衰老对大鼠脑与垂体细胞因子基因表达的影响
作者：黄 诚 陈汉平 程介士 马 兰
单位：200030 上海市针灸经络研究所(黄 诚、陈汉平)；上海医科大学医学神经生物学国家重点实验室(程介士、马 兰)
关键词：
中华医学杂志971120 老年期免疫细胞白细胞介素1(IL-1)与白细胞介素6(IL-6)基础分泌能力与青年期无差异，但经丝裂原刺激后其分泌能力随增龄而增加[1]。老年大鼠血管内皮细胞经细菌脂多糖(LPS)刺激后也较青年大鼠增加3.5倍[2]。我们应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术观察老年大鼠腹腔注射LPS后脑和垂体IL-1β与IL-6mRNA表达的变化。
一、材料与方法
1.动物与处理：21～22月龄(老年组)及4月龄(青年组)SD大鼠各8只购自上海中医药大学实验动物中心，大鼠处死前3、6、12、24小时分别腹腔注射LPS(美国Sigma公司)1mg/kg体重，大鼠断头处死，迅速分离各脑区，置液氮备用。
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2.RT-PCR检测：按参考文献[3]使用异硫氰酸胍/酚/氯仿抽提法提取总RNA，取1μg总RNA按逆转录药盒说明逆转录合成cDNA。引物根据参考文献[4]设计，三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)作为“看家基因”以监控RNA使用量，消除不同标本间加样误差。PCR扩增条件为：IL-1β；94℃预变性4分钟，94℃30秒，50℃45秒，72℃ 90秒，30个循环。IL-6、GAPDH：94℃预变性4分钟，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/ml)，100V电泳1小时，紫外灯下观察照相。
M：PCR标志：自上至下为1543、994、695、515、377、237bp；
1～4和5～8分别为青年与老年大鼠下丘脑、皮质、垂体和小脑
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图1 LPS注射6小时后老年大鼠脑与垂体IL-1β与IL-6mRNA的变化
二、结果
基础状态下老年大鼠海马见少量IL-1与IL-6 mRNA表达，而青年组大鼠各脑区均未见表达。图1显示大鼠经LPS注射6小时后，各脑区均有IL-1与 IL-6 mRNA表达，其中老年大鼠皮质、垂体、小脑表达量高于青年组，下丘脑则无差异。时间动力学观察表明，LPS注射3小时后，大鼠皮质IL-1与IL-6 mRNA已有表达，6～12小时则达到高峰，并持续到24小时，老年组与青年组变化相同，但老年组的表达量在各时间点均较青年组高(图2)。
M：PCR标志；1～4和5～8分别为青年与老年大鼠LPS注射后3、6、12、24小时
图2 LPS注射后大鼠皮质IL-1β与IL-6 mRNA时间动力学变化
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三、讨论
IL-1与IL-6等细胞因子均可在中枢神经系统内合成，参与神经损伤与再生、神经内分泌及学习记忆等生理功能，过量的细胞因子则可导致神经元死亡及胶质瘤形成。生理情况下，脑内细胞因子水平较低，通常难以检出。Ban等[5]应用RT-PCR仅在大鼠海马观察到IL-1β mRNA，而Gabellec等[6]则在皮质、海马、垂体、下丘脑及小脑等脑区均观察到IL-1α、β及受体拮抗剂mRNA表达，表明脑内细胞因子可能主要来自胶质细胞。由于胶质细胞的激活为Alzheimer′s病(AD)发病的重要环节之一，因此，胶质细胞细胞因子分泌能力可能随增龄而增高。本研究应用RT-PCR观察到老年组大鼠基础状态下仅在海马存在少量的IL-1β与IL-6 mRNA，下丘脑与皮质则未见其表达。LPS腹腔注射诱导大鼠急性炎症时，各脑区IL-1β与IL-6 mRNA均有表达，老年大鼠皮质、小脑及垂体均高于青年大鼠，而下丘脑则无明显变化。时间动力学观察表明，LPS刺激3小时后出现IL-1β与IL-6mRNA，6～12小时为表达高峰，24小时开始下降。老年大鼠在各时间点的表达量均高于青年大鼠，表明炎症或感染时，脑内细胞因子分泌能力在老年期增高。
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胶质细胞的激活与免疫应答的启动被认为是AD发病的重要过程，而引起这一系列变化的因素很可能是脑内随增龄而增高的弥散状的β-淀粉样蛋白、急慢性炎症刺激及应激、脑血管异常等因素。本实验应用LPS模拟急性炎症时脑内IL-1β与IL-6 mRNA出现增高，表明炎症可能是导致AD的因素之一。
参考文献
1 Riancho JA, Zarrabeitia MT, Amado JA, et al. Age-related differences in cytokine secretion. Gerontol, 1994; 40：8.
2 Belmin J, Bernard C, Corman B, et al. Increased production of tumor necrosis factor and interleukin-6 by arterial wall of aged rats. Am J Physiol, 1995; 268：H2288.
, 百拇医药
3 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroforme extraction. Anal Biochem, 1987, 162：156.
4 Murphy PG, Grondin J, Altares M, et al. Induction of interleukin-6 in axotomized sensory neurons. J Neurosci, 1995; 15：5130.
5 Ban E, Haour F, Lenstra R. Brain interleukin 1 gene expression induced by peripheral lipopolysaccharide administration. Cytokine, 1992; 4：48.
6 Gabellec M M, Griffais R, Fillion C, et al. Expression of interleukin 1α, interleukin 1β and interleukin 1 receptor antagonist mRNA in mouse brain: regulation by bacterial lipopolysaccharide (LPS) treatment.Mol Brain Res, 1995; 31：122.
(收稿：1996-12-18 修回：1997-06-11), http://www.100md.com
单位：200030 上海市针灸经络研究所(黄 诚、陈汉平)；上海医科大学医学神经生物学国家重点实验室(程介士、马 兰)
关键词：
中华医学杂志971120 老年期免疫细胞白细胞介素1(IL-1)与白细胞介素6(IL-6)基础分泌能力与青年期无差异，但经丝裂原刺激后其分泌能力随增龄而增加[1]。老年大鼠血管内皮细胞经细菌脂多糖(LPS)刺激后也较青年大鼠增加3.5倍[2]。我们应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术观察老年大鼠腹腔注射LPS后脑和垂体IL-1β与IL-6mRNA表达的变化。
一、材料与方法
1.动物与处理：21～22月龄(老年组)及4月龄(青年组)SD大鼠各8只购自上海中医药大学实验动物中心，大鼠处死前3、6、12、24小时分别腹腔注射LPS(美国Sigma公司)1mg/kg体重，大鼠断头处死，迅速分离各脑区，置液氮备用。
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2.RT-PCR检测：按参考文献[3]使用异硫氰酸胍/酚/氯仿抽提法提取总RNA，取1μg总RNA按逆转录药盒说明逆转录合成cDNA。引物根据参考文献[4]设计，三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)作为“看家基因”以监控RNA使用量，消除不同标本间加样误差。PCR扩增条件为：IL-1β；94℃预变性4分钟，94℃30秒，50℃45秒，72℃ 90秒，30个循环。IL-6、GAPDH：94℃预变性4分钟，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/ml)，100V电泳1小时，紫外灯下观察照相。
M：PCR标志：自上至下为1543、994、695、515、377、237bp；
1～4和5～8分别为青年与老年大鼠下丘脑、皮质、垂体和小脑
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图1 LPS注射6小时后老年大鼠脑与垂体IL-1β与IL-6mRNA的变化
二、结果
基础状态下老年大鼠海马见少量IL-1与IL-6 mRNA表达，而青年组大鼠各脑区均未见表达。图1显示大鼠经LPS注射6小时后，各脑区均有IL-1与 IL-6 mRNA表达，其中老年大鼠皮质、垂体、小脑表达量高于青年组，下丘脑则无差异。时间动力学观察表明，LPS注射3小时后，大鼠皮质IL-1与IL-6 mRNA已有表达，6～12小时则达到高峰，并持续到24小时，老年组与青年组变化相同，但老年组的表达量在各时间点均较青年组高(图2)。
M：PCR标志；1～4和5～8分别为青年与老年大鼠LPS注射后3、6、12、24小时
图2 LPS注射后大鼠皮质IL-1β与IL-6 mRNA时间动力学变化
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三、讨论
IL-1与IL-6等细胞因子均可在中枢神经系统内合成，参与神经损伤与再生、神经内分泌及学习记忆等生理功能，过量的细胞因子则可导致神经元死亡及胶质瘤形成。生理情况下，脑内细胞因子水平较低，通常难以检出。Ban等[5]应用RT-PCR仅在大鼠海马观察到IL-1β mRNA，而Gabellec等[6]则在皮质、海马、垂体、下丘脑及小脑等脑区均观察到IL-1α、β及受体拮抗剂mRNA表达，表明脑内细胞因子可能主要来自胶质细胞。由于胶质细胞的激活为Alzheimer′s病(AD)发病的重要环节之一，因此，胶质细胞细胞因子分泌能力可能随增龄而增高。本研究应用RT-PCR观察到老年组大鼠基础状态下仅在海马存在少量的IL-1β与IL-6 mRNA，下丘脑与皮质则未见其表达。LPS腹腔注射诱导大鼠急性炎症时，各脑区IL-1β与IL-6 mRNA均有表达，老年大鼠皮质、小脑及垂体均高于青年大鼠，而下丘脑则无明显变化。时间动力学观察表明，LPS刺激3小时后出现IL-1β与IL-6mRNA，6～12小时为表达高峰，24小时开始下降。老年大鼠在各时间点的表达量均高于青年大鼠，表明炎症或感染时，脑内细胞因子分泌能力在老年期增高。
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胶质细胞的激活与免疫应答的启动被认为是AD发病的重要过程，而引起这一系列变化的因素很可能是脑内随增龄而增高的弥散状的β-淀粉样蛋白、急慢性炎症刺激及应激、脑血管异常等因素。本实验应用LPS模拟急性炎症时脑内IL-1β与IL-6 mRNA出现增高，表明炎症可能是导致AD的因素之一。
参考文献
1 Riancho JA, Zarrabeitia MT, Amado JA, et al. Age-related differences in cytokine secretion. Gerontol, 1994; 40：8.
2 Belmin J, Bernard C, Corman B, et al. Increased production of tumor necrosis factor and interleukin-6 by arterial wall of aged rats. Am J Physiol, 1995; 268：H2288.
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3 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroforme extraction. Anal Biochem, 1987, 162：156.
4 Murphy PG, Grondin J, Altares M, et al. Induction of interleukin-6 in axotomized sensory neurons. J Neurosci, 1995; 15：5130.
5 Ban E, Haour F, Lenstra R. Brain interleukin 1 gene expression induced by peripheral lipopolysaccharide administration. Cytokine, 1992; 4：48.
6 Gabellec M M, Griffais R, Fillion C, et al. Expression of interleukin 1α, interleukin 1β and interleukin 1 receptor antagonist mRNA in mouse brain: regulation by bacterial lipopolysaccharide (LPS) treatment.Mol Brain Res, 1995; 31：122.
(收稿：1996-12-18 修回：1997-06-11), http://www.100md.com