甲型肝炎患者淋巴细胞糖皮质激素受体表达与血清皮质醇相关性研究
作者：韩焕兴 孔宪涛 张国治 李石 周廷森
单位：200003 上海，第二军医大学长征医院(韩焕兴、孔宪涛、张国治、李石)；第二军医大学药学系(周廷森)
关键词：受体，糖皮质激素；流式细胞术；肝炎，甲型
中华传染病杂志980110 【摘要】 目的 探索甲型病毒性肝炎患者外周血淋巴细胞糖皮质激素受体(GR)的表达与血清中皮质醇激素浓度的相互关系。方法 分别对部分正常人和32例急性甲型肝炎患者淋巴细胞内GR表达状况进行了流式细胞仪测定，同时应用放射免疫分析法测定其血清皮质醇含量。结果 甲型肝炎患者在急性期其血清皮质醇含量显著高于正常对照组，分别为210±76μg/L，142±83μg/L(患者组与正常人组比较P<0.01)；患者淋巴细胞内的GR含量则较正常人群明显降低。以本研究的实测值为标准，正常人GR阳性淋巴细胞为14.2%±6.88%，而患者组降低至8.5%±4.07%，GR表达与血清皮质醇含量间呈明显的负相关。结论 血清皮质醇水平与GR受体间存在对应关系并可能与患者的免疫状态与病情密切相关。
, http://www.100md.com
A study on glucocorticoid receptor expression in PBL lymphocyte and its relation with serum glucocorticosteroid contents in type A hepatitis patients Han Huanxing, Kong Xiantao, Zhang Guozhi, et al. Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective In order to study the glucocorticoid receptor (GR) expression in lymphocyte and its relation with serum glucocorticosteroids contents in acute hepatitis A patients. Methods GR expression in lymphocyte was measured with flowcytometer and serum glucocorticosteroids contents were determined with RIA respectively in 32 acute type A hepatitis patients and 30 health persons. Results Lymphocyte GR expressions in patients in acute stage of the disease are obviously lower than that of control group and the proportion of GR positive lymphocytes decreased from 14.2%±6.88% to 8.5%±4.07%, whereas the serum glucocorticosteroids levels are markedly higher in patients than that of health group (210±76μg/L∶142±83μg/L).Conclusion There is a negative correlation between the two parameters and the abnormal serum glucocorticosteroids contents and GR expression in patients may be related to the course of the disease.
, 百拇医药
【Key words】 Receptors glucocorticoid Flow cytometry Hepatitis A
病毒性肝炎是嗜肝病毒侵入肝细胞复制、增殖，引发一系列免疫损伤的传染性疾病。在某种程度上，病原所致的损伤主要是自身免疫性损伤[1，2]。糖皮质激素(GH)广泛作用于机体免疫系统，对免疫反应有直接影响，因而，研究肝炎患者淋巴细胞内GR含量、分布变化与血清糖皮质激素水平有助于阐明患者皮质激素系统与免疫性损伤的关系，对免疫治疗有一定指导意义。
已有众多学者对不同疾病患者淋巴细胞内的GR含量以及糖皮质激素的治疗效应做了探索[3～5]，作者尚未见对甲型肝炎(甲肝)患者做相应研究的报道。
材料与方法
一、材料来源
, 百拇医药
正常对照血取自健康供血者，标本血系1987年3月至1990年6月间收住长海医院传染科的住院患者，明确诊断为急性甲肝(参照1984年全国肝炎会议修订的诊断标准)，取晨8点静脉血。其中正常组，男性17例，女性13例，年龄21～40岁之间；患者组男性21例，女性11例，年龄为17～48岁，平均年龄26.4岁。荧光素标记GR配体DF(FITC-Dexamethoson)系本室与第二军医大学药学系合作标记产品[6]，地塞米松购自上海第十二药厂。1640培养液为日本制药株式会社产品，糖皮质激素放免测定试剂盒购自上海生物制剂所，流式细胞仪为美国Coulter公司产品(EPICS-C)。
二、方法
(一) 血清分离测定 取各血样1ml，凝固后吸出血清用放射免疫分析法做GH测定，操作按说明书进行。
(二) 淋巴细胞悬液制备 取普通干燥试管列为二排，一排为竞争抑制管，分别标以C1 C2 C3…(Competetive)，另一排为测定管，标为D1 D2 D3…(Determination)管。用微量移液管取对照及待测抗凝血0.1ml分置上述C、D各管内，各管加红细胞溶解液4ml，震荡使血细胞充分悬浮，置5分钟并待红细胞完全溶解后以2 000×g离心3分钟，弃上清。沉淀细胞以含2%小牛血清的PBS液悬浮并洗涤一次，再以1640液4ml悬浮，置37℃温箱30分钟，离心沉淀细胞再以PBS调至0.5ml。
, 百拇医药
(三) 细胞悬液与荧光配体反应 于上述C管和D管内，加入2μ mol DF 10μl，各C管内再单独加入400倍于DF浓度的地塞米松。用1640液调至1ml，此时，管内DF浓度为1μmol。置试管于25℃温箱90分钟，间断摇动。温育毕，用4℃ PBS(含2%小牛血清)终止反应并洗涤3次，最后沉淀细胞以1640液将细胞调至1×106个/ml待测。
(四) 流式细胞仪检测 应用测定GR的专用程序，调整散射光参数划出淋巴细胞群，调节激光功率和相关参数，使对照标本的阳性细胞界定范围<5%，以同样条件测定各D管，标本的阳性细胞率以测定值减去平均对照值表示。
结 果
一、外周血淋巴细胞内GR的测定
见附表。
附表 GR阳性淋巴细胞和血清GH水平 分 组
, 百拇医药
例数
GR阳性细胞(%)
血清GH(μg/L，
±s)
正 常 人
30
14.20±6.88
142±83
甲肝患者
32
8.50±4.07*
210±76**
, 百拇医药
*患者与正常人的GR阳性细胞率比较t=3.02，P<0.01 **患者与正常人的血清皮质醇含量比较t=2.71，P<0.01
二、资料的统计学处理
对个体而言，淋巴细胞的阳性率是一项相对指标，但对群体而言，可把它看作计量资料。应用非配对资料t检验对上述两组数据进行统计学处理，t1=3.02(P<0.01),t2=2.71(P<0.01)。
外周血淋巴细胞内的GR测定已有报道，均为同位素标记配体测出的GR平均含量[7，8]。机体中的皮质醇含量波动很大，且受多种因素影响，因人、时间、状态不同而异。本研究统一以晨8点的血标本做血清总皮质醇测定，并排除了妊娠和情绪等其它因素。结果显示患者组的GH水平明显高于正常组。
, http://www.100md.com 三、GR表达与血清皮质醇含量相关性分析
比较上述检测结果，可见在甲肝患者，皮质醇水平升高与GR受体表达量的下降间呈明显的负相关趋势。GR是皮质醇激素的效应受体，机体中的皮质激素必须首先与其结合才能发挥作用，因而激素受体的表达是影响皮质激素生物效应的最基本的因素。已有众多报道揭示GR表达与细胞或机体生物效应间的相互关系[9]。
讨 论
糖皮质激素对机体免疫系统影响的研究由来已久，有实验表明，在糖皮质激素的作用下，淋巴细胞对抗原和植物分裂原的刺激反应明显减弱或出现无反应性，某些患者在接受激素治疗时早期即有淋巴细胞减少和血清免疫球蛋白降低。血清中的GH与细胞内的GR间存在互调关系[10，11]，即血浆皮质激素升高，可使细胞内的GR表达减少。急性肝炎患者血浆皮质醇升高可能是肝功能障碍引起GH转化及代谢异常、应激等多种因素的综合结果。
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细胞对糖皮质激素的反应性与GR含量有关[12]，因此，细胞内GR 减少会使细胞对皮质激素的反应性降低，表现在对免疫反应的影响上则是免疫抑制作用减弱，从而使患者处于免疫紊乱状态，促成了感染继发性免疫损伤。
鉴于GH在疾病的发生、发展过程中具有重要作用，血清GH测定和细胞内GR的研究颇多。以前的研究多应用放射同位素3H标记法，以细胞群为研究对象测定GR的表达情况，所测的GR位点从3326±1387到6617±979个/细胞不等[8，11]。放射配体研究有其测定精确的特点，但无法了解具体单个细胞的GR表达情况，难以将细胞的GR表达与生物效应直接联系起来。本试验所做GR的荧光标记配体测定是以单个细胞为基础，观察GR的表达状况，GR含量的多少在测定中表现为荧光强度差异(Channal)，这对于进一步的细胞功能研究有重要意义。配合细胞的分选功能(Sorting)，可对细胞的GR表达与免疫效应间的关系进行更细致地探讨。
, 百拇医药
此外，糖皮质激素用于肝炎治疗一直是临床上关注的问题。以上研究提示，肝炎患者淋巴细胞内的GR含量不同，可导致对糖皮质激素的反应不同，从而直接影响到用药效果。如果对反应不佳的患者应用大剂量激素则可能会突出副效应，显然是弊大于利。综上所述，有关GR与免疫关系的深入研究，对认识肝病发病机制，对某些疾病的临床诊断和治疗都有较大的实用价值。
参考文献
1 Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rev Immunol, 1995,13:29-60.
2 Lemon SM. Type A viral hepatitis: New developments in an old disease. N Engl J Med, 1985,313:1059-1067.
, http://www.100md.com
3 Murakami T, Inakuma S, Ohsawa N, et al. Effect of PHA on concentration of glucocorticoid receptors in lymphocytes from patients with connective tissue diseases. Chin Chem, 1986, 32: 621-623.
4 Saldiva PHN, Brentani MM, Carvalho CRR, et al. Changes in the pulmonary glucocorticoid receptors in the course of interstetial disease. Chest, 1985, 88:417-419.
5 Traynor A. Recent advances in hormonal therapy for cancer. Curr Opin Oncol, 1995, 7:572-581.
, 百拇医药
6 韩焕兴，孔宪涛，张国治，等.流式细胞仪用于荧光素标记糖皮质激素受体的淋巴细胞研究.免疫学杂志，1990，6：265-267.
7 Steiner AE, Wittliff JL. Concentration of glucocorticoid receptor sites in normal human lymphocytes. Chin Chem, 1986,32:80-83.
8 Martins VR, Birolli MIA, Duarte AJS, et al. Glucocorticoid receptor in subpopulations of human lymphocytes defined by monoclonal antibodies. Cellular Immunol, 1987,105:443-446.
9 Jusko WJ. Pharmacokinetics and receptor-mediated pharmacodynamics of corticosteroids. Toxicology, 1995, 102:189-196.
, 百拇医药
10 Shimojo M, Hiroi N, Yakushiji F, et al. Differences in down-regulation of glucocorticoid receptor mRNA by cortisol, prednisolone and dexamethasone in HeLa cells. J Endor, 1995, 42:629-636.
11 Vachier I, Roux S, Chane P, et al. Glucocorticoids induced down-regulation of glucocorticoid receptor mRNA expression in asthma, Clin Exp Immunol, 1996,103:311-315.
12 Barnes PJ. Molecular mechanisms of steroid action in asthma. J Allergy Clin Immunol, 1996, 97:159-168., 百拇医药
单位：200003 上海，第二军医大学长征医院(韩焕兴、孔宪涛、张国治、李石)；第二军医大学药学系(周廷森)
关键词：受体，糖皮质激素；流式细胞术；肝炎，甲型
中华传染病杂志980110 【摘要】 目的 探索甲型病毒性肝炎患者外周血淋巴细胞糖皮质激素受体(GR)的表达与血清中皮质醇激素浓度的相互关系。方法 分别对部分正常人和32例急性甲型肝炎患者淋巴细胞内GR表达状况进行了流式细胞仪测定，同时应用放射免疫分析法测定其血清皮质醇含量。结果 甲型肝炎患者在急性期其血清皮质醇含量显著高于正常对照组，分别为210±76μg/L，142±83μg/L(患者组与正常人组比较P<0.01)；患者淋巴细胞内的GR含量则较正常人群明显降低。以本研究的实测值为标准，正常人GR阳性淋巴细胞为14.2%±6.88%，而患者组降低至8.5%±4.07%，GR表达与血清皮质醇含量间呈明显的负相关。结论 血清皮质醇水平与GR受体间存在对应关系并可能与患者的免疫状态与病情密切相关。
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A study on glucocorticoid receptor expression in PBL lymphocyte and its relation with serum glucocorticosteroid contents in type A hepatitis patients Han Huanxing, Kong Xiantao, Zhang Guozhi, et al. Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective In order to study the glucocorticoid receptor (GR) expression in lymphocyte and its relation with serum glucocorticosteroids contents in acute hepatitis A patients. Methods GR expression in lymphocyte was measured with flowcytometer and serum glucocorticosteroids contents were determined with RIA respectively in 32 acute type A hepatitis patients and 30 health persons. Results Lymphocyte GR expressions in patients in acute stage of the disease are obviously lower than that of control group and the proportion of GR positive lymphocytes decreased from 14.2%±6.88% to 8.5%±4.07%, whereas the serum glucocorticosteroids levels are markedly higher in patients than that of health group (210±76μg/L∶142±83μg/L).Conclusion There is a negative correlation between the two parameters and the abnormal serum glucocorticosteroids contents and GR expression in patients may be related to the course of the disease.
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【Key words】 Receptors glucocorticoid Flow cytometry Hepatitis A
病毒性肝炎是嗜肝病毒侵入肝细胞复制、增殖，引发一系列免疫损伤的传染性疾病。在某种程度上，病原所致的损伤主要是自身免疫性损伤[1，2]。糖皮质激素(GH)广泛作用于机体免疫系统，对免疫反应有直接影响，因而，研究肝炎患者淋巴细胞内GR含量、分布变化与血清糖皮质激素水平有助于阐明患者皮质激素系统与免疫性损伤的关系，对免疫治疗有一定指导意义。
已有众多学者对不同疾病患者淋巴细胞内的GR含量以及糖皮质激素的治疗效应做了探索[3～5]，作者尚未见对甲型肝炎(甲肝)患者做相应研究的报道。
材料与方法
一、材料来源
, 百拇医药
正常对照血取自健康供血者，标本血系1987年3月至1990年6月间收住长海医院传染科的住院患者，明确诊断为急性甲肝(参照1984年全国肝炎会议修订的诊断标准)，取晨8点静脉血。其中正常组，男性17例，女性13例，年龄21～40岁之间；患者组男性21例，女性11例，年龄为17～48岁，平均年龄26.4岁。荧光素标记GR配体DF(FITC-Dexamethoson)系本室与第二军医大学药学系合作标记产品[6]，地塞米松购自上海第十二药厂。1640培养液为日本制药株式会社产品，糖皮质激素放免测定试剂盒购自上海生物制剂所，流式细胞仪为美国Coulter公司产品(EPICS-C)。
二、方法
(一) 血清分离测定 取各血样1ml，凝固后吸出血清用放射免疫分析法做GH测定，操作按说明书进行。
(二) 淋巴细胞悬液制备 取普通干燥试管列为二排，一排为竞争抑制管，分别标以C1 C2 C3…(Competetive)，另一排为测定管，标为D1 D2 D3…(Determination)管。用微量移液管取对照及待测抗凝血0.1ml分置上述C、D各管内，各管加红细胞溶解液4ml，震荡使血细胞充分悬浮，置5分钟并待红细胞完全溶解后以2 000×g离心3分钟，弃上清。沉淀细胞以含2%小牛血清的PBS液悬浮并洗涤一次，再以1640液4ml悬浮，置37℃温箱30分钟，离心沉淀细胞再以PBS调至0.5ml。
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(三) 细胞悬液与荧光配体反应 于上述C管和D管内，加入2μ mol DF 10μl，各C管内再单独加入400倍于DF浓度的地塞米松。用1640液调至1ml，此时，管内DF浓度为1μmol。置试管于25℃温箱90分钟，间断摇动。温育毕，用4℃ PBS(含2%小牛血清)终止反应并洗涤3次，最后沉淀细胞以1640液将细胞调至1×106个/ml待测。
(四) 流式细胞仪检测 应用测定GR的专用程序，调整散射光参数划出淋巴细胞群，调节激光功率和相关参数，使对照标本的阳性细胞界定范围<5%，以同样条件测定各D管，标本的阳性细胞率以测定值减去平均对照值表示。
结 果
一、外周血淋巴细胞内GR的测定
见附表。
附表 GR阳性淋巴细胞和血清GH水平 分 组
, 百拇医药
例数
GR阳性细胞(%)
血清GH(μg/L，
±s)正 常 人
30
14.20±6.88
142±83
甲肝患者
32
8.50±4.07*
210±76**
, 百拇医药
*患者与正常人的GR阳性细胞率比较t=3.02，P<0.01 **患者与正常人的血清皮质醇含量比较t=2.71，P<0.01
二、资料的统计学处理
对个体而言，淋巴细胞的阳性率是一项相对指标，但对群体而言，可把它看作计量资料。应用非配对资料t检验对上述两组数据进行统计学处理，t1=3.02(P<0.01),t2=2.71(P<0.01)。
外周血淋巴细胞内的GR测定已有报道，均为同位素标记配体测出的GR平均含量[7，8]。机体中的皮质醇含量波动很大，且受多种因素影响，因人、时间、状态不同而异。本研究统一以晨8点的血标本做血清总皮质醇测定，并排除了妊娠和情绪等其它因素。结果显示患者组的GH水平明显高于正常组。
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比较上述检测结果，可见在甲肝患者，皮质醇水平升高与GR受体表达量的下降间呈明显的负相关趋势。GR是皮质醇激素的效应受体，机体中的皮质激素必须首先与其结合才能发挥作用，因而激素受体的表达是影响皮质激素生物效应的最基本的因素。已有众多报道揭示GR表达与细胞或机体生物效应间的相互关系[9]。
讨 论
糖皮质激素对机体免疫系统影响的研究由来已久，有实验表明，在糖皮质激素的作用下，淋巴细胞对抗原和植物分裂原的刺激反应明显减弱或出现无反应性，某些患者在接受激素治疗时早期即有淋巴细胞减少和血清免疫球蛋白降低。血清中的GH与细胞内的GR间存在互调关系[10，11]，即血浆皮质激素升高，可使细胞内的GR表达减少。急性肝炎患者血浆皮质醇升高可能是肝功能障碍引起GH转化及代谢异常、应激等多种因素的综合结果。
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细胞对糖皮质激素的反应性与GR含量有关[12]，因此，细胞内GR 减少会使细胞对皮质激素的反应性降低，表现在对免疫反应的影响上则是免疫抑制作用减弱，从而使患者处于免疫紊乱状态，促成了感染继发性免疫损伤。
鉴于GH在疾病的发生、发展过程中具有重要作用，血清GH测定和细胞内GR的研究颇多。以前的研究多应用放射同位素3H标记法，以细胞群为研究对象测定GR的表达情况，所测的GR位点从3326±1387到6617±979个/细胞不等[8，11]。放射配体研究有其测定精确的特点，但无法了解具体单个细胞的GR表达情况，难以将细胞的GR表达与生物效应直接联系起来。本试验所做GR的荧光标记配体测定是以单个细胞为基础，观察GR的表达状况，GR含量的多少在测定中表现为荧光强度差异(Channal)，这对于进一步的细胞功能研究有重要意义。配合细胞的分选功能(Sorting)，可对细胞的GR表达与免疫效应间的关系进行更细致地探讨。
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此外，糖皮质激素用于肝炎治疗一直是临床上关注的问题。以上研究提示，肝炎患者淋巴细胞内的GR含量不同，可导致对糖皮质激素的反应不同，从而直接影响到用药效果。如果对反应不佳的患者应用大剂量激素则可能会突出副效应，显然是弊大于利。综上所述，有关GR与免疫关系的深入研究，对认识肝病发病机制，对某些疾病的临床诊断和治疗都有较大的实用价值。
参考文献
1 Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rev Immunol, 1995,13:29-60.
2 Lemon SM. Type A viral hepatitis: New developments in an old disease. N Engl J Med, 1985,313:1059-1067.
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3 Murakami T, Inakuma S, Ohsawa N, et al. Effect of PHA on concentration of glucocorticoid receptors in lymphocytes from patients with connective tissue diseases. Chin Chem, 1986, 32: 621-623.
4 Saldiva PHN, Brentani MM, Carvalho CRR, et al. Changes in the pulmonary glucocorticoid receptors in the course of interstetial disease. Chest, 1985, 88:417-419.
5 Traynor A. Recent advances in hormonal therapy for cancer. Curr Opin Oncol, 1995, 7:572-581.
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6 韩焕兴，孔宪涛，张国治，等.流式细胞仪用于荧光素标记糖皮质激素受体的淋巴细胞研究.免疫学杂志，1990，6：265-267.
7 Steiner AE, Wittliff JL. Concentration of glucocorticoid receptor sites in normal human lymphocytes. Chin Chem, 1986,32:80-83.
8 Martins VR, Birolli MIA, Duarte AJS, et al. Glucocorticoid receptor in subpopulations of human lymphocytes defined by monoclonal antibodies. Cellular Immunol, 1987,105:443-446.
9 Jusko WJ. Pharmacokinetics and receptor-mediated pharmacodynamics of corticosteroids. Toxicology, 1995, 102:189-196.
, 百拇医药
10 Shimojo M, Hiroi N, Yakushiji F, et al. Differences in down-regulation of glucocorticoid receptor mRNA by cortisol, prednisolone and dexamethasone in HeLa cells. J Endor, 1995, 42:629-636.
11 Vachier I, Roux S, Chane P, et al. Glucocorticoids induced down-regulation of glucocorticoid receptor mRNA expression in asthma, Clin Exp Immunol, 1996,103:311-315.
12 Barnes PJ. Molecular mechanisms of steroid action in asthma. J Allergy Clin Immunol, 1996, 97:159-168., 百拇医药