内皮细胞脂质过氧化损伤对单核细胞粘附与内皮下穿入的影响
作者：洪伟 陈铁镇
单位：110001 沈阳，中国医科大学实验病理学研究室
关键词：内皮；单核细胞；过氧化脂质；动脉粥样硬化
中华医学杂志940411.htm
摘要 将处理后的人羊膜夹在改进的Boyden小室中间，于羊膜绒毛膜面培养人血管内皮细胞，建立了稳定的血管内膜培养模型。以巯基氧化剂联胺作用于内皮细胞，引发细胞过氧化脂质蓄积与脂质过氧化损伤。此内皮细胞损伤能增加单核细胞对内皮细胞的粘附和内皮下穿入；单核细胞主要粘附于内皮细胞间隙与受损伤细胞表面；在内皮细胞剥脱区域穿入内皮下的单核细胞较非剥脱区域为多。结果提示，内皮细胞脂质过氧化损伤通过增加单核细胞的粘附与内皮下穿入而在动脉粥样硬化发生中起重要作用。
近年实验表明，过氧化脂质(LPO)可引起血管内皮细胞形态损伤与功能障碍，促进和加重动物动脉粥样硬化(AS)病变形成[1]。但其机制尚有待进一步阐明。本实验采用改进的血管内膜培养模型，以巯基氧化剂联胺作用于内皮细胞，研究内皮细胞脂质过氧化损伤对单核细胞粘附与内皮下穿入的影响，旨在进一步探讨AS的发病机制，为防治AS提供实验依据。
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材料及方法
1.血管内膜培养模型的建立：取新鲜人羊膜，剥离绒毛膜，于0.25mol/L的NH4OH中浸泡2小时，刮去上皮细胞层。将处理后的羊膜与孔径5μm合成纤维素酯微孔滤膜夹在本研究室改进的Boyden小室中间，羊膜绒毛膜面向上，滤膜位于羊膜下。将小室置于培养皿内，于羊膜绒毛膜面培养人脐静脉内皮细胞。下室加培养液使之与上室液面持平。内皮细胞培养至融合状态即得血管内膜培养模型(图1)。
2.单核细胞的分离、鉴定与51Cr标记：取人静脉血，梯度离心分离单个细胞，再通过单核细胞附壁特性分离出单核细胞。经姬姆萨与非特异性酯酶染色，确定所得单核细胞纯度大于80%，并经台盼蓝拒染试验，测得细胞存活率大于90%。将部分单核细胞悬液与Na51CrO4溶液混合，振荡，孵育60分钟后离心，沉淀物以Hanks液(含牛血清白蛋白1mg/ml)洗涤，并以Hanks液制成51Cr标记的单核细胞悬液。调整单核细胞浓度至106个/ml。
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A：上室 B：液面 C：内孔细胞层 D：羊膜 E：孔径5μm微孔滤膜 F：下室 G：培养皿
图1 血管内膜培养模型示意图
3.实验分组：培养至融合状态的内皮细胞分为对照组与实验组。对照组加RPMI-1640培养液，实验组加联胺浓度分别为0.01×10-4、0.1×10-4及1.0×10-4mol/L的RPMI-1640培养液，培养60分钟后做如下实验。
4.过氧化脂质含量及前列环素(PGI2)含量的测定：内皮细胞及其培养液中LPO含量测定，采用改进的八木TBA法，测定LPO的代谢终产物丙二醛(MDA)的含量[1]，以nmol/孔表示。内皮细胞产生的PGI2含量测定，取培养液，以放免法测定PGI2的稳定代谢产物6-Keto-PGF1α含量，以“ng/孔”表示。
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5.单核细胞内皮下穿入率的测定：利用血管内膜培养模型，上室加单核细胞Hanks悬液0.1ml，孵育120分钟后，以Russo法测定单核细胞内皮下穿入率[2]。
6.形态学观察：(1)光镜观察：对培养于羊膜上的内皮细胞行AgNO3染色，观察内皮细胞损伤及单核细胞粘附状况。(2)扫描电镜观察。
7.单核细胞粘附率的测定：将内皮细胞培养于24孔培养板内，每孔加51Cr标记的单核细胞Hanks悬液0.1ml，孵育30分钟，以Walther法测定单核细胞对内皮细胞的粘附率[3]。以百分比表示。
结 果
一、联胺对MDA与6-Keto-PGF1α含量的影响
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MDA含量随着培养液中联胺浓度的增加而增加，联胺浓度升至0.1×10-4mol/L与1.0×10-4mol/L时,MDA含量分别为13.2±0.6nmol/孔及13.5±0.8nmol/孔；而对组照MDA含量则为6.6±0.4nmol/孔。两组数据比较，均P<0.01。6-Keto-PGF1α含量随着联胺浓度增加而降低，当联胺浓度升至1.0×10-4mol/L时，6-Keto-PGF1α含量为44±6ng/孔，而对照组则为62±9ng/孔，P<0.01。
二、形态学观察
1.AgNO3染色、光镜观察：对照组表现为内皮细胞呈融合状态，细胞为多角形，呈单层“铺路石”样排列。细胞间的黑色银染线清晰、较细、连续。未见内皮细胞下羊膜成分露出。在细胞边缘或间隙处，见少量单核细胞粘连(图2)。联胺浓度0.1×10-4mol/L组，内皮细胞单层仍保持完整，但细胞边缘或间隙处粘附的单核细胞明显增多(图3)。联胺浓度升至1.0×10-4mol/L时，内皮细胞收缩，间隙开大，银染线模糊不清，有成片内皮细胞脱失。损伤的内皮细胞表面见较多单核细胞粘附。
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2.电镜观察：对照组表现为内皮细胞呈多角形，表面有较多微绒毛，呈单层排列，融合较好，未见羊膜成分露出，罕见单核细胞粘附(图4)。联胺浓度0.1×10-4mol/L组，内皮细胞单层仍保持完整，但细胞表面布满大小不等泡状结构(质膜泡形成)，偶见内皮细胞轻度收缩。于内皮细胞表面可见单核细胞粘附(图5)。在内皮细胞间隙部位，有单核细胞陷入，呈穿入趋势(图6)。联胺浓度升至1.0×10-4mol/L时，内皮细胞剧烈收缩，成片脱失，露出下面的羊膜成分，较多单核细胞穿入羊膜(图7)。
三、单核细胞对内皮细胞的粘附率及穿入率
单核细胞粘附率随着培养液中联胺浓度的增加而升高。联胺为0.1×10-4mol/L时，粘附率为35.1±2.8%，对照组则为28.7±1.3%，P<0.01。
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单核细胞穿入率随着联胺浓度的增加而升高。联胺为0.1×10-4mol/L与1.0×10-4mol/L时，穿入率明显高于对照组P<0.01。
讨 论
近年来，LPO与AS的关系颇受重视。内皮细胞脂质过氧化损伤可促进和加重动物AS病变形成[1]。在高胆固醇血症动物，血管最早出现的反应是单核细胞粘附于血管内皮，随后通过细胞间隙穿入内膜，在AS病变发生中起重要作用[4]。研究内皮细胞脂质过氧化损伤对单核细胞粘附与内皮下穿入的影响，可进一步探讨AS发生的可能机制。
联胺可促进内皮细胞脂质过氧化过程[1]。本实验表明，一定浓度的联胺可引发内皮细胞LPO蓄积，引起脂质过氧化损伤，如PGI2合成降低、细胞收缩、质膜泡形成、细胞剥脱等。内皮细胞脂质过氧化损伤可增加单核细胞的粘附与内皮下穿入。单核细胞多粘附于内皮细胞间隙与受损伤细胞表面。内皮细胞损伤加重，单核细胞粘附与穿入随之增加。可见，正常的完整的内皮层在防止单核细胞粘附与穿入方面起重要作用。
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单核细胞粘附于内皮并穿入内皮下的机制十分复杂，受多种因素影响。本实验提示内皮细胞脂质过氧化损伤引起的单核细胞粘附与穿入增加可能与下述因素有关：(1)内皮细胞损伤后间隙开大，单核细胞易于通过间隙进入内皮下。Tobias等[5]发现，内皮下基质如弹性蛋白、层粘连素(laminin)等成分可引起单核细胞粘附。实验中单核细胞于内皮细胞间隙处粘附较多可能与此有关；(2)与内皮细胞PGI2合成降低有关。Duffey等[6]发现，PGI2可抑制上皮细胞层的细胞间通透性。本实验内皮细胞损伤后PGI2合成降低，可能会增加细胞间通透性，使单核细胞易于穿入到内皮下层。(3)本实验表明，脂质过氧化损伤内皮细胞可产生单核细胞趋化物质(另文发表)。单核细胞趋化因子除可促进单核细胞做趋化运动外，还可以促进其在内皮细胞上的粘附[7]。另外，有实验表明，经最小量氧化修饰LDL(minimally modified LDL)处理的内皮细胞上，单核细胞粘附增加[8]。被激活的内皮细胞表面，出现可与单核细胞特异性结合的蛋白粘附分子(特别是VCAM-1)[9]。内皮细胞脂质过氧化损伤，亦有可能通过细胞表面出现可与单核细胞特异性结合的物质，使单核细胞粘附增加。
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总之，内皮细胞脂质过氧化损伤引起的单核细胞粘附与内皮下穿入增多，可能是早期AS病变形成的重要过程。
参 考 文 献
1.陈铁镇,董玉兰,杨向红等.内皮细胞脂质过氧化损伤与动脉粥样硬化.电子显微学报,1991, 4 : 393.
2.Russo RG, Liotta LT, Thorgeirsson U, et al. Polymorphonuclear leukocyte migration through human ammion membrane. J Cell Biol, 1981, 91 : 459.
3.Walther BT, Ohman R, Roseman S. A quantitive assay for intercellular adhesion. Proc Nat Acad Sci USA, 1973, 70 : 1569.
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4.Joris I, Zand T, Nunnari J, et al. Studies on the pathogenesis of atherosclerosis I. Adhesion and emigration of mononuclear cells in the aorta of hypercholesterolemic rat. Am J Pthol, 1983, 113 : 341.
5.Tobias JW, Bern MM, Natland PA, et al. Monocyte adhesion to subendothelial components. Blood, 1987, 69 : 1265.
6.Duffey ME, Hainau B, Ho S, et al. Regulation of epithelial tight junction permeability by cyclic AMP. Nature, 1981, 294 : 451.
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7.Doherty DE, Haslett C, Tonnesen MG, et al. Human monocyte adherence : A primary effect of chemotactic factor on the monocyte to stimulate adherence to human endothelium. J Immunol, 1987, 138 : 1762.
8.Berliner JA, Territo MC, Sevanian A, et al. Minimally modified low density lipoprotein stimulate monocyte endothelial interactions. J Clin Invest, 1990, 85 : 1260.
9.Cybulsky MI, Gimbrone MA. Endothelial expression of a mononuclear leukocyte adhesion molecule during atherosclerosis. Science, 1991, 251 : 788.
(收稿：1993-03-09 修回：1993-12-15), 百拇医药
单位：110001 沈阳，中国医科大学实验病理学研究室
关键词：内皮；单核细胞；过氧化脂质；动脉粥样硬化
中华医学杂志940411.htm
摘要 将处理后的人羊膜夹在改进的Boyden小室中间，于羊膜绒毛膜面培养人血管内皮细胞，建立了稳定的血管内膜培养模型。以巯基氧化剂联胺作用于内皮细胞，引发细胞过氧化脂质蓄积与脂质过氧化损伤。此内皮细胞损伤能增加单核细胞对内皮细胞的粘附和内皮下穿入；单核细胞主要粘附于内皮细胞间隙与受损伤细胞表面；在内皮细胞剥脱区域穿入内皮下的单核细胞较非剥脱区域为多。结果提示，内皮细胞脂质过氧化损伤通过增加单核细胞的粘附与内皮下穿入而在动脉粥样硬化发生中起重要作用。
近年实验表明，过氧化脂质(LPO)可引起血管内皮细胞形态损伤与功能障碍，促进和加重动物动脉粥样硬化(AS)病变形成[1]。但其机制尚有待进一步阐明。本实验采用改进的血管内膜培养模型，以巯基氧化剂联胺作用于内皮细胞，研究内皮细胞脂质过氧化损伤对单核细胞粘附与内皮下穿入的影响，旨在进一步探讨AS的发病机制，为防治AS提供实验依据。
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材料及方法
1.血管内膜培养模型的建立：取新鲜人羊膜，剥离绒毛膜，于0.25mol/L的NH4OH中浸泡2小时，刮去上皮细胞层。将处理后的羊膜与孔径5μm合成纤维素酯微孔滤膜夹在本研究室改进的Boyden小室中间，羊膜绒毛膜面向上，滤膜位于羊膜下。将小室置于培养皿内，于羊膜绒毛膜面培养人脐静脉内皮细胞。下室加培养液使之与上室液面持平。内皮细胞培养至融合状态即得血管内膜培养模型(图1)。
2.单核细胞的分离、鉴定与51Cr标记：取人静脉血，梯度离心分离单个细胞，再通过单核细胞附壁特性分离出单核细胞。经姬姆萨与非特异性酯酶染色，确定所得单核细胞纯度大于80%，并经台盼蓝拒染试验，测得细胞存活率大于90%。将部分单核细胞悬液与Na51CrO4溶液混合，振荡，孵育60分钟后离心，沉淀物以Hanks液(含牛血清白蛋白1mg/ml)洗涤，并以Hanks液制成51Cr标记的单核细胞悬液。调整单核细胞浓度至106个/ml。
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A：上室 B：液面 C：内孔细胞层 D：羊膜 E：孔径5μm微孔滤膜 F：下室 G：培养皿
图1 血管内膜培养模型示意图
3.实验分组：培养至融合状态的内皮细胞分为对照组与实验组。对照组加RPMI-1640培养液，实验组加联胺浓度分别为0.01×10-4、0.1×10-4及1.0×10-4mol/L的RPMI-1640培养液，培养60分钟后做如下实验。
4.过氧化脂质含量及前列环素(PGI2)含量的测定：内皮细胞及其培养液中LPO含量测定，采用改进的八木TBA法，测定LPO的代谢终产物丙二醛(MDA)的含量[1]，以nmol/孔表示。内皮细胞产生的PGI2含量测定，取培养液，以放免法测定PGI2的稳定代谢产物6-Keto-PGF1α含量，以“ng/孔”表示。
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5.单核细胞内皮下穿入率的测定：利用血管内膜培养模型，上室加单核细胞Hanks悬液0.1ml，孵育120分钟后，以Russo法测定单核细胞内皮下穿入率[2]。
6.形态学观察：(1)光镜观察：对培养于羊膜上的内皮细胞行AgNO3染色，观察内皮细胞损伤及单核细胞粘附状况。(2)扫描电镜观察。
7.单核细胞粘附率的测定：将内皮细胞培养于24孔培养板内，每孔加51Cr标记的单核细胞Hanks悬液0.1ml，孵育30分钟，以Walther法测定单核细胞对内皮细胞的粘附率[3]。以百分比表示。
结 果
一、联胺对MDA与6-Keto-PGF1α含量的影响
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MDA含量随着培养液中联胺浓度的增加而增加，联胺浓度升至0.1×10-4mol/L与1.0×10-4mol/L时,MDA含量分别为13.2±0.6nmol/孔及13.5±0.8nmol/孔；而对组照MDA含量则为6.6±0.4nmol/孔。两组数据比较，均P<0.01。6-Keto-PGF1α含量随着联胺浓度增加而降低，当联胺浓度升至1.0×10-4mol/L时，6-Keto-PGF1α含量为44±6ng/孔，而对照组则为62±9ng/孔，P<0.01。
二、形态学观察
1.AgNO3染色、光镜观察：对照组表现为内皮细胞呈融合状态，细胞为多角形，呈单层“铺路石”样排列。细胞间的黑色银染线清晰、较细、连续。未见内皮细胞下羊膜成分露出。在细胞边缘或间隙处，见少量单核细胞粘连(图2)。联胺浓度0.1×10-4mol/L组，内皮细胞单层仍保持完整，但细胞边缘或间隙处粘附的单核细胞明显增多(图3)。联胺浓度升至1.0×10-4mol/L时，内皮细胞收缩，间隙开大，银染线模糊不清，有成片内皮细胞脱失。损伤的内皮细胞表面见较多单核细胞粘附。
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2.电镜观察：对照组表现为内皮细胞呈多角形，表面有较多微绒毛，呈单层排列，融合较好，未见羊膜成分露出，罕见单核细胞粘附(图4)。联胺浓度0.1×10-4mol/L组，内皮细胞单层仍保持完整，但细胞表面布满大小不等泡状结构(质膜泡形成)，偶见内皮细胞轻度收缩。于内皮细胞表面可见单核细胞粘附(图5)。在内皮细胞间隙部位，有单核细胞陷入，呈穿入趋势(图6)。联胺浓度升至1.0×10-4mol/L时，内皮细胞剧烈收缩，成片脱失，露出下面的羊膜成分，较多单核细胞穿入羊膜(图7)。
三、单核细胞对内皮细胞的粘附率及穿入率
单核细胞粘附率随着培养液中联胺浓度的增加而升高。联胺为0.1×10-4mol/L时，粘附率为35.1±2.8%，对照组则为28.7±1.3%，P<0.01。
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单核细胞穿入率随着联胺浓度的增加而升高。联胺为0.1×10-4mol/L与1.0×10-4mol/L时，穿入率明显高于对照组P<0.01。
讨 论
近年来，LPO与AS的关系颇受重视。内皮细胞脂质过氧化损伤可促进和加重动物AS病变形成[1]。在高胆固醇血症动物，血管最早出现的反应是单核细胞粘附于血管内皮，随后通过细胞间隙穿入内膜，在AS病变发生中起重要作用[4]。研究内皮细胞脂质过氧化损伤对单核细胞粘附与内皮下穿入的影响，可进一步探讨AS发生的可能机制。
联胺可促进内皮细胞脂质过氧化过程[1]。本实验表明，一定浓度的联胺可引发内皮细胞LPO蓄积，引起脂质过氧化损伤，如PGI2合成降低、细胞收缩、质膜泡形成、细胞剥脱等。内皮细胞脂质过氧化损伤可增加单核细胞的粘附与内皮下穿入。单核细胞多粘附于内皮细胞间隙与受损伤细胞表面。内皮细胞损伤加重，单核细胞粘附与穿入随之增加。可见，正常的完整的内皮层在防止单核细胞粘附与穿入方面起重要作用。
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单核细胞粘附于内皮并穿入内皮下的机制十分复杂，受多种因素影响。本实验提示内皮细胞脂质过氧化损伤引起的单核细胞粘附与穿入增加可能与下述因素有关：(1)内皮细胞损伤后间隙开大，单核细胞易于通过间隙进入内皮下。Tobias等[5]发现，内皮下基质如弹性蛋白、层粘连素(laminin)等成分可引起单核细胞粘附。实验中单核细胞于内皮细胞间隙处粘附较多可能与此有关；(2)与内皮细胞PGI2合成降低有关。Duffey等[6]发现，PGI2可抑制上皮细胞层的细胞间通透性。本实验内皮细胞损伤后PGI2合成降低，可能会增加细胞间通透性，使单核细胞易于穿入到内皮下层。(3)本实验表明，脂质过氧化损伤内皮细胞可产生单核细胞趋化物质(另文发表)。单核细胞趋化因子除可促进单核细胞做趋化运动外，还可以促进其在内皮细胞上的粘附[7]。另外，有实验表明，经最小量氧化修饰LDL(minimally modified LDL)处理的内皮细胞上，单核细胞粘附增加[8]。被激活的内皮细胞表面，出现可与单核细胞特异性结合的蛋白粘附分子(特别是VCAM-1)[9]。内皮细胞脂质过氧化损伤，亦有可能通过细胞表面出现可与单核细胞特异性结合的物质，使单核细胞粘附增加。
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参 考 文 献
1.陈铁镇,董玉兰,杨向红等.内皮细胞脂质过氧化损伤与动脉粥样硬化.电子显微学报,1991, 4 : 393.
2.Russo RG, Liotta LT, Thorgeirsson U, et al. Polymorphonuclear leukocyte migration through human ammion membrane. J Cell Biol, 1981, 91 : 459.
3.Walther BT, Ohman R, Roseman S. A quantitive assay for intercellular adhesion. Proc Nat Acad Sci USA, 1973, 70 : 1569.
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4.Joris I, Zand T, Nunnari J, et al. Studies on the pathogenesis of atherosclerosis I. Adhesion and emigration of mononuclear cells in the aorta of hypercholesterolemic rat. Am J Pthol, 1983, 113 : 341.
5.Tobias JW, Bern MM, Natland PA, et al. Monocyte adhesion to subendothelial components. Blood, 1987, 69 : 1265.
6.Duffey ME, Hainau B, Ho S, et al. Regulation of epithelial tight junction permeability by cyclic AMP. Nature, 1981, 294 : 451.
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7.Doherty DE, Haslett C, Tonnesen MG, et al. Human monocyte adherence : A primary effect of chemotactic factor on the monocyte to stimulate adherence to human endothelium. J Immunol, 1987, 138 : 1762.
8.Berliner JA, Territo MC, Sevanian A, et al. Minimally modified low density lipoprotein stimulate monocyte endothelial interactions. J Clin Invest, 1990, 85 : 1260.
9.Cybulsky MI, Gimbrone MA. Endothelial expression of a mononuclear leukocyte adhesion molecule during atherosclerosis. Science, 1991, 251 : 788.
(收稿：1993-03-09 修回：1993-12-15), 百拇医药