淀，溶解后再次PCR。
, 百拇医药
防止实验污染：严格遵守Gerken等[6]提出的操作规程。此外，肝组织切片用消毒过的刀片，丢弃最初切下的已暴露过的组织。
三、分子杂交
冻结组织Southern杂交和蜡片原位杂交方法见文献[1，7]。
结 果
一、不同处理方法对样品PCR灵敏性的影响
同一肝组织以四种方法处理：(1)冻结组织或(2)蜡埋组织抽提DNA后PC巳(3)脱蜡切片直接PCR，(4)吸印杂交。四种方法处理后进行PCR检测结果比较见表1。
二、AsC蜡埋组织中的HBVDNA
所有HBsAg(+)者，经PCR均可自其蜡埋组织中检出HBVDNA(表2)，正常对照组仅能检出儿珠蛋白基因条带。
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三、HBsAg(+)CAH蜡埋组织中的HBvDNA
CAH临床肝活检标本仅够石蜡包埋以供病理诊断。蛤埋组织PCR与原位杂交对比，在20例中杂交恰出HBVDNAI7例，PCR检出13例(表3)。初检HBVDNA(一)7例的PCR产物，经去抑制物后再次PCR，均叮检出HBVDNA和β-珠蛋白基因。
表3 自不同感染水平的CAH的蜡埋肝中，PCR检出HBV DNA例数的比较 组别
例数
肝组织HBV DNA(+)例数
原位杂交
PCR
除抑制物后PCR
, 百拇医药
A
14
13
10
14
B
5
4
3
5
C
1*
0
0
, 百拇医药
1
合计
20
17
13
20
*AH恢复期 四、HBsAg(一)慢性肝病蜡埋组织中的HBVDNA
CAH8例中检出HBVDNA6例，其中有抗HBc(+)和抗HBs(+)各1例；原发性肝癌癌旁组织5例中检出4例，其中2例抗HBs(+)(表4)。
表4 HBsAg(-)慢性肝病的蜡埋肝中，PCR检出HBV DNA例数的比较 组别
例数
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血清
肝组织HBV DNA(+)例数
抗HBc
抗HBs
吸印杂交
PCR
除抑制物后PCR
CAH
4
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1
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讨 论
由蜡埋组织与由冻结组织提取DNA，其PCR结果近似。档案保存的蜡块可用于病毒学研究，极大地扩展了检材来源。蜡埋组织中的HBv DNA室温贮存数年，又经消化抽提等系列处理，大多成为较小分子的断片(100～500bp))，难以用Southern吸印杂交的方法检出[8]；而PCR扩增的仅是基因组中的一个区段，分子降解对其影响较小，这可能是PCR能由蜡埋组织中检出HBVDNA的原因。石蜡包埋切片经脱蜡后可直接进行PCRM，说明在液相中进行的反应，是可以用存在于组织中而暴露于切片表面的病毒作模板的，这可大大简化试验过程，但仅能检出感染水平较高的个例。
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PCR琼脂糖电泳可检出血清中10fg/样品的HBV DNA[3]。肝组织中含较多的细胞DNA(约6.4pg/细胞)，从混杂DNA 500ng的样品中检出特异DNA，其灵敏性仅1pg/样品4。因而P(H检测肝内HBvDNA远不及检测血清灵敏。我们在22例AsC中2l例检出病毒，而在20例HBsAg(OCAH中初检仅13例。可能由于CAH处于感染复制一炎症清除阶段，病毒水平一般较低，而炎性渗出中含较多酶抑制物，因而易于出现假阴性。用简单的凝胶层析，有效地除去了抑制物，能检出几乎所有HBsAG(+)的HBV感染。
另一种假阴性是由于样品量不足。石蜡包埋组织曾经甲醛固定，较谁酶解和抽提，如含DNA量低于1µg/样品，常难获得阳性结果。为此，要同时扩增β-珠蛋白基因(含1拷贝/细胞)作为试验内标志，以保证PCR样品的DNA含量[4]。
经上述处理，以PCK检测经石蜡包埋、甲醛固定肝组织中的HBVDNA，其灵敏性可高达l拷贝/5000细胞，比分子杂交检测冻存肝细胞中的HBVDNA灵敏500倍[10]。但是，PCR只能检出病毒基因组的一个区段，不能鉴定组织中存在的分子状态：游离或整合及其分子大小。PCR仅能证明H8v感染的存在，对血清HBsAg(刊的病例，PCR似乎并不必要。本组HBsAg(+)CAH8例中6例、原发性肝癌5例中4例，以除去酶抑制物后的PCR作出了病原学诊断。在我国，HBsAg(-)的HBV感染可能并不少见[11]，而肝组织PCR最适合极微量感染的鉴定。
, 百拇医药
参考文献
l梁炽森，骆抗先，王昌才，等。慢性HBV无症状感染者病毒复制状态与组织病变的关系。中华医学杂志， 1987，67 ： 560
2 LarzuI D， Guigue F， Sninsky JJ， et al. Detection of hepatitis B virus scquences in serum by using in vitro enzvmatic amplification。J VlroI Meth，1988，20 ： 227
3 骆抗先，周 荣，梁炽森，等聚合酶链反应鉴定HBsAg阴 性慢性活动性肝炎中的乙型肝炎病毒感染。中华内科杂 志,1991，30:20。
4 进藤道子,奥野忠雄，新井簧，他.B型扫上0非A4卜B型慢 性肝炎o/子1*)包埋肝粗阔切片和弓OH3vDNA o怖贾肝*， 1990.31＝875。
, http://www.100md.com
5 de Franchis R，Cross NCP，Foulkcs NS，et al.A pOtent inhibitor of Taq polymerase copurifles with human genomic DNA。Nuc Acid Res，1988，16 ：l0 355。
6 Gecken G，Gerlich WH，Brechot C，et al.Biological standards for hepatitis B virus assay J Hepatol,1992， 15：25L
7侯金林，骆抗光Molecular pathogel1csis of hepat ocellular carcinoma andChfonic liver disases:An in situ hybridization study with digoxigenin-labelled probes(abstr)1GasteroenteroI H epatol，l991，6l suppl ：50
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8 Impraim CC，Saiki RK，Erlich HA， et aL Analvsis of DNA extracted from formalin-fixed,paraffin-em- beddOdtissues bv enzym atic ampliflcation and hvbridlzation with sequence-specific oligonucleotides Biochem Biophys Res Commun，1987，142 ：710
9 Shibata DK、Arnhdeim N。Martin WJ，Detection of human papilloma virus in paraffin-embedded tissue using the polymerase chain reaction J Exp Med， 1988,167：225。
10 Lo Y-MD，Mehal WZ，Fleming KA In vitro amplifica- tion of hepatitis B virus sequences from liver trmour DNA and from paramn wax embedded tissues using the polymerase chain reaction J CIin Patho1， l989，42：840
11 骆抗先，周荣，何超，et aL Hcpatitis B virus DNA in sera of virus carriers positive exclusively for antlbodies tO thC hepatitis B core antigen。 J McdVirol， l991，35 ： 55
(收稿：1992-11-23 修回： 1993-10-07), http://www.100md.com