严重烧伤早期心肌细胞骨架损伤的力学研究
作者：迟路湘 杨宗城 黎鳌 龙勉 吴泽志
单位：400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所(迟路湘、杨宗城、黎鳌)；重庆大学生物医学工程学院生物力学系(龙勉、吴泽志)
关键词：灼伤；心肌；细胞骨架；生物力学
中华创伤杂志980103 【摘要】 目的 旨在了解严重烧伤早期心肌生物力学特性的变化及细胞骨架损伤对心肌细胞粘弹力学特性的影响。方法 在体实验，测定大鼠严重烧伤后(24小时内)心肌力学的变化，同时采用流式细胞术定量分析心肌细胞骨架蛋白的动态变化。离体心肌细胞培养，采用免疫组化及流式细胞术观察心肌细胞骨架蛋白分布和含量变化，并通过微管吸吮实验测定心肌细胞粘弹力学特性变化。结果 烧伤后早期，左心室收缩压(LVSP)、左心室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室内压下降最大速率(-dp/dtmax)、心力环总面积(LO)显著下降(P<0.01)，左心室舒张末期压(LVedp)升高(P<0.05或P<0.01)。心肌细胞骨架蛋白Vinculin、Desmin、β-Tubulin平均荧光强度明显降低(P<0.01)。缺氧、烧伤血清可引起心肌细胞骨架结构破坏及重构，网络结构消失，细胞完整性破坏；心肌细胞弹性系数K1、K2及粘性系数μ下降(P<0.05或P<0.01)。结论 大鼠严重烧伤后早期，细胞骨架结构破坏及重构可能是心肌细胞不可逆损伤的早期征象，细胞骨架损伤决定性影响心肌细胞被动粘弹力学特性，心肌顺应性降低。
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Mechanical Study on Myocardial Cytoskeleton Damage in Early Stage of Severe Burn Injury CHI Lu-xiang， YANG Zong-cheng， LI Ao， et al. Burn Research Institute， Third Military Medical University， Chongqing 400038
【Abstract】 Aim To study the changes of myocardial biomechanical properties and the effect of cytoskeleton damage on the viscoelastic properties of myocardial cells in the early stage of burn injury. Methods In vivo， the changes of myocardial mechanics were measured by invasive method， and the myocardial cytoskeletal proteins were analyzed by flow cytometer (FCM). In vitro myocardial cell culture， the distribution and the content change of the myocardial cytoskeleton were observed by immunocytochemistry technique and FCM， and the viscoelastic properties of myocardial cells were measured by micropipette aspiration experiment. Results In the early stage of burn injury， the left ventricular systolic pressure (LVSP)， +dp/dtmax， -dp/dtmax， LO decreased (P<0.01)， and the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) increased (P<0.05 or P<0.01). The mean fluorescence intensity of myocardial cytoskeletal proteins， Vinculin， Desmin， and β-Tubulin decreased (P<0.01). Hypoxia and burned serum could result in the myocardial cytoskeleton damage， and pathological remodeling， therefore cytoskeletal network disappeared， and cell integrity damaged. The viscoelastic coefficients of myocardial cell decreased (P<0.05 or P<0.01). Conclusions The study demonstrates that in the early stage of severe burn injury， the damage and pathological remodeling of myocardial cytoskeleton might be an early sign of irreversible injury. The alteration of myocardial cytoskeleton affects vitally the passive viscoelastic biomechanic properties， and results in myocardial compliance decrease.
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【Key words】 Burns Myocardium Cytoskeleton Biomechanic
烧伤后早期，即刻心输出量下降50%，而且显示正常的收缩功能，但舒张特性却发生了障碍[1]。有实验表明，正常供氧心肌细胞能承受相当大的低渗应力，而不致细胞水肿死亡。但在缺氧心肌，由于无氧代谢产物致胞浆渗透压增高，细胞水肿，肌膜与肌纤维分离，易发生心肌细胞致命性损伤[2]。心肌细胞骨架在Z线、闰盘、筋膜粘合连接、侧肋连接处紧密连接肌纤维系统与肌膜，完成细胞内结构和功能的整合[3]，因而细胞骨架微丝、微管和中间丝可能在完成肌纤维产生的机械力跨膜传递中发挥作用[4]。因此，心肌细胞骨架在维持细胞膜完整，支架、桥连肌纤维于细胞膜，使肌纤维更有效地弛张均起着至关重要的作用。笔者旨在从在体及离体细胞培养两个层次，对严重烧伤早期心肌细胞骨架损伤影响心肌力学的机制进一步进行探讨。
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一、大鼠在体实验
1.动物和分组：Wistar大鼠，体重(220±20)g。单笼喂养1周后，随机分为正常对照组(鼠数=10)和烧伤组(鼠数=50)。动物经1%戊巴比妥麻醉后背部脱毛，置脱毛区于92℃水浴中的18秒，造成30%全身体表面积(TBSA)Ⅲ度烧伤。正常对照组除不予烧伤外，其余处理与烧伤组相同。将各组动物分为伤后1、3、6、12、24小时5个点，每个时相点10只大鼠。
2.心肌力学参数测定及分析参照文献[5]。
3.心肌细胞骨架蛋白流式细胞术定量分析参照文献[6]。
二、体外心肌细胞培养实验
1.损伤实验及分组：(1)正常对照组：心肌细胞在含10%小牛血清DMEM培养液中常规培养7天，改加含10%正常大鼠血清的DMEM培养液；(2)单纯缺氧组：细胞常规培养至第7天，实验时将5%CO2改换为92%N2、4%O2、4%CO2混合气体充入培养皿中，模拟缺氧环境；(3)单纯烧伤血清组：细胞常规培养至第7天，PBS液清洗3次，改加含10%大鼠烧伤血清的DMEM培养液；(4)双因素致伤组：细胞常规培养至第7天，改用含10%大鼠烧伤血清的DMEM培养液，并充入缺氧混合气体取代有氧培养。以上各组均于致伤后1、3、6小时(每组孔数=5)收集样本进行检测。
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2.心肌细胞骨架蛋白免疫组化及流式细胞术定量分析：心肌细胞经4%多聚甲醛固定，骨架蛋白免疫组化按SP药盒进行。
3.心肌细胞生物力学微管吸吮实验参照文献[7]。
三、统计学分析
实验数据以
表示，采用单因素方差分析判断各组数据均数差异的显著性。以P<0.05作为差异显著。
结 果
1.烧伤后心肌力学特性变化：从表1可见，烧伤后1小时，左心室收缩压(LVSP)、左心室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室内压下降最大速率(-dp/dtmax)、心力环总面积(LO)显著下降(P<0.01)。左心室舒张末期压(LVedp)于伤后1小时开始升高(P<0.05)，6小时达峰值(P<0.01)，并出现两个高峰。
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2.烧伤后心肌细胞骨架蛋白定量分析：从表2可见，烧伤后1小时，心肌细胞骨架蛋白Vinculin、Desmin、β-tubulin平均荧光强度即出现明显降低(P<0.01)。Vinculin于伤后12小时达低峰，Desmin、β-tubulin则于伤后24小时达最低值(P<0.01)。
3.缺氧、烧伤血清对培养心肌细胞骨细胞骨架形态结构的影响：(1)中间丝：各组改变以缺氧加烧伤血清组损伤最为严重。(2)微管：各组改变以缺氧加烧伤血清组损伤最为严重。
4.缺氧复合烧伤血清刺激影响心肌细胞骨架蛋白的定量分析：从表3可见，缺氧加烧伤血清损伤1小时，心肌细胞骨架蛋白Vinculin、Desmin、β-Tubulin的平均荧光强度即出现明显降低(P<0.01)，6小时达最低值。三者出现类似的平行改变。
5.缺氧复合烧伤血清对培养心肌细胞粘弹特性的影响：在微管负压吸吮作用下，正常对照组心肌细胞变形小，易恢复，仅形成较小的“舌”，心肌细胞在微管内
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表1 大鼠烧伤后心肌力学参数分析()
项目
对照组
烧伤后时间(h)
1
3
6
12
24
LVSP(kPa)
20.4±1.6
15.2±1.6**
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14.8±2.0**
12.9±3.1**
16.1±1.7**
16.8±2.2**
LVedp(kPa)
0.9±0.4
2.0±0.9*
3.1±0.9**
4.2±1.1**
1.4±0.7
, 百拇医药
2.3±1.2**
+dp/dtmax(kPa/s)
1137.4±121.9
493.1±151.7**
382.4±122.4**
320.8±87.9**
588.9±248.6**
564.0±200.1**
-dp/dtmax(kPa/s)
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854.6±199.3
398.2±102.4**
323.5±92.5**
268.2±83.7**
494.5±167.4**
432.0±160.6**
LO
156.5±29.7
47.4±23.9**
31.0±15.1**
, 百拇医药
20.1±10.5**
63.2±36.2**
56.9±31.1**
与对照组比较：*P<0.01 **P<0.05
表2 大鼠烧伤后心肌细胞骨架蛋白的平均荧光强度变化()
项目
对照组
烧伤后时间(h)
1
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3
6
12
24
Vinculin
76.3±4.8
66.4±6.3**
56.6±5.4**
58.5±4.8**
48.2±3.4**
56.3±6.8**
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Desmin
78.0±2.6
73.8±3.3
65.8±3.7**
61.6±3.2**
59.0±6.4**
57.7±7.0**
β-tubulin
84.0±3.5
72.0±6.6**
, 百拇医药 66.8±3.1**
68.0±1.2**
61.6±4.1**
58.4±3.1**
与对照组比较：**P<0.01
表3 缺氧复合烧伤血清对培养心肌细胞骨架蛋白平均荧光
强度的影响()
项目
对照组
, 百拇医药
烧伤后时间(h)
1
3
6
Vinculin
86.4±6.9
75.4±3.8**
61.0±1.9**
54.8±4.9**
Desmin
83.6±2.7
, 百拇医药 67.6±3.8*
60.8±2.9**
49.4±2.3**
β-tubulin
87.2±6.8
68.2±10.5**
68.6±5.1**
61.0±4.0**
与对照组比较：**P<0.01
的变形经历了一个初始快速响应和其后稳定增加的时间过程(图1)。而缺氧复合烧伤血清损伤心肌细胞变形快，形成较大的“舌”，且可见较长的蠕变相，同时伴细微的胞质活动，变形不易恢复，恢复慢，脱离微管后仍可见细胞有一较大的突起(图2)。采用非线性迭代方法拟合实验结果，测得缺氧复合烧伤血清损伤3小时心肌细胞弹性系数K1、K2即明显下降(P<0.05或P<0.01)，并达最低值。同时粘性系数μ也出现明显下降(P<0.05)，并于损伤后6小时达最低值(P<0.05)。
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讨 论
本实验表明，严重烧伤后1小时LVSP、+dp/dtmax、LO均明显降低，提示严重烧伤确能引起心肌固有收缩力下降。此外，伤后1小时-dp/dtmax即明显下降，同时伴LVedp明显升高。说明严重烧伤后不仅存在心肌收缩能力下降，同时伴心肌舒张能力下降，室壁张力增加，表明伤后心肌静息张力明显增加。笔者推测，心肌本身具有材料力学特性可能发生变化。
长期以来，心肌细胞主动性兴奋-收缩耦联观念统治着心脏生理学，而忽略了心肌细胞被动的生物力学特性，即心肌细胞本身固有粘弹特性。微管吸吮技术是一种评价单个细胞变形的重要研究手段[8]。它通过测量在一定负压作用下细胞的变形时间过程，用以阐明细胞的粘弹力学特性。笔者发现缺氧复合烧伤血清损伤3小时，心肌细胞弹性系数K1、K2即明显下降，同时伴粘性系数μ也明显下降。心肌细胞的标准线性固体模型是由弹性系数K1、K2的线性弹簧与粘性系数μ的阻尼器组合构成。K1、K2代表了即刻产生与载荷成正比的变形，μ则代表了阻尼器于任一瞬间产生与载荷成正比的速度[8]。心肌弹性成分和粘性成分的劲度是决定心肌顺应性的两个因素，弹性劲度影响组织形变程度，而粘性劲度影响组织形变速度[9]。因此，心肌细胞力学试验结果进一步证实心肌粘弹性能降低是导致心肌顺应性下降的决定因素。
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心肌细胞骨架是维系细胞及细胞膜完整的主要物质基础。本研究结果表明，严重烧伤早期(伤后1小时)即出现Vinculin、Desmin、β-Tubulin的免疫荧光强度降低。体外实验进一步发现β-Tubulin分布以胞质损伤较重，而核周损伤较轻，典型细胞的微管改变呈网络状结构松散，间距增大，丝状结构断裂、空化，说明β-Tubulin发生了结构重排，即沿应力方向损伤较重。典型细胞的中间丝改变也呈区域性阳性信号缺失，核周阳性染色减弱，网络状结构消失等类似变化。说明心肌细胞中间纤维骨架体系出现塌陷。其可能的途径是：(1)细胞内钙超载，钙激活中性蛋白酶可引起细胞骨架断裂、破坏[10]。(2)细胞水肿，肌纤维收缩。细胞水肿产生外向张力增加，“推”肌膜向外突起，另一方面，细胞内钙积聚，肌纤维痉挛收缩，“拉”骨架向内，由此而导致细胞骨架断裂[11]。(3)能量饥饿、耗竭，骨架蛋白磷酸
图1 正常心肌细胞在微管内的典型变形过程
, 百拇医药
图2 缺氧加烧伤血清损伤3小时，心肌细胞在微管内变形的典型过程，可见形成一较大的“舌”
化可抑制骨架蛋白聚集、装配，导致骨架解聚[4]。有作者认为心肌细胞骨架破坏，心肌细胞及其肌膜稳定性降低，细胞脆性增加[12]，心肌细胞本身固有的粘弹特性下降。其后缺血加重，继发的细胞水肿和肌纤维收缩机械地破坏肌膜，造成细胞骨架进一步破坏，细胞内环境失衡，最终导致心肌细胞坏死。因此，笔者认为，烧伤后心肌细胞骨架损伤不仅决定性影响心肌细胞力学特性，而且心肌细胞骨架损伤早于肌纤维膜断裂的病理表现，是心肌细胞不可逆性损伤的早期标志之一，是不可逆损伤的边缘征象。
本课题受国家自然科学基金重大项目资助(No.39290700)
参 考 文 献
1 刘也康，方之扬.烧伤早期血液动力学和心泵功能的变化.见：黎鳌，杨宗城主编.烧伤治疗学.北京：人民卫生出版社， 1997， 91-94.
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2 Vander-Heide RS， Ganote CE. Increased myocyte fragility following anoxic injury. J Mol Cell Cardiol， 1987， 19∶1085-1103.
3 Ganote CE， Armstrong S. Ischemic and the myocyte cytoskeleton： Review and speculation. Cardiovas Res， 1993， 27∶1387-1403.
4 何作云，周晓波，冯兵.机械应力转换生化信号的机制.见：何作云，王瑞兴主编.临床细胞流变学.重庆：重庆大学出版社， 1997， 249-253.
5 俞大可，朱志年，富维骏，等.测量心肌收缩性参数的微机系统.第二军医大学学报， 1989， 10∶562-564.
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6 Armstrong SC， Ganote CE. Flow cytometric analysis of isolated adult cardiomyocytes： Vinculin and tubulin fluorescence during metabolic inhibition and ischemia. J Mol Cell Cardiol， 1992， 24∶149-158.
7 龙勉，吴泽志，王红兵，等.肝细胞粘弹性实验研究.生理物理学报， 1996， 12∶169-172.
8 冯元桢主编.生物力学：活组织的力学特性.长沙：湖南科学技术出版社， 1986， 47-54.
9 王建勋，李云霞.大鼠离体心肌粘性劲度定量评定的研究.生理学报， 1988， 40∶480-486.
10 Croall DE. Calcium-activated neutral protease (calpain) system： Structure， function and regulation. Physiol Rev， 1991， 71∶813-826.
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11 Sage MD， Jennings RB. Cytoskeletal injury and subsarcolemmal bleb formation in dog heart during in vitro total ischemia. Am J Pathol， 1988， 133∶327-346.
12 Ganote CE， Vander-Herde RS. Importance of mechanical factors in ischemic and reperfusion injury. In： Piper HM， eds. Pathophysiology of Severe Ischemic Myocardial Injury. Dordrecht： Kluwer Academic， 1990， 337-349.
(收稿：1997-11-20 修回：1997-11-27), 百拇医药
单位：400038 重庆，第三军医大学附属西南医院烧伤研究所(迟路湘、杨宗城、黎鳌)；重庆大学生物医学工程学院生物力学系(龙勉、吴泽志)
关键词：灼伤；心肌；细胞骨架；生物力学
中华创伤杂志980103 【摘要】 目的 旨在了解严重烧伤早期心肌生物力学特性的变化及细胞骨架损伤对心肌细胞粘弹力学特性的影响。方法 在体实验，测定大鼠严重烧伤后(24小时内)心肌力学的变化，同时采用流式细胞术定量分析心肌细胞骨架蛋白的动态变化。离体心肌细胞培养，采用免疫组化及流式细胞术观察心肌细胞骨架蛋白分布和含量变化，并通过微管吸吮实验测定心肌细胞粘弹力学特性变化。结果 烧伤后早期，左心室收缩压(LVSP)、左心室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室内压下降最大速率(-dp/dtmax)、心力环总面积(LO)显著下降(P<0.01)，左心室舒张末期压(LVedp)升高(P<0.05或P<0.01)。心肌细胞骨架蛋白Vinculin、Desmin、β-Tubulin平均荧光强度明显降低(P<0.01)。缺氧、烧伤血清可引起心肌细胞骨架结构破坏及重构，网络结构消失，细胞完整性破坏；心肌细胞弹性系数K1、K2及粘性系数μ下降(P<0.05或P<0.01)。结论 大鼠严重烧伤后早期，细胞骨架结构破坏及重构可能是心肌细胞不可逆损伤的早期征象，细胞骨架损伤决定性影响心肌细胞被动粘弹力学特性，心肌顺应性降低。
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Mechanical Study on Myocardial Cytoskeleton Damage in Early Stage of Severe Burn Injury CHI Lu-xiang， YANG Zong-cheng， LI Ao， et al. Burn Research Institute， Third Military Medical University， Chongqing 400038
【Abstract】 Aim To study the changes of myocardial biomechanical properties and the effect of cytoskeleton damage on the viscoelastic properties of myocardial cells in the early stage of burn injury. Methods In vivo， the changes of myocardial mechanics were measured by invasive method， and the myocardial cytoskeletal proteins were analyzed by flow cytometer (FCM). In vitro myocardial cell culture， the distribution and the content change of the myocardial cytoskeleton were observed by immunocytochemistry technique and FCM， and the viscoelastic properties of myocardial cells were measured by micropipette aspiration experiment. Results In the early stage of burn injury， the left ventricular systolic pressure (LVSP)， +dp/dtmax， -dp/dtmax， LO decreased (P<0.01)， and the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) increased (P<0.05 or P<0.01). The mean fluorescence intensity of myocardial cytoskeletal proteins， Vinculin， Desmin， and β-Tubulin decreased (P<0.01). Hypoxia and burned serum could result in the myocardial cytoskeleton damage， and pathological remodeling， therefore cytoskeletal network disappeared， and cell integrity damaged. The viscoelastic coefficients of myocardial cell decreased (P<0.05 or P<0.01). Conclusions The study demonstrates that in the early stage of severe burn injury， the damage and pathological remodeling of myocardial cytoskeleton might be an early sign of irreversible injury. The alteration of myocardial cytoskeleton affects vitally the passive viscoelastic biomechanic properties， and results in myocardial compliance decrease.
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【Key words】 Burns Myocardium Cytoskeleton Biomechanic
烧伤后早期，即刻心输出量下降50%，而且显示正常的收缩功能，但舒张特性却发生了障碍[1]。有实验表明，正常供氧心肌细胞能承受相当大的低渗应力，而不致细胞水肿死亡。但在缺氧心肌，由于无氧代谢产物致胞浆渗透压增高，细胞水肿，肌膜与肌纤维分离，易发生心肌细胞致命性损伤[2]。心肌细胞骨架在Z线、闰盘、筋膜粘合连接、侧肋连接处紧密连接肌纤维系统与肌膜，完成细胞内结构和功能的整合[3]，因而细胞骨架微丝、微管和中间丝可能在完成肌纤维产生的机械力跨膜传递中发挥作用[4]。因此，心肌细胞骨架在维持细胞膜完整，支架、桥连肌纤维于细胞膜，使肌纤维更有效地弛张均起着至关重要的作用。笔者旨在从在体及离体细胞培养两个层次，对严重烧伤早期心肌细胞骨架损伤影响心肌力学的机制进一步进行探讨。
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一、大鼠在体实验
1.动物和分组：Wistar大鼠，体重(220±20)g。单笼喂养1周后，随机分为正常对照组(鼠数=10)和烧伤组(鼠数=50)。动物经1%戊巴比妥麻醉后背部脱毛，置脱毛区于92℃水浴中的18秒，造成30%全身体表面积(TBSA)Ⅲ度烧伤。正常对照组除不予烧伤外，其余处理与烧伤组相同。将各组动物分为伤后1、3、6、12、24小时5个点，每个时相点10只大鼠。
2.心肌力学参数测定及分析参照文献[5]。
3.心肌细胞骨架蛋白流式细胞术定量分析参照文献[6]。
二、体外心肌细胞培养实验
1.损伤实验及分组：(1)正常对照组：心肌细胞在含10%小牛血清DMEM培养液中常规培养7天，改加含10%正常大鼠血清的DMEM培养液；(2)单纯缺氧组：细胞常规培养至第7天，实验时将5%CO2改换为92%N2、4%O2、4%CO2混合气体充入培养皿中，模拟缺氧环境；(3)单纯烧伤血清组：细胞常规培养至第7天，PBS液清洗3次，改加含10%大鼠烧伤血清的DMEM培养液；(4)双因素致伤组：细胞常规培养至第7天，改用含10%大鼠烧伤血清的DMEM培养液，并充入缺氧混合气体取代有氧培养。以上各组均于致伤后1、3、6小时(每组孔数=5)收集样本进行检测。
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2.心肌细胞骨架蛋白免疫组化及流式细胞术定量分析：心肌细胞经4%多聚甲醛固定，骨架蛋白免疫组化按SP药盒进行。
3.心肌细胞生物力学微管吸吮实验参照文献[7]。
三、统计学分析
实验数据以
表示，采用单因素方差分析判断各组数据均数差异的显著性。以P<0.05作为差异显著。结 果
1.烧伤后心肌力学特性变化：从表1可见，烧伤后1小时，左心室收缩压(LVSP)、左心室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室内压下降最大速率(-dp/dtmax)、心力环总面积(LO)显著下降(P<0.01)。左心室舒张末期压(LVedp)于伤后1小时开始升高(P<0.05)，6小时达峰值(P<0.01)，并出现两个高峰。
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2.烧伤后心肌细胞骨架蛋白定量分析：从表2可见，烧伤后1小时，心肌细胞骨架蛋白Vinculin、Desmin、β-tubulin平均荧光强度即出现明显降低(P<0.01)。Vinculin于伤后12小时达低峰，Desmin、β-tubulin则于伤后24小时达最低值(P<0.01)。
3.缺氧、烧伤血清对培养心肌细胞骨细胞骨架形态结构的影响：(1)中间丝：各组改变以缺氧加烧伤血清组损伤最为严重。(2)微管：各组改变以缺氧加烧伤血清组损伤最为严重。
4.缺氧复合烧伤血清刺激影响心肌细胞骨架蛋白的定量分析：从表3可见，缺氧加烧伤血清损伤1小时，心肌细胞骨架蛋白Vinculin、Desmin、β-Tubulin的平均荧光强度即出现明显降低(P<0.01)，6小时达最低值。三者出现类似的平行改变。
5.缺氧复合烧伤血清对培养心肌细胞粘弹特性的影响：在微管负压吸吮作用下，正常对照组心肌细胞变形小，易恢复，仅形成较小的“舌”，心肌细胞在微管内
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表1 大鼠烧伤后心肌力学参数分析(
)项目
对照组
烧伤后时间(h)
1
3
6
12
24
LVSP(kPa)
20.4±1.6
15.2±1.6**
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14.8±2.0**
12.9±3.1**
16.1±1.7**
16.8±2.2**
LVedp(kPa)
0.9±0.4
2.0±0.9*
3.1±0.9**
4.2±1.1**
1.4±0.7
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2.3±1.2**
+dp/dtmax(kPa/s)
1137.4±121.9
493.1±151.7**
382.4±122.4**
320.8±87.9**
588.9±248.6**
564.0±200.1**
-dp/dtmax(kPa/s)
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854.6±199.3
398.2±102.4**
323.5±92.5**
268.2±83.7**
494.5±167.4**
432.0±160.6**
LO
156.5±29.7
47.4±23.9**
31.0±15.1**
, 百拇医药
20.1±10.5**
63.2±36.2**
56.9±31.1**
与对照组比较：*P<0.01 **P<0.05
表2 大鼠烧伤后心肌细胞骨架蛋白的平均荧光强度变化(
)项目
对照组
烧伤后时间(h)
1
, http://www.100md.com
3
6
12
24
Vinculin
76.3±4.8
66.4±6.3**
56.6±5.4**
58.5±4.8**
48.2±3.4**
56.3±6.8**
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Desmin
78.0±2.6
73.8±3.3
65.8±3.7**
61.6±3.2**
59.0±6.4**
57.7±7.0**
β-tubulin
84.0±3.5
72.0±6.6**
, 百拇医药 66.8±3.1**
68.0±1.2**
61.6±4.1**
58.4±3.1**
与对照组比较：**P<0.01
表3 缺氧复合烧伤血清对培养心肌细胞骨架蛋白平均荧光
强度的影响(
)项目
对照组
, 百拇医药
烧伤后时间(h)
1
3
6
Vinculin
86.4±6.9
75.4±3.8**
61.0±1.9**
54.8±4.9**
Desmin
83.6±2.7
, 百拇医药 67.6±3.8*
60.8±2.9**
49.4±2.3**
β-tubulin
87.2±6.8
68.2±10.5**
68.6±5.1**
61.0±4.0**
与对照组比较：**P<0.01
的变形经历了一个初始快速响应和其后稳定增加的时间过程(图1)。而缺氧复合烧伤血清损伤心肌细胞变形快，形成较大的“舌”，且可见较长的蠕变相，同时伴细微的胞质活动，变形不易恢复，恢复慢，脱离微管后仍可见细胞有一较大的突起(图2)。采用非线性迭代方法拟合实验结果，测得缺氧复合烧伤血清损伤3小时心肌细胞弹性系数K1、K2即明显下降(P<0.05或P<0.01)，并达最低值。同时粘性系数μ也出现明显下降(P<0.05)，并于损伤后6小时达最低值(P<0.05)。
, 百拇医药
讨 论
本实验表明，严重烧伤后1小时LVSP、+dp/dtmax、LO均明显降低，提示严重烧伤确能引起心肌固有收缩力下降。此外，伤后1小时-dp/dtmax即明显下降，同时伴LVedp明显升高。说明严重烧伤后不仅存在心肌收缩能力下降，同时伴心肌舒张能力下降，室壁张力增加，表明伤后心肌静息张力明显增加。笔者推测，心肌本身具有材料力学特性可能发生变化。
长期以来，心肌细胞主动性兴奋-收缩耦联观念统治着心脏生理学，而忽略了心肌细胞被动的生物力学特性，即心肌细胞本身固有粘弹特性。微管吸吮技术是一种评价单个细胞变形的重要研究手段[8]。它通过测量在一定负压作用下细胞的变形时间过程，用以阐明细胞的粘弹力学特性。笔者发现缺氧复合烧伤血清损伤3小时，心肌细胞弹性系数K1、K2即明显下降，同时伴粘性系数μ也明显下降。心肌细胞的标准线性固体模型是由弹性系数K1、K2的线性弹簧与粘性系数μ的阻尼器组合构成。K1、K2代表了即刻产生与载荷成正比的变形，μ则代表了阻尼器于任一瞬间产生与载荷成正比的速度[8]。心肌弹性成分和粘性成分的劲度是决定心肌顺应性的两个因素，弹性劲度影响组织形变程度，而粘性劲度影响组织形变速度[9]。因此，心肌细胞力学试验结果进一步证实心肌粘弹性能降低是导致心肌顺应性下降的决定因素。
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心肌细胞骨架是维系细胞及细胞膜完整的主要物质基础。本研究结果表明，严重烧伤早期(伤后1小时)即出现Vinculin、Desmin、β-Tubulin的免疫荧光强度降低。体外实验进一步发现β-Tubulin分布以胞质损伤较重，而核周损伤较轻，典型细胞的微管改变呈网络状结构松散，间距增大，丝状结构断裂、空化，说明β-Tubulin发生了结构重排，即沿应力方向损伤较重。典型细胞的中间丝改变也呈区域性阳性信号缺失，核周阳性染色减弱，网络状结构消失等类似变化。说明心肌细胞中间纤维骨架体系出现塌陷。其可能的途径是：(1)细胞内钙超载，钙激活中性蛋白酶可引起细胞骨架断裂、破坏[10]。(2)细胞水肿，肌纤维收缩。细胞水肿产生外向张力增加，“推”肌膜向外突起，另一方面，细胞内钙积聚，肌纤维痉挛收缩，“拉”骨架向内，由此而导致细胞骨架断裂[11]。(3)能量饥饿、耗竭，骨架蛋白磷酸
图1 正常心肌细胞在微管内的典型变形过程
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图2 缺氧加烧伤血清损伤3小时，心肌细胞在微管内变形的典型过程，可见形成一较大的“舌”
化可抑制骨架蛋白聚集、装配，导致骨架解聚[4]。有作者认为心肌细胞骨架破坏，心肌细胞及其肌膜稳定性降低，细胞脆性增加[12]，心肌细胞本身固有的粘弹特性下降。其后缺血加重，继发的细胞水肿和肌纤维收缩机械地破坏肌膜，造成细胞骨架进一步破坏，细胞内环境失衡，最终导致心肌细胞坏死。因此，笔者认为，烧伤后心肌细胞骨架损伤不仅决定性影响心肌细胞力学特性，而且心肌细胞骨架损伤早于肌纤维膜断裂的病理表现，是心肌细胞不可逆性损伤的早期标志之一，是不可逆损伤的边缘征象。
本课题受国家自然科学基金重大项目资助(No.39290700)
参 考 文 献
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5 俞大可，朱志年，富维骏，等.测量心肌收缩性参数的微机系统.第二军医大学学报， 1989， 10∶562-564.
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8 冯元桢主编.生物力学：活组织的力学特性.长沙：湖南科学技术出版社， 1986， 47-54.
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10 Croall DE. Calcium-activated neutral protease (calpain) system： Structure， function and regulation. Physiol Rev， 1991， 71∶813-826.
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11 Sage MD， Jennings RB. Cytoskeletal injury and subsarcolemmal bleb formation in dog heart during in vitro total ischemia. Am J Pathol， 1988， 133∶327-346.
12 Ganote CE， Vander-Herde RS. Importance of mechanical factors in ischemic and reperfusion injury. In： Piper HM， eds. Pathophysiology of Severe Ischemic Myocardial Injury. Dordrecht： Kluwer Academic， 1990， 337-349.
(收稿：1997-11-20 修回：1997-11-27), 百拇医药