定量聚合酶链反应在检测丙型肝炎病毒感染血清中的应用
作者：李伯安 马洪滨 薛净 乔小红 程云
单位：100039 北京解放军第302医院
关键词：
中华传染病杂志980117 对于HCV RNA的检测，目前多采用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)的方法[1]。该方法仅能定性，步骤多，操作繁琐。整个过程中需多次转换离心管，增加了交叉污染的机会。在结果判定时通过电泳在紫外光下肉眼鉴别，增加了主观性，而定量PCR方法采用荧光转换原理应用特异荧光集团标记的引物进行RT-PCR。我们用定量PCR方法检测了123例临床血清标本的HCV RNA，并将检测结果与套式定性PCR相比较，现报告如下。 材料和方法
一、材料
(一) 标本来源 123例血清随机取自1995年12月～1996年3月本院根据1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的方案诊断为丙型肝炎的门诊及住院患者，男72例，女51例；年龄11～72岁。
, 百拇医药
(二) 主要试剂 HCV RNA定量PCR试剂盒由美国AcuGen公司提供，批号：101-63-R。其中逆转录引物：5′CCTGGCAATTCCGGTGTAC-
TC 3′，逆转录产物为HCV RNA 5′端非编码区基因；不对称扩增引物：5′GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTT-
AGTA 3′，扩增产物为逆转录产物HCV cDNA内长度为211bp的片断；荧光引物：5′CAGCCTCCAGGACCC-
CC 3′，扩增产物为不对称扩增产物内长度为66bp的片断。
二、方法
(一) 定量PCR 1.标本处理采用二氧化硅吸附法提取RNA模板。2.逆转录、不对称扩增及荧光引物参与的扩增均按试剂盒操作说明书进行。3.定量检测通过荧光检测仪检测各个反应体系的荧光强度。再通过统计计算，根据试验中设定的阴性对照、最大信号对照、五个含不同量HCV cDNA阳性标准对照的荧光强度变化，计算出待测标本中HCV RNA的含量。
, 百拇医药
(二) 定性RT-PCR 按参考文献[2～4]方法进行。
结 果
将阳性标准品中HCV cDNA的含量输入计算机，由计算机辅助完成数据读取及定量分析。正常值范围(阴性)定为<101/微升。本研究所选取的标本均同时进行了定量RT-PCR试验及定性套式RT-PCR试验。结果见附表。以定量实验为标准，定性实验的阳性漏检率为4.12%，阴性漏检率为7.69%,两者相对符合率为95.12%。
附表 PCR定性与PCR定量比较 项 目
HCV RNA定量结果(拷贝/微升)
<101
101～105
, http://www.100md.com
>105
合计
巢式 (+)
4
77
16
97
定性 (-)
24
2
0
26
合 计
, http://www.100md.com
28
79
16
123
讨 论
定性RT-PCR进行双扩增总循环数为60个，而定量中仅进行了40个循环左右，所以定量的敏感性可能不及定性反应，但非特异性将低于定性反应。两例定量为阳性而定性为阴性的标本的抗-HCV-IgG均为阳性，所以不排除定性试验中假阳性的存在。定量与定性相比较操作简便且血清用量少，结果判定通过荧光检测仪由计算机辅助完成简化了步骤并增加了结果的可靠性。
定量试验采用二氧化硅吸附法，提取HCV RNA模板，并通过不对称引物进行逆转录，然后加入耐热DNA聚合酶进行不对称扩增，再加入荧光标记的信号引物继续扩增。信号引物是在引物的上标记一具有荧光特性的化学集团，且只有在与引物链结合时才具有荧光特性。在PCR循环过程中变性使引物与荧光集团分离，而复性时引物将优先与不对称扩增产物结合，从而失去了结合荧光集团的特性。未能与DNA结合的引物将重新与荧光集团结合再现荧光特性。这样，随着PCR循环的继续，周而复始产生的DNA片断的量越多荧光强度将减弱越多。而在每次试验中将加入已知含量的标准HCV cDNA，在待测品与标准品荧光强度的减弱量相比较后，即可计算出定量的数值。
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定性试验中由于进行套式PCR总扩增达到60个循环，待测血清标本中HCV RNA含量高的在循环进程中首先进入PCR平台期，使余下的循环中扩增效率急剧下降，而HCV RNA含量低的标本在继续循环中也可相继进入平台期，最终导致在60个循环结束时各个体系中扩增产物量相近。因结果观察需通过电泳目测，难于对扩增产物定量。鉴于以上原因此试验方法仅能进行定性分析。
定量PCR同时受着一些因素的影响。模板提取的效率，逆转录的效率都将直接影响结果的准确性。定量操作对人员要求严格，加样量一定要准确且重复性好。还有定量的设备成本远高于定性。以上诸多因素都将影响这一新技术的推广。
参考文献
1 Kaneko S, Murakami S, Unoura M, et al. Quantitation of hepatitis virus RNA by competitive polymerase chain reaction. J Med Viral, 1992, 37:278-282.
2 Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. J Clin Microbiol,1990,28:495-503.
3 戎广亚，杨守纯，乔小江，等.利用双扩增聚合酶链反应检测非甲非乙型肝炎血清中丙型肝炎病毒RNA.中华实验和临床病毒学杂志，1994，8：252-255.
4 杜绍材，陶其敏，孙炎，等.双PCR检测丙型肝炎病毒RNA.北京医科大学学报，1991，60：215-219., http://www.100md.com
单位：100039 北京解放军第302医院
关键词：
中华传染病杂志980117 对于HCV RNA的检测，目前多采用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)的方法[1]。该方法仅能定性，步骤多，操作繁琐。整个过程中需多次转换离心管，增加了交叉污染的机会。在结果判定时通过电泳在紫外光下肉眼鉴别，增加了主观性，而定量PCR方法采用荧光转换原理应用特异荧光集团标记的引物进行RT-PCR。我们用定量PCR方法检测了123例临床血清标本的HCV RNA，并将检测结果与套式定性PCR相比较，现报告如下。 材料和方法
一、材料
(一) 标本来源 123例血清随机取自1995年12月～1996年3月本院根据1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的方案诊断为丙型肝炎的门诊及住院患者，男72例，女51例；年龄11～72岁。
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(二) 主要试剂 HCV RNA定量PCR试剂盒由美国AcuGen公司提供，批号：101-63-R。其中逆转录引物：5′CCTGGCAATTCCGGTGTAC-
TC 3′，逆转录产物为HCV RNA 5′端非编码区基因；不对称扩增引物：5′GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTT-
AGTA 3′，扩增产物为逆转录产物HCV cDNA内长度为211bp的片断；荧光引物：5′CAGCCTCCAGGACCC-
CC 3′，扩增产物为不对称扩增产物内长度为66bp的片断。
二、方法
(一) 定量PCR 1.标本处理采用二氧化硅吸附法提取RNA模板。2.逆转录、不对称扩增及荧光引物参与的扩增均按试剂盒操作说明书进行。3.定量检测通过荧光检测仪检测各个反应体系的荧光强度。再通过统计计算，根据试验中设定的阴性对照、最大信号对照、五个含不同量HCV cDNA阳性标准对照的荧光强度变化，计算出待测标本中HCV RNA的含量。
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(二) 定性RT-PCR 按参考文献[2～4]方法进行。
结 果
将阳性标准品中HCV cDNA的含量输入计算机，由计算机辅助完成数据读取及定量分析。正常值范围(阴性)定为<101/微升。本研究所选取的标本均同时进行了定量RT-PCR试验及定性套式RT-PCR试验。结果见附表。以定量实验为标准，定性实验的阳性漏检率为4.12%，阴性漏检率为7.69%,两者相对符合率为95.12%。
附表 PCR定性与PCR定量比较 项 目
HCV RNA定量结果(拷贝/微升)
<101
101～105
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>105
合计
巢式 (+)
4
77
16
97
定性 (-)
24
2
0
26
合 计
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28
79
16
123
讨 论
定性RT-PCR进行双扩增总循环数为60个，而定量中仅进行了40个循环左右，所以定量的敏感性可能不及定性反应，但非特异性将低于定性反应。两例定量为阳性而定性为阴性的标本的抗-HCV-IgG均为阳性，所以不排除定性试验中假阳性的存在。定量与定性相比较操作简便且血清用量少，结果判定通过荧光检测仪由计算机辅助完成简化了步骤并增加了结果的可靠性。
定量试验采用二氧化硅吸附法，提取HCV RNA模板，并通过不对称引物进行逆转录，然后加入耐热DNA聚合酶进行不对称扩增，再加入荧光标记的信号引物继续扩增。信号引物是在引物的上标记一具有荧光特性的化学集团，且只有在与引物链结合时才具有荧光特性。在PCR循环过程中变性使引物与荧光集团分离，而复性时引物将优先与不对称扩增产物结合，从而失去了结合荧光集团的特性。未能与DNA结合的引物将重新与荧光集团结合再现荧光特性。这样，随着PCR循环的继续，周而复始产生的DNA片断的量越多荧光强度将减弱越多。而在每次试验中将加入已知含量的标准HCV cDNA，在待测品与标准品荧光强度的减弱量相比较后，即可计算出定量的数值。
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定性试验中由于进行套式PCR总扩增达到60个循环，待测血清标本中HCV RNA含量高的在循环进程中首先进入PCR平台期，使余下的循环中扩增效率急剧下降，而HCV RNA含量低的标本在继续循环中也可相继进入平台期，最终导致在60个循环结束时各个体系中扩增产物量相近。因结果观察需通过电泳目测，难于对扩增产物定量。鉴于以上原因此试验方法仅能进行定性分析。
定量PCR同时受着一些因素的影响。模板提取的效率，逆转录的效率都将直接影响结果的准确性。定量操作对人员要求严格，加样量一定要准确且重复性好。还有定量的设备成本远高于定性。以上诸多因素都将影响这一新技术的推广。
参考文献
1 Kaneko S, Murakami S, Unoura M, et al. Quantitation of hepatitis virus RNA by competitive polymerase chain reaction. J Med Viral, 1992, 37:278-282.
2 Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. J Clin Microbiol,1990,28:495-503.
3 戎广亚，杨守纯，乔小江，等.利用双扩增聚合酶链反应检测非甲非乙型肝炎血清中丙型肝炎病毒RNA.中华实验和临床病毒学杂志，1994，8：252-255.
4 杜绍材，陶其敏，孙炎，等.双PCR检测丙型肝炎病毒RNA.北京医科大学学报，1991，60：215-219., http://www.100md.com