静脉毒瘾者84例HGV感染状况
作者：李刚 陈青 姚集鲁 汤文辉 谭德
单位：510630 广州，中山医科大学(李刚、陈青、姚集鲁)；昆明医学院附属一院(汤文辉)；美国国立卫生研究院(谭德)
关键词：肝炎病毒，庚型；聚合酶链反应
中华传染病杂志980112 【摘要】 目的 调查庚型肝炎病毒(HGV)在静脉毒瘾者中的感染状况。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测84例静脉毒瘾者血浆标本。HGV RNA经热变性法提取后逆转录为cDNA,在HGV 5′非编码区(5′NCR)设计两对引物进行巢式扩增，产物为238bp，并经限制性内切酶HpaⅡ鉴定扩增产物来自HGV。结果 84例中有15例为HGV RNA阳性，阳性率为17.9%。HGV RNA阳性病例中11例合并丙型肝炎病毒感染(11/15)。结论 静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群；不洁注射是获得HGV感染的重要途径。
, 百拇医药
Prevalence of hepatitis G virus infection in 84 intravenous drug users Li Gang, Chen Qing, Yao Jilu, et al. Department of Infectious Diseases, Zhongshan Medical University, Guangzhou 510630
【Abstract】 Objective To investigate the epidemiology of hepatitis G virus (HGV) infection in intravenous drug users (IVDU).Methods HGV RNA in plasma of 84 IVDUs was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). HGV RNA extracted by the heat denaturalization method was retro-transcribed into cDNA before PCR was performed, using two pairs of primers designed from the 5′ end noncoding region of HGV. The amplified product with 238bp was identified as specific fragment of HGV by the digestion of restriction endonuclease HpaⅡ. Results The results showed that 15 of the 84(17.9%) IVDUs were positive for HGV RNA and 11 of 15 positive plasma samples were coinfected with hepatitis C virus (HGV). Conclusion IVDUs were the high risk population for HGV infection and needle sharing and no sterilizing of injectors served as important route for the transmission of HGV.
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【Key words】 Hepatitis G virus Polymerase chain reaction
庚型肝炎病毒(HGV)是一种RNA病毒，基因组结构类似黄病毒属[1，2]。HGV主要经输血及注射传播，可在急性或慢性肝炎患者中检测到，常导致持续病毒血症，引起的临床症状轻微或无症状。国外报道HGV与HGV双重感染多见，可能与两种病毒具有共同的危险因素有关，如传播途径相似等。静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群，为了解HGV在这一人群的感染状况，本文作者对84例静脉毒瘾者进行了流行病学调查。
材料与方法
一、标本来源
取自云南省昆明市某强制戒毒所的静脉毒瘾者，共84例，其中男48例，女36例，年龄16～45岁。均无输注血制品史。标本在1994年1月采集，-20℃以下保存。阳性对照质粒标本来自美国国立卫生研究院(NIH)。
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二、引物
引物根据Genbank中GBV-C序列(U36380)、HGV PNF2161株序列(U44402)及HGV R10291株序列(U45966)设计。位置及序列如下：G15′ATGCGTGATGACAGGGTTGG 3′(+)(117-136，按PNF2161株位置，下同)；G25′TAGGTGGCCCCATGCATTTCC 3′(-)(451-471)；G35′GGTAGCCACTATAGGTGGGT 3′(+)(161-180)；G45′CACTGGTCCTTGTCA-
ACTCG 3′(-)(379-398)。G1，G2为外引物，G3，G4为内引物，巢式扩增后产物为238bp。
三、RT-PCR
采用热变性法制备RNA模板[3]，取待检血浆标本及阳性对照质粒标本各100μl，分别加入裂解液10μl(主要成份为2-巯基乙醇)，95℃15分钟，10 000r/min离心5分钟，取裂解上清10μl进行逆转录，逆转录反应体积20μl，内含引物G2 100ng，AMV逆转录酶10单位，0.25mmol/L dNTP 2μl, RNasin 40单位，10×buffer 2μl。42℃ 45分钟。第一次PCR反应体积为40μl，含逆转录液20μl，引物G1 100ng，G2 50ng,0.25mmol/L dNTP 4μl,10×buffer 4μl,Taq DNA聚合酶2单位。在94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 40秒，循环30次，72℃延伸反应7分钟。第二次PCR反应体积为50μl，内含第一次PCR反应液10μl，引物G3 100ng，G4 100ng，0.25mmol/L dNTP 5μl,10×buffer 5μl，Taq DNA聚合酶2单位，循环条件同第一次PCR。取10μl在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，与标准分子量作对照，在紫外灯下观察结果。
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四、酶切鉴定PCR产物
PCR产物在低熔点琼脂糖中电泳，切下相应条带处凝胶，经琼脂酶消化，酒精沉淀，获得的纯化产物用限制性内切酶HpaⅡ消化，反应液在18%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，EB染色后观察结果。
五、抗-HCV检测
采用上海科华生物技术公司生产的ELISA试剂盒检测抗-HCV，包被抗原含结构蛋白核心区和非结构蛋白NS3区多肽，根据试剂盒说明进行操作及判定结果。
结 果
一、HGV RNA的检测
在HGV 5′ NCR设计两对HGV特异引物，采用巢式PCR检测静脉毒瘾者血浆中HGV核酸。首先将热变性提取的HGV RNA逆转录为cDNA，再经两次PCR扩增，产物电泳后见单一条带，与DNA分子量标准作对照，产物片段大小与预定相符，为238bp，用NIH提供的阳性标本作参照，结果一致(见图1)。
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二、PCR产物酶切鉴定
参考国外发表的HGV序列，在251及271两个位置有HpaⅡ酶切位点，用HpaⅡ酶切PCR产物后有3个片段，分别为91bp,19bp和128bp，因为19bp片段太小，电泳后难以观察到，只能观察到另两条带(见图2)。
1.静脉毒瘾者HGV RNA阳性的扩增产物
2.123bp DNA分子量标准
3.阳性对照标本的扩增产物
图1 RT-PCR检测静脉毒瘾者血浆HGV RNA
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1.PCR产物经Hpa Ⅱ酶切后
2.酶切前PCR产物
3.123bp DNA分子量标准
图2 酶切鉴定PCR产物
三、静脉毒瘾者HGV感染状况
84例静脉毒瘾者中有15例检测到HGV RNA，阳性率为17.9%(15/84)。48份男性病例中11例HGV RNA阳性，阳性率为22.9%(11/48)。36份女性病例中4份HGV RNA阳性，阳性率为11.1%。经卡方检验分析，在不同性别静脉毒瘾者中HGV感染无统计学意义。
在84例中68例抗-HCV阳性，16例阴性，阳性率为80.95%(68/84)。68例抗HCV阳性样本中11例HGV RNA阳性，阳性率为16.2%(11/68)；阴性的16例中4例HGV RNA阳性，阳性率25%(4/16)。统计学分析发现，HGV感染率与是否存在抗-HCV阳性无相关。
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讨 论
庚型肝炎病毒是近1年来经反向病毒学方法克隆鉴定的新型肝炎病毒。Leary等[1，2]报道的GBV-C及Linnen等报道的HGV实际上为同一型肝炎病毒。
HGV在我国的研究正在起步阶段，其在各种人群的感染状况仍未明了，根据国外采用RT-PCR方法进行的流行病学调查显示，在自愿献血员中HGV RNA阳性率达1%～2%，多次接受输血者感染率在10%～14%，在未知病原的肝病患者中感染率为9%[4]。现认为HGV是一种全球性分布的病毒，已在美国，澳大利亚，西非，欧洲，日本等国家发现。我国是病毒性肝炎高发区，存在HGV感染不容置疑。
根据国外已发表的3株序列(GBV-C，HGV PNF2161，HGV R10291)，在5′端非编码区3株病毒保守区段设计引物，采用RT-PCR方法检测HGV RNA，以NIH提供的阳性对照质粒标本作参照。PCR产物经HpaⅡ酶切鉴定，证实是HGV的特异性片段。用本文建立的RT-PCR检测采自云南昆明市84例静脉毒瘾者血浆标本，其中15例HGV RNA阳性。
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有证据显示，HGV主要经输血及注射途径传播，少部分为社区获得。我们对84例静脉毒瘾者HGV感染状况调查发现，此特殊人群HGV感染率为17.86%。虽然其感染率低于HCV，但仍不容忽视，比正常人群(国外报道的)感染率高10多倍，调查证实静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群，注射(特别是不洁注射或共用注射器)是传播HGV的重要途径。
统计学分析显示，静脉吸毒者中HGV在不同性别的感染率无差异。另外，有报道HGV与HCV双重感染多见，本文检测的静脉毒瘾者标本HGV RNA阳性的15例中，有11例合并HCV感染。但经统计学分析发现，HGV感染与是否已存在HCV感染无关。两型病毒混合感染率高是因为具有共同的危险因素，均由注射途径传播所致。
本课题获国家自然科学基金(编号 39600130)及广东省卫生厅科研基金资助
参考文献
, http://www.100md.com 1 Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of the Flaviviridae associated with human non A-E hepatitis. J Med Virol, 1995, 48:60-67.
2 Linnen J, Wages J, Zhang-keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271:505-508.
3 高志良，姚集鲁.热变性HCV RNA模板直接法扩增.中山医科大学学报，1994，15：68.
4 Yoshiba M. Okamoto H, Mishiro S. Detection of the GBV-C hepatitis virus genome in serum from patients with fluminant hepatitis of unknown aetiology. The Lancet, 1995,346:1131-1132., 百拇医药
单位：510630 广州，中山医科大学(李刚、陈青、姚集鲁)；昆明医学院附属一院(汤文辉)；美国国立卫生研究院(谭德)
关键词：肝炎病毒，庚型；聚合酶链反应
中华传染病杂志980112 【摘要】 目的 调查庚型肝炎病毒(HGV)在静脉毒瘾者中的感染状况。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测84例静脉毒瘾者血浆标本。HGV RNA经热变性法提取后逆转录为cDNA,在HGV 5′非编码区(5′NCR)设计两对引物进行巢式扩增，产物为238bp，并经限制性内切酶HpaⅡ鉴定扩增产物来自HGV。结果 84例中有15例为HGV RNA阳性，阳性率为17.9%。HGV RNA阳性病例中11例合并丙型肝炎病毒感染(11/15)。结论 静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群；不洁注射是获得HGV感染的重要途径。
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Prevalence of hepatitis G virus infection in 84 intravenous drug users Li Gang, Chen Qing, Yao Jilu, et al. Department of Infectious Diseases, Zhongshan Medical University, Guangzhou 510630
【Abstract】 Objective To investigate the epidemiology of hepatitis G virus (HGV) infection in intravenous drug users (IVDU).Methods HGV RNA in plasma of 84 IVDUs was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). HGV RNA extracted by the heat denaturalization method was retro-transcribed into cDNA before PCR was performed, using two pairs of primers designed from the 5′ end noncoding region of HGV. The amplified product with 238bp was identified as specific fragment of HGV by the digestion of restriction endonuclease HpaⅡ. Results The results showed that 15 of the 84(17.9%) IVDUs were positive for HGV RNA and 11 of 15 positive plasma samples were coinfected with hepatitis C virus (HGV). Conclusion IVDUs were the high risk population for HGV infection and needle sharing and no sterilizing of injectors served as important route for the transmission of HGV.
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【Key words】 Hepatitis G virus Polymerase chain reaction
庚型肝炎病毒(HGV)是一种RNA病毒，基因组结构类似黄病毒属[1，2]。HGV主要经输血及注射传播，可在急性或慢性肝炎患者中检测到，常导致持续病毒血症，引起的临床症状轻微或无症状。国外报道HGV与HGV双重感染多见，可能与两种病毒具有共同的危险因素有关，如传播途径相似等。静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群，为了解HGV在这一人群的感染状况，本文作者对84例静脉毒瘾者进行了流行病学调查。
材料与方法
一、标本来源
取自云南省昆明市某强制戒毒所的静脉毒瘾者，共84例，其中男48例，女36例，年龄16～45岁。均无输注血制品史。标本在1994年1月采集，-20℃以下保存。阳性对照质粒标本来自美国国立卫生研究院(NIH)。
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二、引物
引物根据Genbank中GBV-C序列(U36380)、HGV PNF2161株序列(U44402)及HGV R10291株序列(U45966)设计。位置及序列如下：G15′ATGCGTGATGACAGGGTTGG 3′(+)(117-136，按PNF2161株位置，下同)；G25′TAGGTGGCCCCATGCATTTCC 3′(-)(451-471)；G35′GGTAGCCACTATAGGTGGGT 3′(+)(161-180)；G45′CACTGGTCCTTGTCA-
ACTCG 3′(-)(379-398)。G1，G2为外引物，G3，G4为内引物，巢式扩增后产物为238bp。
三、RT-PCR
采用热变性法制备RNA模板[3]，取待检血浆标本及阳性对照质粒标本各100μl，分别加入裂解液10μl(主要成份为2-巯基乙醇)，95℃15分钟，10 000r/min离心5分钟，取裂解上清10μl进行逆转录，逆转录反应体积20μl，内含引物G2 100ng，AMV逆转录酶10单位，0.25mmol/L dNTP 2μl, RNasin 40单位，10×buffer 2μl。42℃ 45分钟。第一次PCR反应体积为40μl，含逆转录液20μl，引物G1 100ng，G2 50ng,0.25mmol/L dNTP 4μl,10×buffer 4μl,Taq DNA聚合酶2单位。在94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 40秒，循环30次，72℃延伸反应7分钟。第二次PCR反应体积为50μl，内含第一次PCR反应液10μl，引物G3 100ng，G4 100ng，0.25mmol/L dNTP 5μl,10×buffer 5μl，Taq DNA聚合酶2单位，循环条件同第一次PCR。取10μl在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，与标准分子量作对照，在紫外灯下观察结果。
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四、酶切鉴定PCR产物
PCR产物在低熔点琼脂糖中电泳，切下相应条带处凝胶，经琼脂酶消化，酒精沉淀，获得的纯化产物用限制性内切酶HpaⅡ消化，反应液在18%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，EB染色后观察结果。
五、抗-HCV检测
采用上海科华生物技术公司生产的ELISA试剂盒检测抗-HCV，包被抗原含结构蛋白核心区和非结构蛋白NS3区多肽，根据试剂盒说明进行操作及判定结果。
结 果
一、HGV RNA的检测
在HGV 5′ NCR设计两对HGV特异引物，采用巢式PCR检测静脉毒瘾者血浆中HGV核酸。首先将热变性提取的HGV RNA逆转录为cDNA，再经两次PCR扩增，产物电泳后见单一条带，与DNA分子量标准作对照，产物片段大小与预定相符，为238bp，用NIH提供的阳性标本作参照，结果一致(见图1)。
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二、PCR产物酶切鉴定
参考国外发表的HGV序列，在251及271两个位置有HpaⅡ酶切位点，用HpaⅡ酶切PCR产物后有3个片段，分别为91bp,19bp和128bp，因为19bp片段太小，电泳后难以观察到，只能观察到另两条带(见图2)。
1.静脉毒瘾者HGV RNA阳性的扩增产物
2.123bp DNA分子量标准
3.阳性对照标本的扩增产物
图1 RT-PCR检测静脉毒瘾者血浆HGV RNA
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1.PCR产物经Hpa Ⅱ酶切后
2.酶切前PCR产物
3.123bp DNA分子量标准
图2 酶切鉴定PCR产物
三、静脉毒瘾者HGV感染状况
84例静脉毒瘾者中有15例检测到HGV RNA，阳性率为17.9%(15/84)。48份男性病例中11例HGV RNA阳性，阳性率为22.9%(11/48)。36份女性病例中4份HGV RNA阳性，阳性率为11.1%。经卡方检验分析，在不同性别静脉毒瘾者中HGV感染无统计学意义。
在84例中68例抗-HCV阳性，16例阴性，阳性率为80.95%(68/84)。68例抗HCV阳性样本中11例HGV RNA阳性，阳性率为16.2%(11/68)；阴性的16例中4例HGV RNA阳性，阳性率25%(4/16)。统计学分析发现，HGV感染率与是否存在抗-HCV阳性无相关。
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讨 论
庚型肝炎病毒是近1年来经反向病毒学方法克隆鉴定的新型肝炎病毒。Leary等[1，2]报道的GBV-C及Linnen等报道的HGV实际上为同一型肝炎病毒。
HGV在我国的研究正在起步阶段，其在各种人群的感染状况仍未明了，根据国外采用RT-PCR方法进行的流行病学调查显示，在自愿献血员中HGV RNA阳性率达1%～2%，多次接受输血者感染率在10%～14%，在未知病原的肝病患者中感染率为9%[4]。现认为HGV是一种全球性分布的病毒，已在美国，澳大利亚，西非，欧洲，日本等国家发现。我国是病毒性肝炎高发区，存在HGV感染不容置疑。
根据国外已发表的3株序列(GBV-C，HGV PNF2161，HGV R10291)，在5′端非编码区3株病毒保守区段设计引物，采用RT-PCR方法检测HGV RNA，以NIH提供的阳性对照质粒标本作参照。PCR产物经HpaⅡ酶切鉴定，证实是HGV的特异性片段。用本文建立的RT-PCR检测采自云南昆明市84例静脉毒瘾者血浆标本，其中15例HGV RNA阳性。
, http://www.100md.com
有证据显示，HGV主要经输血及注射途径传播，少部分为社区获得。我们对84例静脉毒瘾者HGV感染状况调查发现，此特殊人群HGV感染率为17.86%。虽然其感染率低于HCV，但仍不容忽视，比正常人群(国外报道的)感染率高10多倍，调查证实静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群，注射(特别是不洁注射或共用注射器)是传播HGV的重要途径。
统计学分析显示，静脉吸毒者中HGV在不同性别的感染率无差异。另外，有报道HGV与HCV双重感染多见，本文检测的静脉毒瘾者标本HGV RNA阳性的15例中，有11例合并HCV感染。但经统计学分析发现，HGV感染与是否已存在HCV感染无关。两型病毒混合感染率高是因为具有共同的危险因素，均由注射途径传播所致。
本课题获国家自然科学基金(编号 39600130)及广东省卫生厅科研基金资助
参考文献
, http://www.100md.com 1 Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of the Flaviviridae associated with human non A-E hepatitis. J Med Virol, 1995, 48:60-67.
2 Linnen J, Wages J, Zhang-keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271:505-508.
3 高志良，姚集鲁.热变性HCV RNA模板直接法扩增.中山医科大学学报，1994，15：68.
4 Yoshiba M. Okamoto H, Mishiro S. Detection of the GBV-C hepatitis virus genome in serum from patients with fluminant hepatitis of unknown aetiology. The Lancet, 1995,346:1131-1132., 百拇医药