胰岛素及丹参对体外培养成纤维细胞影响的实验研究△
作者：刘 敏1 彭明惺1 刘 铭1 陈曼玲2 李 3
单位：1 华西医科大学附属第一医院外科(四川成都，610041)；2 华西医科大学受体研究室；3 华西医科大学附属口腔医学院细胞培养室
关键词：胰岛素；丹参；伤口愈合；成纤维细胞
中国修复重建外科杂志980117 摘 要 为了探讨胰岛素、丹参在伤口愈合过程中对胶原合成与分解代谢的影响，应用人胚皮肤培养成纤维细胞，分设胰岛素组、丹参组及对照组，培养2，4和6天，观察细胞的生长情况。成纤维细胞生长曲线显示：胰岛素组高于对照组，对照组高于丹参组。细胞核分裂率三组分别为19.60‰，2.50‰和3.77‰。扫描电镜观察发现胰岛素组成纤维细胞周围及表面有大量纤维状物，丹参组成纤维细胞表面光滑，仅有少量纤维状物。认为，胰岛素对成纤维细胞增殖和胶原合成有促进作用，而丹参对成纤维细胞增殖和胶原合成则有抑制作用。
, 百拇医药
THE EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT OF INSULIN AND DANSHEN ON CULTURE OF FIBROBLAST IN VITRO/Liu Min, Peng Mingxing, Liu Ming et al. Department of Pediatric Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, P.R.China 610041
Abstract To investigate the effect of Insulin and Danshen on anabolism and catabolism of collagen during the healing of wound, fibroblast which was cultured from human embryonic skin were divided into 3 groups: Insulin group, Danshen group and contral group. Each group was cultured for 2,4 and 6 days, then the growth curve was established respectively. Results: ①the growth curve showed-Insulin group> control group> Danshen group. ②the rate of cell division in 3 groups was 19.6‰, 2.5‰, 3.77‰ respectively. ③the electron microscopic scanning showed that there was much of fibroid tissue surrounding the fibroblast cell in insulin group, but there was little fibroid tissue in Danshen group. The conclusion showed that insulin can accelerates proliferation of fibroblast and synthesis of collagen, but the effect of denshen was just on the contrary.
, 百拇医药
Key words Insulin Danshen Wound healing Fibroblast cell
成纤维细胞作为胶原纤维的合成场所，对伤口的正常愈合及异常愈合有重要影响。近年来，在许多领域对成纤维细胞的胶原合成和分解进行了研究[1]。陈学忠等[2]对丹参、桃仁等中药的抗纤维化作用也进行了基础和临床研究。有学者发现，胰岛素有成纤维细胞生长因子样作用。但胰岛素对体外培养成纤维细胞的生长及功能影响的实验研究尚较少。为探讨胰岛素及丹参在伤口愈合过程中对成纤维细胞的增殖和胶原合成及分解代谢的影响设计了本实验。
1 材料与方法
1.1 材料来源、主要试剂和仪器
人胚皮肤组织由华西医科大学组织胚胎学教研室提供。主要试剂有：199培养基(GIBCO公司制备)，小牛血清(华西生化制品厂)，丹参注射液(华西医科大学制药厂)，胰岛素(NOVO药厂)。主要仪器为：超净工作台，CO2孵箱，42型分光光度仪(BACKAN公司)及扫描电镜。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
在无菌条件下，取水囊引产的4月龄胎儿的前臂内侧皮肤组织，大小约为1 cm×1 cm×1 mm。在超净工作台上，用Hank's 缓冲液清洗3次～5次， 迅速剪成大小约1 mm×1 mm×1 mm的小块，移入细胞瓶中。加入含20%小牛血清的199培养基，密闭，37℃培养。4天后光镜下观察成纤维细胞生长和污染情况。细胞生长至满瓶后传代培养，待细胞进入对数生长期，将细胞分别接种，分组。每组12瓶，每瓶1.5×109个细胞。胰岛素组：在培养液中按5 μg/ml加入胰岛素；丹参组：按50 μg/ml加入丹参液；对照组：加入生理盐水。分别培养2，4及6天，观察成纤维细胞生长情况。每天对每组4瓶细胞进行检测。
1.3 观察内容
1.3.1 细胞核分裂率 将成纤维细胞用Wright's染色后，在光镜下计数各组细胞中有核分裂的细胞数。用此细胞数除以观察细胞总数，即得核分裂率。
, http://www.100md.com
1.3.2 细胞生长情况 将各组不同时期的成纤维细胞用结晶紫染色，枸橼酸缓冲液冲洗，比色，读取光密度值，绘制成纤维细胞生长曲线。
1.3.3 形态观察 用光镜观察各组细胞的形态学特征，扫描电镜观察成纤维细胞表面胶原纤维生长情况。
2 结果
2.1 成纤维细胞核分裂率
胰岛组、丹参组和对照组的成纤维细胞核分裂情况见附表。从附表可见，胰岛素组成纤维细胞核分裂率明显高于丹参组和对照组，经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。
2.2 成纤维细胞生长情况
各组成纤维细胞不同时期的光密度值，经统计学处理后绘制出生长曲线(附图)。从附图可见，培养2天，胰岛素组、丹参组及对照组的成纤维细胞生长数量无差异；培养4天及6天，胰岛素组的成纤维细胞最多，而丹参组成纤维细胞则最少。
, 百拇医药
附表 各组细胞核分裂情况(个) 组 别
计数细胞
有核分裂的细胞
核分裂率(‰)
胰岛素组
510
10
19.60
丹参组
800
2
2.50
对照组
, http://www.100md.com
530
2
3.77
附图 各组成纤维细胞生长曲线
2.3 形态学变化
2.3.1 光镜观察 对照组细胞生长活跃，呈平行排列或形成涡形，细胞大部分为纺锤形，细胞核呈椭圆形，细胞浆丰富，可见核仁。丹参组细胞分布稀疏，呈多形性，细胞核大小不等，核仁不清或消失。胰岛素组成纤维细胞生长旺盛，呈交叉重叠生长，细胞形态呈纺锤形，细胞核明显，核仁清晰。
2.3.2 扫描电镜观察 对照组细胞表面及周围纤维状物大量增加，呈放射状。丹参组细胞表面光滑，纤维状物极少。胰岛素组成纤维细胞表面凹凸不平，有较丰富的纤维状物，交织呈网状。
, http://www.100md.com
3 讨论
成纤维细胞的功能活动是伤口愈合的关键。肝硬化，肠粘连，输尿管瘢痕狭窄、瘢痕过长等均与成纤维细胞增殖活跃和胶原合成亢进有较密切关系[2，3]。细胞增殖的基本条件是细胞质和细胞核的复制，二者是正常细胞增殖不可缺少的前提。只有在细胞质和细胞核复制完成后，细胞才能发生分裂。因此，核分裂数从一个方面反映了细胞的增殖程度。
3.1 胰岛素对体外培养成纤维细胞生长的影响
研究发现，胰岛素有成纤维细胞生长因子样作用。因此，我们选用胰岛素作为刺激成纤维细胞生长的药物，结果表明胰岛素组的核分裂率为19.60‰，明显高于对照组和丹参组，电镜扫描发现成纤维细胞表面凹凸不平，纤维状物密集。说明胰岛素对成纤维细胞的生长和胶原合成有促进作用，作用时相为细胞增殖的G0/G1期，使细胞增殖周期启动[4]，细胞有丝分裂加速，机能活动加强，使成纤维细胞大量增殖，并合成过多胶原纤维。临床研究发现，糖尿病患者伤口愈合延迟或不愈合，使用胰岛素后可加快伤口愈合，认为胰岛素可加速无氧代谢，提供炎性细胞活动的能量，并维持成纤维细胞的活性，加快伤口愈合。研究还发现，胰岛素与成纤维细胞表面膜受体结合，合成大量胶原基质，并对纤维蛋白溶解酶原有抑制作用，使胶原合成增加。
, http://www.100md.com
3.2 丹参对体外培养成纤维细胞生长的影响
陈学忠等[2]已对丹参、桃仁、川芎嗪等中药的抗纤维化作用进行了临床研究，对某些纤维化疾病，如肠粘连，输卵管粘连取得了一定疗效。我们的实验结果显示，丹参组核分裂率为2.50‰，明显低于胰岛素组，且成纤维细胞生长缓慢，电镜扫描发现细胞表面光滑，纤维状物极少，表明丹参对体外培养成纤维细胞的生长增殖和胶原合成有明显抑制作用。其机理可能是通过抑制细胞核分裂，减慢成纤维细胞的有丝分裂，或增加有丝分裂需要的时间而实现的。但也有学者[5]认为是通过降低3H-羟脯氨酸渗入量使胶原合成下降，同时也使细胞前胶原合成受到抑制。我们认为，丹参对体外成纤维细胞的抑制作用与临床上抗纤维化的疗效有一定相似性。
4 参考文献
1 贺声华.伤口愈合的研究现状和发展趋向.国外医学 军事医学分册，1995；12(1)：68
, 百拇医药
2 陈学忠，孙文勇.川芎嗪、丹参对体外培养成纤维细胞的作用.中西医结合杂志，1987；7(4)：547
3 宋维铭，管正至，孙广慈等.维甲酸对体外培养成纤维细胞DNA合成的影响.中华整形烧伤外科杂志，1995；11(2)：135
4 Sasaki T. Calmodulin and cell proligeration. Biochem Biophys Res Commun,1982；104(4)：451
5 曾民德，邱德凯，张吉翔.丹参、青木香对成纤维细胞产生基质的抑制作用.上海第二医科大学学报，1991；3(3)：204
△ 四川省卫生厅、四川省中医药管理局科研基金资助项目
(收稿：1997-07-22修回：1997-08-15), http://www.100md.com
单位：1 华西医科大学附属第一医院外科(四川成都，610041)；2 华西医科大学受体研究室；3 华西医科大学附属口腔医学院细胞培养室
关键词：胰岛素；丹参；伤口愈合；成纤维细胞
中国修复重建外科杂志980117 摘 要 为了探讨胰岛素、丹参在伤口愈合过程中对胶原合成与分解代谢的影响，应用人胚皮肤培养成纤维细胞，分设胰岛素组、丹参组及对照组，培养2，4和6天，观察细胞的生长情况。成纤维细胞生长曲线显示：胰岛素组高于对照组，对照组高于丹参组。细胞核分裂率三组分别为19.60‰，2.50‰和3.77‰。扫描电镜观察发现胰岛素组成纤维细胞周围及表面有大量纤维状物，丹参组成纤维细胞表面光滑，仅有少量纤维状物。认为，胰岛素对成纤维细胞增殖和胶原合成有促进作用，而丹参对成纤维细胞增殖和胶原合成则有抑制作用。
, 百拇医药
THE EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT OF INSULIN AND DANSHEN ON CULTURE OF FIBROBLAST IN VITRO/Liu Min, Peng Mingxing, Liu Ming et al. Department of Pediatric Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, P.R.China 610041
Abstract To investigate the effect of Insulin and Danshen on anabolism and catabolism of collagen during the healing of wound, fibroblast which was cultured from human embryonic skin were divided into 3 groups: Insulin group, Danshen group and contral group. Each group was cultured for 2,4 and 6 days, then the growth curve was established respectively. Results: ①the growth curve showed-Insulin group> control group> Danshen group. ②the rate of cell division in 3 groups was 19.6‰, 2.5‰, 3.77‰ respectively. ③the electron microscopic scanning showed that there was much of fibroid tissue surrounding the fibroblast cell in insulin group, but there was little fibroid tissue in Danshen group. The conclusion showed that insulin can accelerates proliferation of fibroblast and synthesis of collagen, but the effect of denshen was just on the contrary.
, 百拇医药
Key words Insulin Danshen Wound healing Fibroblast cell
成纤维细胞作为胶原纤维的合成场所，对伤口的正常愈合及异常愈合有重要影响。近年来，在许多领域对成纤维细胞的胶原合成和分解进行了研究[1]。陈学忠等[2]对丹参、桃仁等中药的抗纤维化作用也进行了基础和临床研究。有学者发现，胰岛素有成纤维细胞生长因子样作用。但胰岛素对体外培养成纤维细胞的生长及功能影响的实验研究尚较少。为探讨胰岛素及丹参在伤口愈合过程中对成纤维细胞的增殖和胶原合成及分解代谢的影响设计了本实验。
1 材料与方法
1.1 材料来源、主要试剂和仪器
人胚皮肤组织由华西医科大学组织胚胎学教研室提供。主要试剂有：199培养基(GIBCO公司制备)，小牛血清(华西生化制品厂)，丹参注射液(华西医科大学制药厂)，胰岛素(NOVO药厂)。主要仪器为：超净工作台，CO2孵箱，42型分光光度仪(BACKAN公司)及扫描电镜。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
在无菌条件下，取水囊引产的4月龄胎儿的前臂内侧皮肤组织，大小约为1 cm×1 cm×1 mm。在超净工作台上，用Hank's 缓冲液清洗3次～5次， 迅速剪成大小约1 mm×1 mm×1 mm的小块，移入细胞瓶中。加入含20%小牛血清的199培养基，密闭，37℃培养。4天后光镜下观察成纤维细胞生长和污染情况。细胞生长至满瓶后传代培养，待细胞进入对数生长期，将细胞分别接种，分组。每组12瓶，每瓶1.5×109个细胞。胰岛素组：在培养液中按5 μg/ml加入胰岛素；丹参组：按50 μg/ml加入丹参液；对照组：加入生理盐水。分别培养2，4及6天，观察成纤维细胞生长情况。每天对每组4瓶细胞进行检测。
1.3 观察内容
1.3.1 细胞核分裂率 将成纤维细胞用Wright's染色后，在光镜下计数各组细胞中有核分裂的细胞数。用此细胞数除以观察细胞总数，即得核分裂率。
, http://www.100md.com
1.3.2 细胞生长情况 将各组不同时期的成纤维细胞用结晶紫染色，枸橼酸缓冲液冲洗，比色，读取光密度值，绘制成纤维细胞生长曲线。
1.3.3 形态观察 用光镜观察各组细胞的形态学特征，扫描电镜观察成纤维细胞表面胶原纤维生长情况。
2 结果
2.1 成纤维细胞核分裂率
胰岛组、丹参组和对照组的成纤维细胞核分裂情况见附表。从附表可见，胰岛素组成纤维细胞核分裂率明显高于丹参组和对照组，经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。
2.2 成纤维细胞生长情况
各组成纤维细胞不同时期的光密度值，经统计学处理后绘制出生长曲线(附图)。从附图可见，培养2天，胰岛素组、丹参组及对照组的成纤维细胞生长数量无差异；培养4天及6天，胰岛素组的成纤维细胞最多，而丹参组成纤维细胞则最少。
, 百拇医药
附表 各组细胞核分裂情况(个) 组 别
计数细胞
有核分裂的细胞
核分裂率(‰)
胰岛素组
510
10
19.60
丹参组
800
2
2.50
对照组
, http://www.100md.com
530
2
3.77
附图 各组成纤维细胞生长曲线
2.3 形态学变化
2.3.1 光镜观察 对照组细胞生长活跃，呈平行排列或形成涡形，细胞大部分为纺锤形，细胞核呈椭圆形，细胞浆丰富，可见核仁。丹参组细胞分布稀疏，呈多形性，细胞核大小不等，核仁不清或消失。胰岛素组成纤维细胞生长旺盛，呈交叉重叠生长，细胞形态呈纺锤形，细胞核明显，核仁清晰。
2.3.2 扫描电镜观察 对照组细胞表面及周围纤维状物大量增加，呈放射状。丹参组细胞表面光滑，纤维状物极少。胰岛素组成纤维细胞表面凹凸不平，有较丰富的纤维状物，交织呈网状。
, http://www.100md.com
3 讨论
成纤维细胞的功能活动是伤口愈合的关键。肝硬化，肠粘连，输尿管瘢痕狭窄、瘢痕过长等均与成纤维细胞增殖活跃和胶原合成亢进有较密切关系[2，3]。细胞增殖的基本条件是细胞质和细胞核的复制，二者是正常细胞增殖不可缺少的前提。只有在细胞质和细胞核复制完成后，细胞才能发生分裂。因此，核分裂数从一个方面反映了细胞的增殖程度。
3.1 胰岛素对体外培养成纤维细胞生长的影响
研究发现，胰岛素有成纤维细胞生长因子样作用。因此，我们选用胰岛素作为刺激成纤维细胞生长的药物，结果表明胰岛素组的核分裂率为19.60‰，明显高于对照组和丹参组，电镜扫描发现成纤维细胞表面凹凸不平，纤维状物密集。说明胰岛素对成纤维细胞的生长和胶原合成有促进作用，作用时相为细胞增殖的G0/G1期，使细胞增殖周期启动[4]，细胞有丝分裂加速，机能活动加强，使成纤维细胞大量增殖，并合成过多胶原纤维。临床研究发现，糖尿病患者伤口愈合延迟或不愈合，使用胰岛素后可加快伤口愈合，认为胰岛素可加速无氧代谢，提供炎性细胞活动的能量，并维持成纤维细胞的活性，加快伤口愈合。研究还发现，胰岛素与成纤维细胞表面膜受体结合，合成大量胶原基质，并对纤维蛋白溶解酶原有抑制作用，使胶原合成增加。
, http://www.100md.com
3.2 丹参对体外培养成纤维细胞生长的影响
陈学忠等[2]已对丹参、桃仁、川芎嗪等中药的抗纤维化作用进行了临床研究，对某些纤维化疾病，如肠粘连，输卵管粘连取得了一定疗效。我们的实验结果显示，丹参组核分裂率为2.50‰，明显低于胰岛素组，且成纤维细胞生长缓慢，电镜扫描发现细胞表面光滑，纤维状物极少，表明丹参对体外培养成纤维细胞的生长增殖和胶原合成有明显抑制作用。其机理可能是通过抑制细胞核分裂，减慢成纤维细胞的有丝分裂，或增加有丝分裂需要的时间而实现的。但也有学者[5]认为是通过降低3H-羟脯氨酸渗入量使胶原合成下降，同时也使细胞前胶原合成受到抑制。我们认为，丹参对体外成纤维细胞的抑制作用与临床上抗纤维化的疗效有一定相似性。
4 参考文献
1 贺声华.伤口愈合的研究现状和发展趋向.国外医学 军事医学分册，1995；12(1)：68
, 百拇医药
2 陈学忠，孙文勇.川芎嗪、丹参对体外培养成纤维细胞的作用.中西医结合杂志，1987；7(4)：547
3 宋维铭，管正至，孙广慈等.维甲酸对体外培养成纤维细胞DNA合成的影响.中华整形烧伤外科杂志，1995；11(2)：135
4 Sasaki T. Calmodulin and cell proligeration. Biochem Biophys Res Commun,1982；104(4)：451
5 曾民德，邱德凯，张吉翔.丹参、青木香对成纤维细胞产生基质的抑制作用.上海第二医科大学学报，1991；3(3)：204
△ 四川省卫生厅、四川省中医药管理局科研基金资助项目
(收稿：1997-07-22修回：1997-08-15), http://www.100md.com