精细胞及血单个核细胞中丙型肝炎病毒RNA及基负链检测
作者：
刘芳华 田庚善 傅希贤
单位：100034北京医科大学第一医院感染疾病科
关键词：肝炎病毒，丙型；白细胞，单核；精细胞；聚合酶链反应
中华医学杂志940511.htm 摘要 用聚合酶链反应(PCR)方法对8例慢性丙型肝炎患者的血浆、外周血单个核细胞(PBMC)、精液和精细胞中的正链和负链丙型肝炎病毒(HCV)RNA进行检测，以了解HCV在肝外细胞中是否存在，是否复制。结果血浆中正链HCV RNA均阳性，而负链HCV RNA全部阴性；PBMC中正链HCV RNA阳性者5例，其中2例检出负链HCV RNA。在3例留取精液的患者中1例精液和精细胞中检出正链HCV RNA。精细胞末次洗液HCV RNA阴性，精细胞负链HCVRNA阴性。上述结果提示：(1)血浆中可能仅有正链HCVRNA存在；(2)HCV可在PBMC中存在，并可能在其中复制；(3)精液中有HCV存在，因此通过性交传播丙型肝炎的可能性确实存在，但HCV可能不在精细胞中复制。
, 百拇医药
丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒[1]，其复制过程不详。HCV可能为黄病毒科(flaviviridae)一个成员，与瘟病毒属(pestiviruses)具亲缘关系[2]。而黄病毒与瘟病毒的复制首先需要合成负链RNA，然后以此为模板，合成正链RNA，这样病毒得以复制[3]。1992年Takehara等[4]在慢性丙型肝炎患者肝组织中检出负链HCVRNA，说明HCV也是通过负链RNA中间体进行复制的。在组织细胞中检出负链HCVRNA则提示HCV在该组织细胞复制，外周血单个核细胞(PBMC)中是否有负链HCVRNA存在还无定论[4，5]。我们用聚合酶链反应(PCR)方法对慢性丙型肝炎患者的血浆、PBMC、精液、精细胞中的正链和负链HCVRNA进行了检测，以了解HCV是否在这些肝外细胞中存在和复制，并探讨其传播途径。
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资料及方法
一、标本采集
1.慢性丙型肝炎患者8例，年龄24-63岁。男7例，女3例。
2.取肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分层液获得PBMC，用Hanks液洗4遍，留取PBMC末次洗涤液待检。PBMC按每份l×105个分装，-20℃保存待检。
3. 人工排精获得精液，置4℃8小时充分液化。离心分离出精液，用生理盐水洗涤精细胞5遍，留取末次洗涤液。分装精细胞，-20℃保存待检。
二、检测方法
1.抗-HCV检测用第二代抗-HCV检测试剂盒(上海实业科华生物技术有限公司产品)检测。
, http://www.100md.com
2.HCV RNA检测根据HCV基因组5'非编码区设计两对引物[6]，进行套式PCR。引物由中国科学院微生物研究所合成：
外 1：(-324～-304)顺义5'-GGC GAC ACT CCA CCA TAG ATC，外 2：(-1～-21)反义5'- GGT GCA CGG TCT ACG AGA CCT，内 1：(-294～-275)顺义5'-TGA GGA ACT ACT GTCTTC AC，内 2：(-76～-96)反义5'- ACT GCT AGC CGA GTA GTG TTG。
(1)HCV RNA的提取：被检测标本50μl加DS[7]400μl，室温下1小时酚氯仿提取1次，氯仿提取1次，乙醇沉淀，提取物加焦碳酸二乙酯(DEPC)水15μl；RNA酶抑制剂(RNasin)15单位(华美生物工程公司)。(2)逆转录： 5×AMV逆转录酶缓冲液4μl，10mmol/L脱氧核苷 三磷酸(dNTP)各1μl，20μ mol/L引物外11μl(此为检测负链时使用，检测正链HCVRNA则改用引物外4)，AMV逆转录酶(Pormega)2单位，RNA提取物11μl，反应体积20μl，液体石蜡加封后置42℃20分钟(逆转录)。100℃30分钟(灭活AMV逆转录酶)，反应管置于冷乙醇速冷。(3)第1次PCR：10×Taq酶缓冲液5μl，10mmol/L dNTP lpμl，20μmol/L引物外1、外2各1.5μl，水18μl，Taq酶2单位(华美)，上述试剂加于逆转录管中，反应体积50μl。依次置93℃l分钟， 50℃ 30秒，72℃l分钟30秒，循环30次。最后置72℃5分钟。(4)第2次PCR：10×Taq酶缓冲液5μl，dNTP 10mmol/L各1μl，20μmol/L引物内1、内2各1.5μl，水33.5μl，Taq酶2单位，第1次PCR产物5μl。反应体积50μl，循环时间，温度同第1次PCR。(5)电泳：取第二次PCR产物。10 μl，经1.2%琼脂糖电泳，阳性产物为219bp。(6)质量控制：正链与负链HCV RNA检测同时进行，作为平行对照。每次实验均各设2份阴性，2份阳性对照，所有结果均经重复证实。
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结 果
一、抗-HCV检测
所有8例标本血浆抗-HCV均阳性。
二、正链与负链HCV RNA检测
8例慢性丙型肝炎患者血浆、PBMC、精液、精细胞正链与负链HCVRNA检测结果见附表。
末次洗涤液检测PBMC和精细胞HCVRNA全部阴性。
附表 正链与负链丙型肝炎病毒RNA的PCR检测结果
例号
性别
血浆
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外周血单个核细胞
精液
精子
正链
负链
正链
负链
正链
负链
正链
负链
1
女
+
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-
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2
女
+
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3
女
+
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4
男
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+
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5
男
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6
男
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男
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+
+
8
男
+
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+
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+
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讨 论
一、血浆和PBMC中的HCV RNA
对于血浆和PBMC中负链HCVRNA的检测，文献报道结果截然相反。Takehara等[4]报道，血清、肝组织、PBMC中全部可测出正链HCVRNA，但负链HCVRNA仅能在肝组织内测出。而Zignego等[5]报道在血清和PBMC中均能测出负链HCVRNA，且正链和负链HCVRNA检测结果高度一致。
在逆转录过程中，如果标本中只有正链RNA，用下游引物(反义)进行逆转录，可以合成cDNA第1链，进而可进行PCR扩增。如果换用上游引物(顺义)做逆转录，就无法合成DNA第1链，以后的PCR也就无法进行。如标本中有负链HCVRNA存在，换用上游顺义引物后，这时对于负链RNA来说就是反义引物，可以合成cDNA第1链，进而PCR扩增出所需片段，这反映了标本中有负链HCV RNA存在。这是负链检测的原理。在逆转录之后的PCR反应中，上游顺义引物和下游反义引物是同时加入的，如果在PCR反应体系中含有未被完全灭活的逆转录酶，那么，只要有模板存在，不管是正链还是负链，都可以被逆转录酶用作模板，在大量存在的上游顺义或下游反义引物的引导下合成cDNA第1链，这时将无法鉴别原始模板是正链还是负链。由此可见，负链HCVRNA检测的关键是逆转录酶的灭活。
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Fong等[3]的逆转录酶灭活方法，即需95℃20分钟，而Takehara等[4]证明逆转录酶的完全灭活需沸水浴30分钟， Fong等[3]提到，为了排除逆转录酶灭活不全的可能，在逆转录时不加引物作为对照，实际上这种对照是不能除外逆转录酶剩余活性对负链HCVRNA检测的影响的，因为正如前述，在随后的PCR扩增中，反应体系中有大量的顺义和反义引物存在。
本组8例慢性丙型肝炎患者血浆抗-HCV和正链HCVRNA均阳性，但负链HCV RNA均阴性，与Takehara等[4]的结果一致，我们倾向于认为这个结果更为可靠。提示在血浆中可能仅有正链HCV RNA存在。
在8例慢性丙型肝炎患者中，有5例PBMC正链HCVRNA阳性，其中仅有2例负链HCVRNA阳性，这个结果说明HCV存在于PBMC内，而且可能在PBMC中复制。PBMC中检出正链和负链HCVRNA是血清中的HCV感染PBMC的结果，还是来源于PBMC的母细胞，这些问题有待进一步研究。
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二、精细胞中的HCVRNA
精液中检出HCVRNA已有报道[8]，但精细胞中是否有HCV尚不清楚。检测本组的3例男性慢性肝炎患者所留取的精液，结果其中1例精液和精细胞HCVRNA阳性。提示通过性交传播丙型肝炎的可能性是确实存在的。精细胞经洗涤5遍，洗涤液中已测不出HCVRNA，而在精细胞仍能测出HCV RNA，提示HCV可能存在干精细胞内，或者是吸附在精细胞表面不被洗去，精细胞负链HCVRNA阴性，提示如果HCV确实存在于精细胞内的话，可能也不在精细胞中复制。HCV在精细胞中存在，对丙型肝炎的垂直传播是否有影响值得深入研究。
参 考 文 献
1.Choo QL, Weiner AJ, Overby LR, et al. Hepatitis C virus: the major causative agent of viral non-A, non-B hepatitis. Brit Med Bull, 1990, 46 : 423.
, 百拇医药
2.Houghton M, Weiner AJ, Han JG, et al. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implication for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology, 1991, 14 : 381.
3.Fong TL, Shindo M, Feinstone SM, et al. Detection of replicative intermediates of hepatitis C viral RNA in liver and serum oof patients with chronic hepatitis C. J Clin Inv, 1991, 88 : 1058.
4.Takehara T, Hayashi N, Mita E, et al. Detection of the minus strand of hepatitis C virus RNA by reverse transcription and polymerase chain reaction: implication for hepatitis C virus replication in infected tissue. Hepatology, 1992, 15 : 387.
, 百拇医药
5.Zignego AL, Macchia D, Monti M, et al. Infection of peripheral mononuclear blood cells byhepatitis C virus. J Hepatology, 1992, 15 : 382.
6.Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88 : 2451.
7.Chomczyski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987, 162 : 156.
8.Liou TC, Chang TT, Young KC, et al. Detection of HCV RNA in saliva, urine, seminal fluid and ascites. J Med Virol, 1992, 37 : 197.
(收稿：1993-06-01 修回：1994-01-25), http://www.100md.com
刘芳华 田庚善 傅希贤
单位：100034北京医科大学第一医院感染疾病科
关键词：肝炎病毒，丙型；白细胞，单核；精细胞；聚合酶链反应
中华医学杂志940511.htm 摘要 用聚合酶链反应(PCR)方法对8例慢性丙型肝炎患者的血浆、外周血单个核细胞(PBMC)、精液和精细胞中的正链和负链丙型肝炎病毒(HCV)RNA进行检测，以了解HCV在肝外细胞中是否存在，是否复制。结果血浆中正链HCV RNA均阳性，而负链HCV RNA全部阴性；PBMC中正链HCV RNA阳性者5例，其中2例检出负链HCV RNA。在3例留取精液的患者中1例精液和精细胞中检出正链HCV RNA。精细胞末次洗液HCV RNA阴性，精细胞负链HCVRNA阴性。上述结果提示：(1)血浆中可能仅有正链HCVRNA存在；(2)HCV可在PBMC中存在，并可能在其中复制；(3)精液中有HCV存在，因此通过性交传播丙型肝炎的可能性确实存在，但HCV可能不在精细胞中复制。
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丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒[1]，其复制过程不详。HCV可能为黄病毒科(flaviviridae)一个成员，与瘟病毒属(pestiviruses)具亲缘关系[2]。而黄病毒与瘟病毒的复制首先需要合成负链RNA，然后以此为模板，合成正链RNA，这样病毒得以复制[3]。1992年Takehara等[4]在慢性丙型肝炎患者肝组织中检出负链HCVRNA，说明HCV也是通过负链RNA中间体进行复制的。在组织细胞中检出负链HCVRNA则提示HCV在该组织细胞复制，外周血单个核细胞(PBMC)中是否有负链HCVRNA存在还无定论[4，5]。我们用聚合酶链反应(PCR)方法对慢性丙型肝炎患者的血浆、PBMC、精液、精细胞中的正链和负链HCVRNA进行了检测，以了解HCV是否在这些肝外细胞中存在和复制，并探讨其传播途径。
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资料及方法
一、标本采集
1.慢性丙型肝炎患者8例，年龄24-63岁。男7例，女3例。
2.取肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分层液获得PBMC，用Hanks液洗4遍，留取PBMC末次洗涤液待检。PBMC按每份l×105个分装，-20℃保存待检。
3. 人工排精获得精液，置4℃8小时充分液化。离心分离出精液，用生理盐水洗涤精细胞5遍，留取末次洗涤液。分装精细胞，-20℃保存待检。
二、检测方法
1.抗-HCV检测用第二代抗-HCV检测试剂盒(上海实业科华生物技术有限公司产品)检测。
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2.HCV RNA检测根据HCV基因组5'非编码区设计两对引物[6]，进行套式PCR。引物由中国科学院微生物研究所合成：
外 1：(-324～-304)顺义5'-GGC GAC ACT CCA CCA TAG ATC，外 2：(-1～-21)反义5'- GGT GCA CGG TCT ACG AGA CCT，内 1：(-294～-275)顺义5'-TGA GGA ACT ACT GTCTTC AC，内 2：(-76～-96)反义5'- ACT GCT AGC CGA GTA GTG TTG。
(1)HCV RNA的提取：被检测标本50μl加DS[7]400μl，室温下1小时酚氯仿提取1次，氯仿提取1次，乙醇沉淀，提取物加焦碳酸二乙酯(DEPC)水15μl；RNA酶抑制剂(RNasin)15单位(华美生物工程公司)。(2)逆转录： 5×AMV逆转录酶缓冲液4μl，10mmol/L脱氧核苷 三磷酸(dNTP)各1μl，20μ mol/L引物外11μl(此为检测负链时使用，检测正链HCVRNA则改用引物外4)，AMV逆转录酶(Pormega)2单位，RNA提取物11μl，反应体积20μl，液体石蜡加封后置42℃20分钟(逆转录)。100℃30分钟(灭活AMV逆转录酶)，反应管置于冷乙醇速冷。(3)第1次PCR：10×Taq酶缓冲液5μl，10mmol/L dNTP lpμl，20μmol/L引物外1、外2各1.5μl，水18μl，Taq酶2单位(华美)，上述试剂加于逆转录管中，反应体积50μl。依次置93℃l分钟， 50℃ 30秒，72℃l分钟30秒，循环30次。最后置72℃5分钟。(4)第2次PCR：10×Taq酶缓冲液5μl，dNTP 10mmol/L各1μl，20μmol/L引物内1、内2各1.5μl，水33.5μl，Taq酶2单位，第1次PCR产物5μl。反应体积50μl，循环时间，温度同第1次PCR。(5)电泳：取第二次PCR产物。10 μl，经1.2%琼脂糖电泳，阳性产物为219bp。(6)质量控制：正链与负链HCV RNA检测同时进行，作为平行对照。每次实验均各设2份阴性，2份阳性对照，所有结果均经重复证实。
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结 果
一、抗-HCV检测
所有8例标本血浆抗-HCV均阳性。
二、正链与负链HCV RNA检测
8例慢性丙型肝炎患者血浆、PBMC、精液、精细胞正链与负链HCVRNA检测结果见附表。
末次洗涤液检测PBMC和精细胞HCVRNA全部阴性。
附表 正链与负链丙型肝炎病毒RNA的PCR检测结果
例号
性别
血浆
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外周血单个核细胞
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讨 论
一、血浆和PBMC中的HCV RNA
对于血浆和PBMC中负链HCVRNA的检测，文献报道结果截然相反。Takehara等[4]报道，血清、肝组织、PBMC中全部可测出正链HCVRNA，但负链HCVRNA仅能在肝组织内测出。而Zignego等[5]报道在血清和PBMC中均能测出负链HCVRNA，且正链和负链HCVRNA检测结果高度一致。
在逆转录过程中，如果标本中只有正链RNA，用下游引物(反义)进行逆转录，可以合成cDNA第1链，进而可进行PCR扩增。如果换用上游引物(顺义)做逆转录，就无法合成DNA第1链，以后的PCR也就无法进行。如标本中有负链HCVRNA存在，换用上游顺义引物后，这时对于负链RNA来说就是反义引物，可以合成cDNA第1链，进而PCR扩增出所需片段，这反映了标本中有负链HCV RNA存在。这是负链检测的原理。在逆转录之后的PCR反应中，上游顺义引物和下游反义引物是同时加入的，如果在PCR反应体系中含有未被完全灭活的逆转录酶，那么，只要有模板存在，不管是正链还是负链，都可以被逆转录酶用作模板，在大量存在的上游顺义或下游反义引物的引导下合成cDNA第1链，这时将无法鉴别原始模板是正链还是负链。由此可见，负链HCVRNA检测的关键是逆转录酶的灭活。
, http://www.100md.com
Fong等[3]的逆转录酶灭活方法，即需95℃20分钟，而Takehara等[4]证明逆转录酶的完全灭活需沸水浴30分钟， Fong等[3]提到，为了排除逆转录酶灭活不全的可能，在逆转录时不加引物作为对照，实际上这种对照是不能除外逆转录酶剩余活性对负链HCVRNA检测的影响的，因为正如前述，在随后的PCR扩增中，反应体系中有大量的顺义和反义引物存在。
本组8例慢性丙型肝炎患者血浆抗-HCV和正链HCVRNA均阳性，但负链HCV RNA均阴性，与Takehara等[4]的结果一致，我们倾向于认为这个结果更为可靠。提示在血浆中可能仅有正链HCV RNA存在。
在8例慢性丙型肝炎患者中，有5例PBMC正链HCVRNA阳性，其中仅有2例负链HCVRNA阳性，这个结果说明HCV存在于PBMC内，而且可能在PBMC中复制。PBMC中检出正链和负链HCVRNA是血清中的HCV感染PBMC的结果，还是来源于PBMC的母细胞，这些问题有待进一步研究。
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二、精细胞中的HCVRNA
精液中检出HCVRNA已有报道[8]，但精细胞中是否有HCV尚不清楚。检测本组的3例男性慢性肝炎患者所留取的精液，结果其中1例精液和精细胞HCVRNA阳性。提示通过性交传播丙型肝炎的可能性是确实存在的。精细胞经洗涤5遍，洗涤液中已测不出HCVRNA，而在精细胞仍能测出HCV RNA，提示HCV可能存在干精细胞内，或者是吸附在精细胞表面不被洗去，精细胞负链HCVRNA阴性，提示如果HCV确实存在于精细胞内的话，可能也不在精细胞中复制。HCV在精细胞中存在，对丙型肝炎的垂直传播是否有影响值得深入研究。
参 考 文 献
1.Choo QL, Weiner AJ, Overby LR, et al. Hepatitis C virus: the major causative agent of viral non-A, non-B hepatitis. Brit Med Bull, 1990, 46 : 423.
, 百拇医药
2.Houghton M, Weiner AJ, Han JG, et al. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implication for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology, 1991, 14 : 381.
3.Fong TL, Shindo M, Feinstone SM, et al. Detection of replicative intermediates of hepatitis C viral RNA in liver and serum oof patients with chronic hepatitis C. J Clin Inv, 1991, 88 : 1058.
4.Takehara T, Hayashi N, Mita E, et al. Detection of the minus strand of hepatitis C virus RNA by reverse transcription and polymerase chain reaction: implication for hepatitis C virus replication in infected tissue. Hepatology, 1992, 15 : 387.
, 百拇医药
5.Zignego AL, Macchia D, Monti M, et al. Infection of peripheral mononuclear blood cells byhepatitis C virus. J Hepatology, 1992, 15 : 382.
6.Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88 : 2451.
7.Chomczyski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987, 162 : 156.
8.Liou TC, Chang TT, Young KC, et al. Detection of HCV RNA in saliva, urine, seminal fluid and ascites. J Med Virol, 1992, 37 : 197.
(收稿：1993-06-01 修回：1994-01-25), http://www.100md.com