乙型肝炎病毒前C区基因变异的研究
作者：王爱莲 周永兴 姚志强
单位：710038西安，第四军医大学唐都医院传染科
关键词：乙型肝炎病毒；基因，病毒；聚合酶链反应
中华医学杂志940305
摘要 作者应用聚合酶链反应(PCR)检测了e系统阳性的慢性乙型肝炎(乙肝)患者血清乙肝病毒(HBV)DNA，筛选出乙肝e抗原(HBeAg)阳性/乙肝e抗体(抗-HBe)阴性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性各20份PCR阳性血清，分别用人工合成的HBV前C区基因寡核苷酸探针M0(无突变)，M1(1点[突变)，M2(2点突变)进行斑点杂交，结果发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性慢性乙肝患者有17例(占85%)在1896位核苷酸发生点突变，形成终止密码，其中10例(占50%)发生2点突变。选突变PCR产物直接测序，同样证实点突变的存在。提示乙肝患者HBeAg阳性自然转换为抗-HBe阳性，并不一定是病毒复制减弱，而可能是HBV DNA前C区发生了基因变异
, 百拇医药
慢性乙型肝炎(乙肝)患者乙肝e抗体(抗-HBe)阳性是否代表病毒复制减弱，乙肝e抗原(HBeAg)阳性转换成抗-HBe阳性肝病为什么发展，一直是临床上急需回签的问题。国外报道发现此类患者乙肝病毒(HBV)前C区1896位核苷酸G突变为A，使编码色氨酸的密码子(TGG)变为终止密码子(TAG)。为探讨前C区基因变异在慢性乙肝中的作用，采用基因扩增，分子杂交，序列分析方法进行了如下研究。
资料和方法
一、研究对象
应用聚合酶链反应(PCR)检测89例慢性乙肝患者血清HBV DNA，在68例阳性者中选HBeAg阳性/抗-HBe阴性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性各20例。HBeAg阳性/抗-HBe阴性组中慢性迁延性肝炎(CPH)6例，慢性活动性肝炎(CAH)10例，肝炎后肝硬变(LC)3例，慢性重症肝炎(CFH)1例；HBeAg阴性/抗-HBe阳性组CPH4例，CAH8例，LC6例，CFH2例。
, 百拇医药
二、以PCR扩增血清HBV DNA基因
血清200μl经蛋白酶K消化后，苯酚/氯仿提取HBV DNA，模板DNA 5μl分别加和 dNTP 200μmol/L、引物C1和C3(本校分子生物研究室合成，序列见表1)各25pmol/L、反应缓冲液(10mmol Tris-HC1的pH 8.3、2.5mmol/L MgC1、50mmol/L KC1、0.1% Triton×-100)、加双蒸水至总体积70μl，95℃变性7分钟后加入2U Taq DNA 聚合酶(购自美国 Promega 公司)作30个循环，每循环95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，70℃延伸2分钟。
三、寡核苷酸探针斑点杂交
M0(无突变)，M1(1点突变)，M2(2点突变)寡核苷酸(上海复旦大学生化室合成，序列见表1)分别用y-32PdATP(购自北京福瑞生物工程公司)10μCi 5'末端标记，放射比强度2.0×107～2.5×107cpm/μgDNA。PCR产物4μl分别点在3张硝酸纤维膜(购自美国GIB公司)上，变性中和后，80℃烘烤2小时，烘烤后膜在密封塑料袋预杂交液(6×SSC、10×Denhardt、0.1% SDS、0.1mg/ml CTDNA)内68℃水浴震荡2小时，分别加入M0、M1、M2探针42℃水浴震荡过夜，取出杂交膜用6×SSC溶液42℃漂洗15分钟，-70℃放射自显影，M0、M1、M2杂交膜分别70℃、67℃、65℃用6×SSC溶液漂洗2个15分钟，-70℃放射自显影。
, 百拇医药
四、HBV DNA序列分析
PCR产物纯化，按美国Promega公司MagicTMPCR pres DNA 纯化系统试剂盒操作流程进行。纯化后PCR产物用美国Promega公司fmolTMDNA测序系统试剂盒，按32P末端标记引物法进行。引物采用Cs，序列见表1。
表1 乙肝病毒C区基因寡核苷酸序列 名称
碱基位置
序 列
C1
2394～2370
GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG
, 百拇医药
C3
1730～1754
CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT
Cs
1974～1955
GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA
M0
1885～1906
TGGGTGGCTTTGGGGCATGGAC
M1
1886～1906
, http://www.100md.com
GGGTGGCTTTAGGGCATGGAC
M2
1885～1906
TGGGTGGCTTTAGGACATGGAC
注：C1、C3、Cs为寡核苷酸引物，M0为无突变寡核苷酸，M1，M2为点突变寡核苷酸(下表同)。碱基下黑点为突变位点
结 果
一、PCR扩增HBV DNA基因
取8μl PCR反应液加2μl溴酚蓝缓冲液，经2%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶)电泳后，紫外线检测仪观察在664bp相应位置上出现荧光带者为阳性，反之为阴性。并经Southern转移后，HBV C基因控针杂交和Bgl Ⅱ酶切，证实该产物确为HBV DNA同源片段。共检测e系统阳性者89例，其中HBV DNA阳性者68例，进一步筛选出HBeAg阳性/抗-HBe阴性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性各20例进行斑点杂交和序列测定。
, 百拇医药
二、斑点杂交检测HBV前C区基因变异
HBeAg阳性/抗-HBe阴性组19例M0杂交阳性，表示未见突变；而HBeAg阴性/抗-HBe阳性组仅1例M0杂交阳性，6例M1、4例M2、5例M1+M2杂交阳性，表示在1896位和1899位存在点突变，M0+M1和M0+M2杂交均阳性各1例，表示血清中部分病毒存在1点或2点突变，前组1例后组2例三种探针杂交均呈阴性，表示在探针内设计点突变外部位亦存在突变(表2)。
三、PCR产物直接测序
为进一步证实点突变探针杂交结果，用M1杂交阳性PCR产物直接测序，可以看出1896位核苷酸G变为A，导致原有的色氨酸密码子(TGG)变成终止密码子(TAG)(附图)，同时发现1837位核苷酸A变为G，使原CTA变成CTG。
表2 不同寡核苷酸探针斑点杂交结果(例) 寡核苷酸探针
, 百拇医药
HBeAg(+)/抗-HBe(-)
HBeAg(-)/抗-HBe(+)
M0
19
1
M1
0
6
M2
0
4
M0+M1
0
, 百拇医药
1
M0+M2
0
1
M1+M2
0
5
None
1
2
合 计
20
20
, http://www.100md.com
附图 HBV前C区终止密码
讨 论
传统的观点认为感染HBV后血清HBeAg阳性提示病毒复制活跃，传染性强，而HBeAg转换为抗-HBe后则与之相反。但近年的研究发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性患者有慢性化、重症化趋向[1～3]。1987年以来相继报道在慢性肝炎，重症肝炎及肝癌患者中发现存在HBV变异株，最常见的变异株为前C区1896位核苷酸G突变为A，出现终止密码，从而导致HBeAg不能表达，而病毒仍在持续复制，造成肝损害，也有部分变异株发生多点突变[4～9]。我们发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性组17例在1896位核苷酸G变为A，使编码色氨酸的密码子(TGG)变为终止密码子(TAG)，其中10例除在1896位点突变外，同时在1899位核苷酸G变为A，使编码的甘氨酸变为天冬氨酸，1例未见突变；而HBeAg阳性/抗-HBe阴性组19例未发现突变，前组2例后组1例3种探针杂交均呈阴性，推测在探针内设计点突变以外的部位亦有突变，有待深入研究。为证实点突变探针杂交结果，进一步用M1杂交阳性的PCR产物直接测序，同样发现1896位核苷酸G突变为A，同时在1837位亦存在点突变，提示HBV前C区基因存在多位点突变。
, http://www.100md.com
HBV DNA C基因编码2种蛋白质：非结构性分泌蛋白(HBeAg)和核衣蛋白(HBcAg)，C基因从2个不同的密码子(ATG)开始转译，这2个密码子被编码29个氨基酸残基的87个核苷酸分隔，称前C区，从第1个(ATG)开始转译产生HBeAg的前质蛋白，并以氨基和羟基末端同时分泌的形式产生17×103d的HBeAg。因此，分泌型HBeAg的产生与前C区有关。近年的研究和本研究均证实，HBV前C区基因变异产生终止密码，使HBeAg不能表达，但病毒本身复制并不受影响[10，11]。有学者发现HBV前C区基因变异90%～97%存在于HBV DNA阳性/HBeAg阴性的慢性乙肝患者中[12]。Omata等[7]
报道急、慢性重症HBV DNA阳性/抗-HBe阳性乙型肝炎78%发生前C区基因变异。也有学者在肝癌活检标本中发现了这种突变病毒基因[8，9]。我们发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性慢性肝炎、LC、CFH患者中85%发生前C区基因变异。可见在我国HBV DNA阳性/抗-HBe阳性肝炎患者中部分发展成慢性肝炎或LC，甚至加重成CFH，很可能是由于前C区基因在体内发生变异，也可能存在这川变异株的传播或变异株的野生株混合感染。
, 百拇医药
关于缺陷型HBeAg前C区基因变异株在肝细胞损伤中的机制，尚未完全清楚，可能是：(1)由于前C区点突变使HBV的致病性发生改变，因为新的终止密码的产生使前C肽被截短，这种截短了的前C肽可引起直接的致细胞病变作用，导致肝细胞损害。(2)缺陷型HBeAg变异株感染的肝细胞逃避宿主的免疫，不被机体免疫系统识别并杀伤，病毒不能被清除而产生慢性肝炎。(3)HBV前C区基因突变导致提前终止翻译的HBeAg抗原性改变，使之产生强烈的反应，导致肝细胞被杀伤。至于HBV变异的普遍性，立体结构及其临床后果有待进一步深入研究。
参考文献
1 Chu CM, Liaw YF, Sheen IS, et al. Sex difference in chronic hepatitis B virus infection: an appraisal based on the status of hepatitis e antigen and antibody. Hepatology. 1983,3:947.
, 百拇医药
2 倪贤珍，刘逢举，陈青锋，等斑点杂交直接检测血清HBV DNA在乙型肝炎诊断中的作用，中华传染病杂志，1987，5：28。
3 李绍白，杨大国，唐望先等，慢性乙型肝炎患者与无症状HBeAg携带者血清乙型肝炎病毒樗的检测与随访，中华传染病杂志，1986，4：84。
4 Carman WF,Jacyna MR, Hadziyannis S, et al Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989,2:588.
5 Brunetto MR, Stemler M, Bonino F, et al, A new hepatitis B virus strain in patients with severe anti-HBe positive chronic hepatitis B J hepatol, 1990,10:258.
, 百拇医药
6 Liang TJ, Hasegawa K, Rimon N, et al, A hepatitis B virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis. N Eng J Med, 1991,324:1705.
7 Omata M, Ehata T, Yokosuda O, et al, Mutation in the precore region of hepatitis B virus DNA in patients with fulminant and severe hepatitis. N Eng J Med, 1991,18:95.
8 陈子平，闻玉梅，顾建人等，肝癌组织内乙型肝炎病毒基因组前C区终止密码的发现，上海医科大学学报，1991，18：95。
9 Poppeer H, Shafritz DA, Hoofnagle JH, Relation of the hepatitis B virus carrier state to hepatocelluar carcinoma. Hepatology, 1987,7:764.
, 百拇医药
10 王宇，陶其敏，乙型肝炎病毒前C区基因点突变阻止分泌型e抗原产生，中华微生物学和免疫学杂志，1991，11：73。
11 Fiordalisi G, Cariani E, Mantero G, et al. Highgenomic variability in the Pre-c region of hepatitis B virus in anti-HBe, HBV DNA positive chronic hepatitis, J Med virol, 1990,31:297.
12 Okamoto H, Yotsumoto S, Akahane Y, et al Hepatitis B virus with precore region defects prevail in persistently infected hosts along with seroconversion to the antibody against e antigen J Virol,1990,64:1298., http://www.100md.com
单位：710038西安，第四军医大学唐都医院传染科
关键词：乙型肝炎病毒；基因，病毒；聚合酶链反应
中华医学杂志940305
摘要 作者应用聚合酶链反应(PCR)检测了e系统阳性的慢性乙型肝炎(乙肝)患者血清乙肝病毒(HBV)DNA，筛选出乙肝e抗原(HBeAg)阳性/乙肝e抗体(抗-HBe)阴性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性各20份PCR阳性血清，分别用人工合成的HBV前C区基因寡核苷酸探针M0(无突变)，M1(1点[突变)，M2(2点突变)进行斑点杂交，结果发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性慢性乙肝患者有17例(占85%)在1896位核苷酸发生点突变，形成终止密码，其中10例(占50%)发生2点突变。选突变PCR产物直接测序，同样证实点突变的存在。提示乙肝患者HBeAg阳性自然转换为抗-HBe阳性，并不一定是病毒复制减弱，而可能是HBV DNA前C区发生了基因变异
, 百拇医药
慢性乙型肝炎(乙肝)患者乙肝e抗体(抗-HBe)阳性是否代表病毒复制减弱，乙肝e抗原(HBeAg)阳性转换成抗-HBe阳性肝病为什么发展，一直是临床上急需回签的问题。国外报道发现此类患者乙肝病毒(HBV)前C区1896位核苷酸G突变为A，使编码色氨酸的密码子(TGG)变为终止密码子(TAG)。为探讨前C区基因变异在慢性乙肝中的作用，采用基因扩增，分子杂交，序列分析方法进行了如下研究。
资料和方法
一、研究对象
应用聚合酶链反应(PCR)检测89例慢性乙肝患者血清HBV DNA，在68例阳性者中选HBeAg阳性/抗-HBe阴性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性各20例。HBeAg阳性/抗-HBe阴性组中慢性迁延性肝炎(CPH)6例，慢性活动性肝炎(CAH)10例，肝炎后肝硬变(LC)3例，慢性重症肝炎(CFH)1例；HBeAg阴性/抗-HBe阳性组CPH4例，CAH8例，LC6例，CFH2例。
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二、以PCR扩增血清HBV DNA基因
血清200μl经蛋白酶K消化后，苯酚/氯仿提取HBV DNA，模板DNA 5μl分别加和 dNTP 200μmol/L、引物C1和C3(本校分子生物研究室合成，序列见表1)各25pmol/L、反应缓冲液(10mmol Tris-HC1的pH 8.3、2.5mmol/L MgC1、50mmol/L KC1、0.1% Triton×-100)、加双蒸水至总体积70μl，95℃变性7分钟后加入2U Taq DNA 聚合酶(购自美国 Promega 公司)作30个循环，每循环95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，70℃延伸2分钟。
三、寡核苷酸探针斑点杂交
M0(无突变)，M1(1点突变)，M2(2点突变)寡核苷酸(上海复旦大学生化室合成，序列见表1)分别用y-32PdATP(购自北京福瑞生物工程公司)10μCi 5'末端标记，放射比强度2.0×107～2.5×107cpm/μgDNA。PCR产物4μl分别点在3张硝酸纤维膜(购自美国GIB公司)上，变性中和后，80℃烘烤2小时，烘烤后膜在密封塑料袋预杂交液(6×SSC、10×Denhardt、0.1% SDS、0.1mg/ml CTDNA)内68℃水浴震荡2小时，分别加入M0、M1、M2探针42℃水浴震荡过夜，取出杂交膜用6×SSC溶液42℃漂洗15分钟，-70℃放射自显影，M0、M1、M2杂交膜分别70℃、67℃、65℃用6×SSC溶液漂洗2个15分钟，-70℃放射自显影。
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四、HBV DNA序列分析
PCR产物纯化，按美国Promega公司MagicTMPCR pres DNA 纯化系统试剂盒操作流程进行。纯化后PCR产物用美国Promega公司fmolTMDNA测序系统试剂盒，按32P末端标记引物法进行。引物采用Cs，序列见表1。
表1 乙肝病毒C区基因寡核苷酸序列 名称
碱基位置
序 列
C1
2394～2370
GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG
, 百拇医药
C3
1730～1754
CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT
Cs
1974～1955
GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA
M0
1885～1906
TGGGTGGCTTTGGGGCATGGAC
M1
1886～1906
, http://www.100md.com
GGGTGGCTTTAGGGCATGGAC
M2
1885～1906
TGGGTGGCTTTAGGACATGGAC
注：C1、C3、Cs为寡核苷酸引物，M0为无突变寡核苷酸，M1，M2为点突变寡核苷酸(下表同)。碱基下黑点为突变位点
结 果
一、PCR扩增HBV DNA基因
取8μl PCR反应液加2μl溴酚蓝缓冲液，经2%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶)电泳后，紫外线检测仪观察在664bp相应位置上出现荧光带者为阳性，反之为阴性。并经Southern转移后，HBV C基因控针杂交和Bgl Ⅱ酶切，证实该产物确为HBV DNA同源片段。共检测e系统阳性者89例，其中HBV DNA阳性者68例，进一步筛选出HBeAg阳性/抗-HBe阴性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性各20例进行斑点杂交和序列测定。
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二、斑点杂交检测HBV前C区基因变异
HBeAg阳性/抗-HBe阴性组19例M0杂交阳性，表示未见突变；而HBeAg阴性/抗-HBe阳性组仅1例M0杂交阳性，6例M1、4例M2、5例M1+M2杂交阳性，表示在1896位和1899位存在点突变，M0+M1和M0+M2杂交均阳性各1例，表示血清中部分病毒存在1点或2点突变，前组1例后组2例三种探针杂交均呈阴性，表示在探针内设计点突变外部位亦存在突变(表2)。
三、PCR产物直接测序
为进一步证实点突变探针杂交结果，用M1杂交阳性PCR产物直接测序，可以看出1896位核苷酸G变为A，导致原有的色氨酸密码子(TGG)变成终止密码子(TAG)(附图)，同时发现1837位核苷酸A变为G，使原CTA变成CTG。
表2 不同寡核苷酸探针斑点杂交结果(例) 寡核苷酸探针
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HBeAg(+)/抗-HBe(-)
HBeAg(-)/抗-HBe(+)
M0
19
1
M1
0
6
M2
0
4
M0+M1
0
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1
M0+M2
0
1
M1+M2
0
5
None
1
2
合 计
20
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附图 HBV前C区终止密码
讨 论
传统的观点认为感染HBV后血清HBeAg阳性提示病毒复制活跃，传染性强，而HBeAg转换为抗-HBe后则与之相反。但近年的研究发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性患者有慢性化、重症化趋向[1～3]。1987年以来相继报道在慢性肝炎，重症肝炎及肝癌患者中发现存在HBV变异株，最常见的变异株为前C区1896位核苷酸G突变为A，出现终止密码，从而导致HBeAg不能表达，而病毒仍在持续复制，造成肝损害，也有部分变异株发生多点突变[4～9]。我们发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性组17例在1896位核苷酸G变为A，使编码色氨酸的密码子(TGG)变为终止密码子(TAG)，其中10例除在1896位点突变外，同时在1899位核苷酸G变为A，使编码的甘氨酸变为天冬氨酸，1例未见突变；而HBeAg阳性/抗-HBe阴性组19例未发现突变，前组2例后组1例3种探针杂交均呈阴性，推测在探针内设计点突变以外的部位亦有突变，有待深入研究。为证实点突变探针杂交结果，进一步用M1杂交阳性的PCR产物直接测序，同样发现1896位核苷酸G突变为A，同时在1837位亦存在点突变，提示HBV前C区基因存在多位点突变。
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HBV DNA C基因编码2种蛋白质：非结构性分泌蛋白(HBeAg)和核衣蛋白(HBcAg)，C基因从2个不同的密码子(ATG)开始转译，这2个密码子被编码29个氨基酸残基的87个核苷酸分隔，称前C区，从第1个(ATG)开始转译产生HBeAg的前质蛋白，并以氨基和羟基末端同时分泌的形式产生17×103d的HBeAg。因此，分泌型HBeAg的产生与前C区有关。近年的研究和本研究均证实，HBV前C区基因变异产生终止密码，使HBeAg不能表达，但病毒本身复制并不受影响[10，11]。有学者发现HBV前C区基因变异90%～97%存在于HBV DNA阳性/HBeAg阴性的慢性乙肝患者中[12]。Omata等[7]
报道急、慢性重症HBV DNA阳性/抗-HBe阳性乙型肝炎78%发生前C区基因变异。也有学者在肝癌活检标本中发现了这种突变病毒基因[8，9]。我们发现HBeAg阴性/抗-HBe阳性慢性肝炎、LC、CFH患者中85%发生前C区基因变异。可见在我国HBV DNA阳性/抗-HBe阳性肝炎患者中部分发展成慢性肝炎或LC，甚至加重成CFH，很可能是由于前C区基因在体内发生变异，也可能存在这川变异株的传播或变异株的野生株混合感染。
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关于缺陷型HBeAg前C区基因变异株在肝细胞损伤中的机制，尚未完全清楚，可能是：(1)由于前C区点突变使HBV的致病性发生改变，因为新的终止密码的产生使前C肽被截短，这种截短了的前C肽可引起直接的致细胞病变作用，导致肝细胞损害。(2)缺陷型HBeAg变异株感染的肝细胞逃避宿主的免疫，不被机体免疫系统识别并杀伤，病毒不能被清除而产生慢性肝炎。(3)HBV前C区基因突变导致提前终止翻译的HBeAg抗原性改变，使之产生强烈的反应，导致肝细胞被杀伤。至于HBV变异的普遍性，立体结构及其临床后果有待进一步深入研究。
参考文献
1 Chu CM, Liaw YF, Sheen IS, et al. Sex difference in chronic hepatitis B virus infection: an appraisal based on the status of hepatitis e antigen and antibody. Hepatology. 1983,3:947.
, 百拇医药
2 倪贤珍，刘逢举，陈青锋，等斑点杂交直接检测血清HBV DNA在乙型肝炎诊断中的作用，中华传染病杂志，1987，5：28。
3 李绍白，杨大国，唐望先等，慢性乙型肝炎患者与无症状HBeAg携带者血清乙型肝炎病毒樗的检测与随访，中华传染病杂志，1986，4：84。
4 Carman WF,Jacyna MR, Hadziyannis S, et al Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989,2:588.
5 Brunetto MR, Stemler M, Bonino F, et al, A new hepatitis B virus strain in patients with severe anti-HBe positive chronic hepatitis B J hepatol, 1990,10:258.
, 百拇医药
6 Liang TJ, Hasegawa K, Rimon N, et al, A hepatitis B virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis. N Eng J Med, 1991,324:1705.
7 Omata M, Ehata T, Yokosuda O, et al, Mutation in the precore region of hepatitis B virus DNA in patients with fulminant and severe hepatitis. N Eng J Med, 1991,18:95.
8 陈子平，闻玉梅，顾建人等，肝癌组织内乙型肝炎病毒基因组前C区终止密码的发现，上海医科大学学报，1991，18：95。
9 Poppeer H, Shafritz DA, Hoofnagle JH, Relation of the hepatitis B virus carrier state to hepatocelluar carcinoma. Hepatology, 1987,7:764.
, 百拇医药
10 王宇，陶其敏，乙型肝炎病毒前C区基因点突变阻止分泌型e抗原产生，中华微生物学和免疫学杂志，1991，11：73。
11 Fiordalisi G, Cariani E, Mantero G, et al. Highgenomic variability in the Pre-c region of hepatitis B virus in anti-HBe, HBV DNA positive chronic hepatitis, J Med virol, 1990,31:297.
12 Okamoto H, Yotsumoto S, Akahane Y, et al Hepatitis B virus with precore region defects prevail in persistently infected hosts along with seroconversion to the antibody against e antigen J Virol,1990,64:1298., http://www.100md.com