钙离子在脑外伤后继发性肺损害中的作用
作者：范润金 王宪荣
单位：650032 成都军区昆明总医院神经外科(范润金)；第三军医大学附属西南医院神经外科(王宪荣)
关键词：脑损伤；钙离子；继发性肺损害
中华创伤杂志980113 【摘要】 目的 探讨钙离子(Ca2+)在脑外伤后继发性肺损害中的作用。方法 用自由落体致大鼠脑外伤模型，伤后于5个不同的时相点，分别测定脑细胞、肺混合细胞内游离钙，并取标本作病理检查。结果 伤后6小时，脑细胞及肺混合细胞内游离钙显著升高，伤后72小时达到高峰，两者的变化呈直线正相关。病理检查结果显示伤后72小时，脑、肺组织病理损害最为严重。结论 脑外伤后，Ca2+在继发性肺损害中起着重要作用。
Function of Ca2+ in Secondary Lung Damage After Brain Injury FAN Run-jin*， WANG Xian-rong. *Dept. of Neurosurgery， Kunming General Hospital of Chengdu Military Command， Kunming 650032
, http://www.100md.com
【Abstract】 Aim To find out the function of Ca2+ in secondary pulmonary damage after brain injury. Methods On rats with brain injury resulted from free-falling， the cytosolic Ca2+ in cerebral cells and pneumonocytes was measured respectively at five different time points after injury， as well as the pathologic changes. Results The cytosolic Ca2+ in brain cells and pneumonocytes increased at 6 hours and peaked at 72 hours after injury， and there was a postitive linear correlation between them. The pathologic damage was severest both in brain and lung at 72 hours after injury. Conclusion Ca2+ functions importantly in secondary lung damage after brain injury.
, 百拇医药
【Key words】 Brain injury Ca2+ Secondary lung damage
严重颅脑损伤病人常出现呼吸困难、紫绀等一系列肺部损害的表现。对这一现象发生的机制进行过多方探讨，但结论不一。笔者从Ca2+的变化初步探讨它在脑外伤后继发性肺损害中的作用机制。
材料与方法
一、动物分组及模型
60只Wistar大鼠(由第三军医大学动物所提供)，体重(220±20)g，随机分成正常对照组(鼠数=10)，脑外伤组。脑外伤组又分成6、24、48、72、168小时5个不同的时相点(各组鼠数=10)。
对照组动物不作处理，直接活杀取标本；外伤组动物采用自由落体致脑外伤模型[1]，打击力度为3000cm.g，打击深度为5mm，于不同时相点断头，快速取出脑和肺组织，一半作含水量测定，另一半留部分作病理标本，剩余部分测定细胞内游离钙。
, 百拇医药
二、脑、肺细胞游离钙测定[2，3]
取出新鲜脑、肺组织标本置于Hank液中，去除脑表面的软脑膜及血管，洗尽表面的血液，分别剪碎至1mm×1mm×1mm大小，置于装有4ml含0.25%的胰蛋白酶溶液(含NaCL0.2mol/L，KCL5.4mmol/L， Glucose 5.56mmol/L， NaHCO3 16.9mmol/L， EGTA 5.26mmol/L， pH7.8)中，在37℃的水浴箱中保温(脑：20分钟，肺：60分钟)，终止消化后220目铜网过滤，将细胞悬液调制到105～7/ml，台盼蓝检测，活细胞不少于95%，取1ml细胞悬液，加入Fura-2/AM(终浓度5μmol/L)混匀后置于37℃水浴箱中，保温45分钟，最后以F-3010型荧光检测仪测出F、Fmax及Fmin值，按以下公式计算Ca2+浓度
， 37℃时Kd=224。
, 百拇医药
三、脑、肺组织含水量测定[4]
标本吸去表面的水份后称取湿重，置于110℃的电热箱中烘烤24小时，再称取干重，按以下公式计算含水量：
四、病理检查
病理标本分别进行光镜及电镜检查。
五、统计学处理
所有数据以第三军医大学统计程序包进行单因素方差分析及相关分析，数据以
表示。
结 果
一、脑细胞、肺混合细胞内游离钙变化
, 百拇医药
脑外伤后，脑细胞及肺混合细胞内游离钙6小时就明显升高，约为对照组5倍，以后进一步升高，伤后72小时达高峰，约为正常对照组的10倍，此后呈下降趋势，但到伤后7天，仍高于对照组(P?.001)。见表1、2。
二、脑、肺组织含水量的变化
脑组织含水量伤后6小时显著升高(P?.01)，肺组织含水量伤后24小时开始升高(P?.01)，两者都在伤后72小时达到高峰，之后有下降趋势，但到伤后7天仍高于对照组(表3、4)。
三、病理改变
1.光镜改变：伤后6小时可见广泛脑神经细胞肿胀，胞浆疏松，Nissle小体减少或消失，伤后72小时，上述改变更为明显。伤后6小时，肺间质水肿、增宽，小动脉扩张充血，伤后72小时，间质水肿更明显，有大量炎细胞浸润，肺胞腔内有大量的渗出液。
, 百拇医药
2.电镜改变：伤后6小时，神经元呈不同程度的变性，表现为核染色质结块、集边，核仁靠边。胞浆中线粒体嵴断裂、空泡样变，髓鞘样变。伤后72小时，核染色质消失、溶解，血管内皮细胞肿胀，血脑屏障破坏。伤后6小时，肺泡Ⅰ型上皮细胞出现肿胀，局灶性溶解、破坏，基底膜裸露，胞浆中可见线粒体嵴断裂，空泡样变。Ⅱ型上皮细胞绒毛脱落，板层小体排空，肺泡毛细血管内皮细胞胞浆肿胀，管腔变窄。伤后72小时，上述改变更为明显。
讨 论
一、对该动物模型的评价
笔者采用袁绍纪等[1]的自由落体撞击伤模型，该模型的优点在于可以根据研究的需要调整打击重量及高度。为寻找一个理想的脑外伤后致肺部并发症的模型，笔者进行了多次实验，以50g重的砝码从不同高处
表1 脑组织内游离钙的变化
, http://www.100md.com
组别
鼠数
脑外伤后时间(h)
0
6
24
48
72
168
对照组
10
152.3±10.91
外伤组
, http://www.100md.com
10
805.27±64.95**
924.32±62.58**
1214.12±142.76**
1449.34±67.89**
311.73±37.84**
与对照组比较：**P<0.01
表2 肺混合细胞内游离钙的变化
组别
鼠数
, 百拇医药
脑外伤后时间(h)
0
6
24
48
72
168
对照组
10
148.39±10.91
外伤组
10
732.92±65.60**
, http://www.100md.com
918.23±77.61**
1218.77±68.60**
1397.66±86.33**
281.04±43.65**
与对照组比较：**P<0.01
表3 脑组织含水量的变化(g/g干组织)
组别
鼠数
脑外伤后时间(h)
0
, 百拇医药
6
24
48
72
168
对照组
10
3.26±0.15
外伤组
10
3.50±0.11**
3，89±0.15**
, 百拇医药
4.01±0.11**
4.05±0.10**
3.63±0.13**
与对照组比较：**P<0.01
表4 肺组织含水量的变化(g/g干组织)
组别
鼠数
脑外伤后时间(h)
0
6
24
, 百拇医药
48
72
168
对照组
10
3.40±0.13
外伤组
10
3.47±0.12**
4.00±0.17**
4.01±0.13**
4.04±0.14**
, 百拇医药
3.66±0.09**
与对照组比较：**P<0.01
落下打击，力量分别为2000cm.g、2500cm.g及3000cm.g。发现3000cm.g打击时，动物于伤后6小时左右清醒，此时查血气有明显的改变，大体肺组织观察显示双肺体积明显增大，质量增加，双肺有散在出血点，以中下肺严重。由此确定了该实验的致伤条件是3000cm.g，并认为以这种致伤条件建立的致伤模型来研究脑外伤后继发性肺损害是可靠的。
笔者从Ca2+的作用上来探讨其对脑外伤后继发性肺损害的影响，在实验中发现脑外伤后6小时，肺混合
图1 肺泡间质增宽、小动脉明显充血 HE×400
, 百拇医药
图2 肺泡Ⅰ型上皮细胞及血管内皮细胞明显肿胀、基底膜增厚 ×8000
图3 肺泡Ⅱ型上皮细胞绒毛脱落，板层小体排空 ×8000
细胞内的游离钙已显著高于正常对照组，约为对照组的5倍，此后继续升高，伤后72小时达高峰，这一变化与神经细胞内游离钙的变化一致，经相关分析，两者呈非常显著的正相关(P<0.001，r=0.971)，说明两者的变化存在非常密切的关系，或互为因果，或相互影响。研究中还发现肺组织含水量的变化与肺混合细胞内游离钙的变化也呈非常显著的正相关(P<0.001，r=0.823)。这说明Ca2+在继发性肺损害中起着重要作用。肺混合细胞的主要成分是肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞和血管内皮细胞，细胞内游离钙升高后，Ca2+可以向线粒体内转移，首先引起细胞的能量代谢障碍[4]。Ca2+也可以激活细胞内的蛋白酶、蛋白激酶、磷脂酶等[5，6]，使细胞骨架结构受损，造成肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞变性、坏死，血管内皮细胞肿胀，细胞之间的连接破坏，基底膜受损，毛细血管通透性增加，肺泡间质水肿、出血。因此，细胞内钙超载可能是继发性肺损害的重要原因。病理检查的结果也可以证实这一点：光镜下，伤后6小时肺间质水肿、增宽，小动脉扩张充血、伤后72小时，间质水肿更为明显，有大量炎细胞浸润(图1)；电镜下，伤后6小时肺泡Ⅰ型上皮细胞出现肿胀、局灶性溶解、破坏，胞浆中可见线粒体嵴断裂，空泡样变，Ⅱ型上皮细胞绒毛脱落，板层小体排空，肺泡毛细胞血管内皮细胞胞浆肿胀(图2、3)。伤后72小时，上述改变更为明显，而此时恰恰是细胞内钙超载最严重时。这说明，Ca2+的确在脑外伤后继发性肺损害中起了重要作用。姫ぁ迹拢裕病
, 百拇医药
参 考 文 献
1 袁绍纪，朱诚，陈柏林，等.大鼠急性创伤性脑水肿模型的建立.上海医学，1989， 12∶275-278.
2 卢步峰，黄话森，鲁友明.用Fura-2双波长荧光法测定神经细胞内游离钙.生物化学与生物物理学进展，1994， 21∶275-278.
3 Cockcroft S， Baldwin JM， Allan D. The Ca2+ activated pohyphoinsitide phosphodiesterase of human and rabbit neutrophil membranes. Biochem J， 1984， 221∶477-482.
4 Vink R， Head VA， Rogers PJ， et al. Mitochondial metabolise following traumatic brain injury in rats. J Neurotrauma， 1990， 7∶21-27.
, 百拇医药
5 Spitzer NC， Gu X， Olson E. Action potentials calcium transients and the contral of differential excitable cells. Curr Opin Newrobiol， 1994， 4∶70-77.
6 Brorson JR， Manzollillo PA， Miller RJ. Ca2+ entry via AMPa/KA receptors and excitotoxicity in culture cerebellar Purkinje cells. J Neurosci， 1994， 14∶187-197.
(收稿：1997-05-29 修回：1997-10-27), 百拇医药
单位：650032 成都军区昆明总医院神经外科(范润金)；第三军医大学附属西南医院神经外科(王宪荣)
关键词：脑损伤；钙离子；继发性肺损害
中华创伤杂志980113 【摘要】 目的 探讨钙离子(Ca2+)在脑外伤后继发性肺损害中的作用。方法 用自由落体致大鼠脑外伤模型，伤后于5个不同的时相点，分别测定脑细胞、肺混合细胞内游离钙，并取标本作病理检查。结果 伤后6小时，脑细胞及肺混合细胞内游离钙显著升高，伤后72小时达到高峰，两者的变化呈直线正相关。病理检查结果显示伤后72小时，脑、肺组织病理损害最为严重。结论 脑外伤后，Ca2+在继发性肺损害中起着重要作用。
Function of Ca2+ in Secondary Lung Damage After Brain Injury FAN Run-jin*， WANG Xian-rong. *Dept. of Neurosurgery， Kunming General Hospital of Chengdu Military Command， Kunming 650032
, http://www.100md.com
【Abstract】 Aim To find out the function of Ca2+ in secondary pulmonary damage after brain injury. Methods On rats with brain injury resulted from free-falling， the cytosolic Ca2+ in cerebral cells and pneumonocytes was measured respectively at five different time points after injury， as well as the pathologic changes. Results The cytosolic Ca2+ in brain cells and pneumonocytes increased at 6 hours and peaked at 72 hours after injury， and there was a postitive linear correlation between them. The pathologic damage was severest both in brain and lung at 72 hours after injury. Conclusion Ca2+ functions importantly in secondary lung damage after brain injury.
, 百拇医药
【Key words】 Brain injury Ca2+ Secondary lung damage
严重颅脑损伤病人常出现呼吸困难、紫绀等一系列肺部损害的表现。对这一现象发生的机制进行过多方探讨，但结论不一。笔者从Ca2+的变化初步探讨它在脑外伤后继发性肺损害中的作用机制。
材料与方法
一、动物分组及模型
60只Wistar大鼠(由第三军医大学动物所提供)，体重(220±20)g，随机分成正常对照组(鼠数=10)，脑外伤组。脑外伤组又分成6、24、48、72、168小时5个不同的时相点(各组鼠数=10)。
对照组动物不作处理，直接活杀取标本；外伤组动物采用自由落体致脑外伤模型[1]，打击力度为3000cm.g，打击深度为5mm，于不同时相点断头，快速取出脑和肺组织，一半作含水量测定，另一半留部分作病理标本，剩余部分测定细胞内游离钙。
, 百拇医药
二、脑、肺细胞游离钙测定[2，3]
取出新鲜脑、肺组织标本置于Hank液中，去除脑表面的软脑膜及血管，洗尽表面的血液，分别剪碎至1mm×1mm×1mm大小，置于装有4ml含0.25%的胰蛋白酶溶液(含NaCL0.2mol/L，KCL5.4mmol/L， Glucose 5.56mmol/L， NaHCO3 16.9mmol/L， EGTA 5.26mmol/L， pH7.8)中，在37℃的水浴箱中保温(脑：20分钟，肺：60分钟)，终止消化后220目铜网过滤，将细胞悬液调制到105～7/ml，台盼蓝检测，活细胞不少于95%，取1ml细胞悬液，加入Fura-2/AM(终浓度5μmol/L)混匀后置于37℃水浴箱中，保温45分钟，最后以F-3010型荧光检测仪测出F、Fmax及Fmin值，按以下公式计算Ca2+浓度
， 37℃时Kd=224。, 百拇医药
三、脑、肺组织含水量测定[4]
标本吸去表面的水份后称取湿重，置于110℃的电热箱中烘烤24小时，再称取干重，按以下公式计算含水量：
四、病理检查
病理标本分别进行光镜及电镜检查。
五、统计学处理
所有数据以第三军医大学统计程序包进行单因素方差分析及相关分析，数据以
表示。结 果
一、脑细胞、肺混合细胞内游离钙变化
, 百拇医药
脑外伤后，脑细胞及肺混合细胞内游离钙6小时就明显升高，约为对照组5倍，以后进一步升高，伤后72小时达高峰，约为正常对照组的10倍，此后呈下降趋势，但到伤后7天，仍高于对照组(P?.001)。见表1、2。
二、脑、肺组织含水量的变化
脑组织含水量伤后6小时显著升高(P?.01)，肺组织含水量伤后24小时开始升高(P?.01)，两者都在伤后72小时达到高峰，之后有下降趋势，但到伤后7天仍高于对照组(表3、4)。
三、病理改变
1.光镜改变：伤后6小时可见广泛脑神经细胞肿胀，胞浆疏松，Nissle小体减少或消失，伤后72小时，上述改变更为明显。伤后6小时，肺间质水肿、增宽，小动脉扩张充血，伤后72小时，间质水肿更明显，有大量炎细胞浸润，肺胞腔内有大量的渗出液。
, 百拇医药
2.电镜改变：伤后6小时，神经元呈不同程度的变性，表现为核染色质结块、集边，核仁靠边。胞浆中线粒体嵴断裂、空泡样变，髓鞘样变。伤后72小时，核染色质消失、溶解，血管内皮细胞肿胀，血脑屏障破坏。伤后6小时，肺泡Ⅰ型上皮细胞出现肿胀，局灶性溶解、破坏，基底膜裸露，胞浆中可见线粒体嵴断裂，空泡样变。Ⅱ型上皮细胞绒毛脱落，板层小体排空，肺泡毛细血管内皮细胞胞浆肿胀，管腔变窄。伤后72小时，上述改变更为明显。
讨 论
一、对该动物模型的评价
笔者采用袁绍纪等[1]的自由落体撞击伤模型，该模型的优点在于可以根据研究的需要调整打击重量及高度。为寻找一个理想的脑外伤后致肺部并发症的模型，笔者进行了多次实验，以50g重的砝码从不同高处
表1 脑组织内游离钙的变化
, http://www.100md.com
组别
鼠数
脑外伤后时间(h)
0
6
24
48
72
168
对照组
10
152.3±10.91
外伤组
, http://www.100md.com
10
805.27±64.95**
924.32±62.58**
1214.12±142.76**
1449.34±67.89**
311.73±37.84**
与对照组比较：**P<0.01
表2 肺混合细胞内游离钙的变化
组别
鼠数
, 百拇医药
脑外伤后时间(h)
0
6
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对照组
10
148.39±10.91
外伤组
10
732.92±65.60**
, http://www.100md.com
918.23±77.61**
1218.77±68.60**
1397.66±86.33**
281.04±43.65**
与对照组比较：**P<0.01
表3 脑组织含水量的变化(g/g干组织)
组别
鼠数
脑外伤后时间(h)
0
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6
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对照组
10
3.26±0.15
外伤组
10
3.50±0.11**
3，89±0.15**
, 百拇医药
4.01±0.11**
4.05±0.10**
3.63±0.13**
与对照组比较：**P<0.01
表4 肺组织含水量的变化(g/g干组织)
组别
鼠数
脑外伤后时间(h)
0
6
24
, 百拇医药
48
72
168
对照组
10
3.40±0.13
外伤组
10
3.47±0.12**
4.00±0.17**
4.01±0.13**
4.04±0.14**
, 百拇医药
3.66±0.09**
与对照组比较：**P<0.01
落下打击，力量分别为2000cm.g、2500cm.g及3000cm.g。发现3000cm.g打击时，动物于伤后6小时左右清醒，此时查血气有明显的改变，大体肺组织观察显示双肺体积明显增大，质量增加，双肺有散在出血点，以中下肺严重。由此确定了该实验的致伤条件是3000cm.g，并认为以这种致伤条件建立的致伤模型来研究脑外伤后继发性肺损害是可靠的。
笔者从Ca2+的作用上来探讨其对脑外伤后继发性肺损害的影响，在实验中发现脑外伤后6小时，肺混合
图1 肺泡间质增宽、小动脉明显充血 HE×400
, 百拇医药
图2 肺泡Ⅰ型上皮细胞及血管内皮细胞明显肿胀、基底膜增厚 ×8000
图3 肺泡Ⅱ型上皮细胞绒毛脱落，板层小体排空 ×8000
细胞内的游离钙已显著高于正常对照组，约为对照组的5倍，此后继续升高，伤后72小时达高峰，这一变化与神经细胞内游离钙的变化一致，经相关分析，两者呈非常显著的正相关(P<0.001，r=0.971)，说明两者的变化存在非常密切的关系，或互为因果，或相互影响。研究中还发现肺组织含水量的变化与肺混合细胞内游离钙的变化也呈非常显著的正相关(P<0.001，r=0.823)。这说明Ca2+在继发性肺损害中起着重要作用。肺混合细胞的主要成分是肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞和血管内皮细胞，细胞内游离钙升高后，Ca2+可以向线粒体内转移，首先引起细胞的能量代谢障碍[4]。Ca2+也可以激活细胞内的蛋白酶、蛋白激酶、磷脂酶等[5，6]，使细胞骨架结构受损，造成肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞变性、坏死，血管内皮细胞肿胀，细胞之间的连接破坏，基底膜受损，毛细血管通透性增加，肺泡间质水肿、出血。因此，细胞内钙超载可能是继发性肺损害的重要原因。病理检查的结果也可以证实这一点：光镜下，伤后6小时肺间质水肿、增宽，小动脉扩张充血、伤后72小时，间质水肿更为明显，有大量炎细胞浸润(图1)；电镜下，伤后6小时肺泡Ⅰ型上皮细胞出现肿胀、局灶性溶解、破坏，胞浆中可见线粒体嵴断裂，空泡样变，Ⅱ型上皮细胞绒毛脱落，板层小体排空，肺泡毛细胞血管内皮细胞胞浆肿胀(图2、3)。伤后72小时，上述改变更为明显，而此时恰恰是细胞内钙超载最严重时。这说明，Ca2+的确在脑外伤后继发性肺损害中起了重要作用。姫ぁ迹拢裕病
, 百拇医药
参 考 文 献
1 袁绍纪，朱诚，陈柏林，等.大鼠急性创伤性脑水肿模型的建立.上海医学，1989， 12∶275-278.
2 卢步峰，黄话森，鲁友明.用Fura-2双波长荧光法测定神经细胞内游离钙.生物化学与生物物理学进展，1994， 21∶275-278.
3 Cockcroft S， Baldwin JM， Allan D. The Ca2+ activated pohyphoinsitide phosphodiesterase of human and rabbit neutrophil membranes. Biochem J， 1984， 221∶477-482.
4 Vink R， Head VA， Rogers PJ， et al. Mitochondial metabolise following traumatic brain injury in rats. J Neurotrauma， 1990， 7∶21-27.
, 百拇医药
5 Spitzer NC， Gu X， Olson E. Action potentials calcium transients and the contral of differential excitable cells. Curr Opin Newrobiol， 1994， 4∶70-77.
6 Brorson JR， Manzollillo PA， Miller RJ. Ca2+ entry via AMPa/KA receptors and excitotoxicity in culture cerebellar Purkinje cells. J Neurosci， 1994， 14∶187-197.
(收稿：1997-05-29 修回：1997-10-27), 百拇医药