肝素对糖尿病大鼠肾小球形态学的影响
作者：张雪涛 邹大进
单位：
关键词：糖尿病肾病；肾小球膜；类硫酸肝素盐；胶原
摘要 目的摘要 目的：观察外源性肝素对糖尿病(DM)大鼠肾脏结构的影响。方法：应用SD大鼠DM模型，皮下注射不同剂量的肝素。大鼠随机分成DM组，小剂量(100 U/kg)肝素治疗组(LH)、中剂量(400 U/kg)肝素治疗组(MH)和大剂量(800 U/kg)肝素治疗组(HH)；另设正常对照组(C)，皮下注射生理盐水。给药8周后处死大鼠，测定体质量、肾质量/体质量(R/B)、凝血酶原时间(PT),并观察肾小球形态学改变。结果：DM组较C组体质量明显减轻(P<0.05)，R/B明显升高(P<0.01)，经肝素治疗后上述指标无明显变化；PT在MH和HH组明显延长(P<0.05)，LH，DM组与C组无明显差别；肾小球形态学检查DM组肾小球基底膜(GBM)明显增厚，系膜区扩大，Ⅳ型胶原含量增加，而各肝素治疗组均有明显改善(P<0.01)。结论：外源性肝素能减轻DM大鼠肾脏的形态学异常改变，提示肝素具有防止DM肾病发生、发展的作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 587.2
Effects of heparin on renal morphological alterations in diabetic rats
Zhang Xuetao，Zou Dajin(Department of Endocrinology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective：To evaluate the effects of exogenous heparin on renal structure in diabetic rats. Methods: SD rats were respectively injected subcutaneously (sc) heparin in different doses and divided into DM group, low dose (100 U/kg)heparin treated group(LH),middle dose(400 U/kg)heparin treated group(MH) and high dose(800 U/kg)heparin treated group(HH).And another control group(C) were injected sc normal saline solution. Rats were killed after 8 weeks of treatment , their body mass, ratio of renal mass and body mass and prothrombin time(PT) were measured and renal morphological alterations were observed. Results: In DM group, body mass reduced significantly (P<0.05)and ratio of renal mass and body mass increased significantly compared with C group, but there was no significant change before and after heparin treatment. PT increased significantly in MH and HH groups(P<0.05), and there was no significant difference between LH, DM and C groups. Glomerular morphological results showed that in DM group there was significant GBM thickening(P<0.01), mesangial expansion and type Ⅳ collagen increase compared with 3 doses of heparin treatment. Conclusion: Exogenous heparin can ameliorate morphological renal abnormality in diabetic rats, suggesting that heparin can prevent the occurrence and progression of diabetic nephropathy.
, 百拇医药
Key words diabetic nephropathies; glomerular membrane; heparitin sulfate; collagen
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)患者的主要慢性并发症之一，其病理特点是肾小球基底膜(GBM)增厚和以系膜区为主的细胞外基质(ECM)增生，最终导致弥漫性或节段性肾小球硬化[1]。目前DN发生机制尚不完全清楚，但肾脏结构的改变，包括ECM的改变是肾功能损害的基础。近来肝素在DN发生、发展中所起的作用越来越受到研究人员的重视，国外已有研究表明，肝素的电负性及其抗生长作用对DN的发生、发展有重要影响[2]。为此，本实验通过观察肝素对DM大鼠肾小球结构的影响，初步探讨其作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物 6～7周龄雄性SD大鼠30只(第二军医大学动物实验中心提供)，体质量200～250 g，自由进食与饮水，随机分为正常对照组(C，6只)和DM模型组(24只)。DM模型组经尾静脉注射四氧嘧啶40 mg/kg，C组则注射生理盐水1 ml。2 d后测血糖，空腹血糖>13.8 mmol/L者选入实验。所有大鼠常规饲料喂养，不限制饮水，不使用胰岛素。
, 百拇医药
1.2 分组及给药 DM大鼠在血糖升高1周后随机分为4组：DM对照组(DM)和大剂量肝素(HH)、中剂量肝素(MH)、小剂量肝素(LH)治疗组。肝素用生理盐水配制成250，125和31.25 U/ml浓度，各治疗组分别按800， 400和100 U/kg皮下注射； C组和DM组皮下注射生理盐水1 ml， 1次/d， 共8周。
1.3 观测指标
1.3.1 肾质量、体质量 实验开始前及开始后每周测体质量1次，用药第8周末断头处死大鼠，取出一侧肾脏，去掉肾包膜，秤其湿质量。
1.3.2 血糖 采用One TouchⅡ血糖仪测血糖。
1.3.3 凝血酶原时间(PT) 最后1次用药后24～30 h，断头取血2 ml，ACL-200型凝血仪测定PT。
, 百拇医药 1.3.4 形态学观察 断头处死大鼠，迅速取一侧肾脏，去掉肾包膜，取1 mm×1 mm×1 mm肾皮质数块，磷酸缓冲液冲洗，4%多聚甲醛-1.5%戊二醛溶液固定，电镜检查，摄片测GBM的厚度。方法如下：选5个肾小球，取长而直的肾小球基底膜，用精密至0.02 mm的游标尺测量垂直于内皮细胞窗连线至GBM上皮细胞足突间隙或相当于该部位的最短垂直距离，根据放大倍数换算成平均实际GBM厚度。取另一侧肾脏，称质量后用10%中性甲醛溶液浸泡固定。常规石蜡包埋，制备厚度为3 μm切片，HE、糖原染色(PAS)和嗜银染色。应用免疫组织化学LSAB法观测肾小球Ⅳ型胶原的增生情况。
1.4 统计学处理 所有定量指标均以
±s表示，采用未配对资料t检验、方差分析。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 体质量、肾质量及其比率 8周后C组体质量较DM组明显增加(P<0.05)。DM组与各治疗组之间相差不显著(表1)。各组大鼠的肾质量无明显差别。DM组及3个治疗组R/B均明显高于C组(P<0.01)，但前4个组之间无明显差别(表2)。
表1 治疗前后各组体质量的变化
Tab 1 Change of body mass before and after treatment(n=6,±s,m/g)
Group
0 week
8 week
, 百拇医药
Control
230.2±10.0
347.8±25.4
DM
230.3±26.5
281.3±50.1*
LH
230.5±33.9
298.3±46.1*
MH
241.3±31.5
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302.2±60.7*
HH
219.2±13.6
292.5±46.3*
*P<0.05 vs control group
表2 治疗后PT、肾质量及R/B，GBM厚度的变化
Tab 2 PT, kidney mass, kidney mass/body mass ratio and thickness of GBM after treatment(n=6,±s)
, http://www.100md.com
Group
PT(t/s)
Kidney mass(m/g)
R/B(×10-3)
Thickness of GBM (l/nm)
Control
14.65± 2.12
1.124±0.049
3.23±0.21
293.33±19.06□□
DM
, 百拇医药
15.14± 1.08
1.201±0.147
4.27±0.27△△
670.13±74.00
LH
14.23± 0.76
1.151±0.124
3.86±0.25△△
301.86±27.25□□
MH
48.40± 4.27*
, http://www.100md.com
1.132±0.082
3.81±0.19△△
307.46±19.72□□
HH
53.25±22.63*
1.147±0.079
3.92±0.24△△
298.93±24.75□□
*P<0.05 vs C，DM and LH groups; △△P<0.01 vs C group; □□P<0.01 vs DM group2.2 PT MH组和HH组的PT较C，DM及LH组的明显延长(P<0.05)，DM，LH与C组之间，MH与HH组之间PT无明显差异。实验过程中HH组第2周起出现5只次，MH组第5周起出现3只次注射部位皮下瘀斑，直径为1.5～3.0 cm，改变注射部位后1周左右瘀斑消失，未发现血尿、黑便；C，DM和LH组未发现凝血异常表现(表2)。
, 百拇医药
2.3 肾脏形态学检查 (1)光镜下DM组肾小球体积增大，部分肾小球系膜区PAS阳性物质较C组增多，肾小球嗜银染色增深，肾小管无明显改变。各治疗组上述病变明显减轻，各治疗组间未见明显差异。(2)免疫组织化学检查发现，DM组GBM及系膜区Ⅳ型胶原染色较C组明显增强，各肝素治疗组均有明显改善，组间未见明显差异(图1)。(3)电镜检查DM组GBM弥漫性增厚，上皮细胞足突部分融合，与C组及各肝素治疗组均有显著差异(P<0.01)(图2)，各治疗组与C组之间无明显差异(表2)。系膜基质未见明显变化。
图1 肾小球Ⅳ型胶原免疫组织化学染色(×160)
Fig 1 Immunohistochemical stain of collagen
, 百拇医药
Ⅳ in glomerulus (×160)
A：DM； B：DM+LH
图2 电镜下GBM厚度(×18 000)
Fig 2 Electron micrograghs of thickness of
glomerular basement membrane(×18 000)
A：DM； B：DM+LH
3 讨 论
, 百拇医药
在肾脏中肝素以硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的形式存在，是肾脏蛋白多糖的主要成分[1，3]。研究表明DM可引起ECM成分中其他蛋白质成分的合成增加，但HSPG的合成却相对或绝对减少，或硫酸化程度降低[3]，提示肝素含量及分子结构正常对维持DM肾脏结构和功能的正常具有非常重要的意义。本实验中未用胰岛素及其他降血糖药物，各治疗组在肝素治疗前后血糖无明显变化，表明皮下注射肝素不能改善DM高糖血症，但能有效地防止DM大鼠的GBM增厚，提示实验中肾脏形态学异常的改善依赖于肝素的作用。
本实验选择了3个肝素治疗剂量，给大鼠皮下注射100 U/(kg*d)的肝素，此剂量明显低于人常规抗凝剂量[4]，未观察到PT延长和皮下出血，3个治疗组对肾脏形态学异常的作用亦无明显差别，提示肝素的肾脏保护作用不依赖于其抗凝作用。有报道肝素能抑制包括系膜细胞在内的多种细胞及其他ECM成分的增生，其机制可能是作用于细胞有丝分裂的多个时期[5]，或通过调节生长因子(成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子和转化生长因子β等)的活性[6]而达到的。另外已证实，许多ECM成分，如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和Ⅳ型胶原上均有硫酸肝素(HS)受体，能与HS特异结合，并受到HSPG变化的影响[7]。DM时HSPG的减少可导致胶原和其他GBM或系膜基质成分的代偿性升高。体外实验证实，外源性肝素能促进内源性HSPG的合成及其硫酸化，减轻DM引起的HSPG数量和结构上的异常[7]。本实验在肾脏形态学研究中观察到外源性肝素能明显改善DM大鼠的GBM增厚，抑制GBM和系膜区Ⅳ型胶原增生，防止系膜区的扩张，提示肝素通过抗细胞增生和其他ECM成分的增生，能延缓肾小球硬化的发生和发展。对防止DM大鼠DN的发生和发展有一定意义，并且此作用可能与其电负性和抗增生作用有关；同时也支持了氨基葡聚糖的代谢异常是DN发生机制之一的假说。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 邹大进，周炳胜. 预防糖尿病慢性并发症的理论与实践. 上海预防医学，1994，6(11)：1
2 张雪涛，邹大进. 肝素与糖尿病肾病.上海医院药学，1997，8(2)：20
3 Goode NP, Shires M, Crellin DM, et al. Alteration of glomerular basement membrane charge and structure in diabetic nephropathy. Diabetologia, 1995, 38(12):1455
4 Myrup B, Hansen PM, Jensen T, et al. Effect of low dose heparin on urinary albumin excretion in insulin-dependent diabetes mellitus. Lancet, 1995,345(8947):421
, 百拇医药
5 Yokoyama H, Myrup B, Oturai P, et al. Heparin, a possible therapy for diabetic complications: the effect on mesangial and myomedial cells in vivo and in vitro, especially in relation to extracellular matrix. J Diabetes Complications，1995,9(2):97
6 Oturai PS, Rasch R, Hasselager E, et al. Effects of heparin and aminoguanidine on glomerular basement membrane thickening in diabetic rats. APMIS,1996,104(4):259
7 Ziyadeh FN. The extracellular matrix in diabetic nephropathy. Am J Kidney Dis, 1993, 22(5): 736
(1997-08-12收稿，1997-12-30修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：糖尿病肾病；肾小球膜；类硫酸肝素盐；胶原
摘要 目的摘要 目的：观察外源性肝素对糖尿病(DM)大鼠肾脏结构的影响。方法：应用SD大鼠DM模型，皮下注射不同剂量的肝素。大鼠随机分成DM组，小剂量(100 U/kg)肝素治疗组(LH)、中剂量(400 U/kg)肝素治疗组(MH)和大剂量(800 U/kg)肝素治疗组(HH)；另设正常对照组(C)，皮下注射生理盐水。给药8周后处死大鼠，测定体质量、肾质量/体质量(R/B)、凝血酶原时间(PT),并观察肾小球形态学改变。结果：DM组较C组体质量明显减轻(P<0.05)，R/B明显升高(P<0.01)，经肝素治疗后上述指标无明显变化；PT在MH和HH组明显延长(P<0.05)，LH，DM组与C组无明显差别；肾小球形态学检查DM组肾小球基底膜(GBM)明显增厚，系膜区扩大，Ⅳ型胶原含量增加，而各肝素治疗组均有明显改善(P<0.01)。结论：外源性肝素能减轻DM大鼠肾脏的形态学异常改变，提示肝素具有防止DM肾病发生、发展的作用。
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中国图书资料分类法分类号 R 587.2
Effects of heparin on renal morphological alterations in diabetic rats
Zhang Xuetao，Zou Dajin(Department of Endocrinology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective：To evaluate the effects of exogenous heparin on renal structure in diabetic rats. Methods: SD rats were respectively injected subcutaneously (sc) heparin in different doses and divided into DM group, low dose (100 U/kg)heparin treated group(LH),middle dose(400 U/kg)heparin treated group(MH) and high dose(800 U/kg)heparin treated group(HH).And another control group(C) were injected sc normal saline solution. Rats were killed after 8 weeks of treatment , their body mass, ratio of renal mass and body mass and prothrombin time(PT) were measured and renal morphological alterations were observed. Results: In DM group, body mass reduced significantly (P<0.05)and ratio of renal mass and body mass increased significantly compared with C group, but there was no significant change before and after heparin treatment. PT increased significantly in MH and HH groups(P<0.05), and there was no significant difference between LH, DM and C groups. Glomerular morphological results showed that in DM group there was significant GBM thickening(P<0.01), mesangial expansion and type Ⅳ collagen increase compared with 3 doses of heparin treatment. Conclusion: Exogenous heparin can ameliorate morphological renal abnormality in diabetic rats, suggesting that heparin can prevent the occurrence and progression of diabetic nephropathy.
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Key words diabetic nephropathies; glomerular membrane; heparitin sulfate; collagen
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)患者的主要慢性并发症之一，其病理特点是肾小球基底膜(GBM)增厚和以系膜区为主的细胞外基质(ECM)增生，最终导致弥漫性或节段性肾小球硬化[1]。目前DN发生机制尚不完全清楚，但肾脏结构的改变，包括ECM的改变是肾功能损害的基础。近来肝素在DN发生、发展中所起的作用越来越受到研究人员的重视，国外已有研究表明，肝素的电负性及其抗生长作用对DN的发生、发展有重要影响[2]。为此，本实验通过观察肝素对DM大鼠肾小球结构的影响，初步探讨其作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物 6～7周龄雄性SD大鼠30只(第二军医大学动物实验中心提供)，体质量200～250 g，自由进食与饮水，随机分为正常对照组(C，6只)和DM模型组(24只)。DM模型组经尾静脉注射四氧嘧啶40 mg/kg，C组则注射生理盐水1 ml。2 d后测血糖，空腹血糖>13.8 mmol/L者选入实验。所有大鼠常规饲料喂养，不限制饮水，不使用胰岛素。
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1.2 分组及给药 DM大鼠在血糖升高1周后随机分为4组：DM对照组(DM)和大剂量肝素(HH)、中剂量肝素(MH)、小剂量肝素(LH)治疗组。肝素用生理盐水配制成250，125和31.25 U/ml浓度，各治疗组分别按800， 400和100 U/kg皮下注射； C组和DM组皮下注射生理盐水1 ml， 1次/d， 共8周。
1.3 观测指标
1.3.1 肾质量、体质量 实验开始前及开始后每周测体质量1次，用药第8周末断头处死大鼠，取出一侧肾脏，去掉肾包膜，秤其湿质量。
1.3.2 血糖 采用One TouchⅡ血糖仪测血糖。
1.3.3 凝血酶原时间(PT) 最后1次用药后24～30 h，断头取血2 ml，ACL-200型凝血仪测定PT。
, 百拇医药 1.3.4 形态学观察 断头处死大鼠，迅速取一侧肾脏，去掉肾包膜，取1 mm×1 mm×1 mm肾皮质数块，磷酸缓冲液冲洗，4%多聚甲醛-1.5%戊二醛溶液固定，电镜检查，摄片测GBM的厚度。方法如下：选5个肾小球，取长而直的肾小球基底膜，用精密至0.02 mm的游标尺测量垂直于内皮细胞窗连线至GBM上皮细胞足突间隙或相当于该部位的最短垂直距离，根据放大倍数换算成平均实际GBM厚度。取另一侧肾脏，称质量后用10%中性甲醛溶液浸泡固定。常规石蜡包埋，制备厚度为3 μm切片，HE、糖原染色(PAS)和嗜银染色。应用免疫组织化学LSAB法观测肾小球Ⅳ型胶原的增生情况。
1.4 统计学处理 所有定量指标均以
±s表示，采用未配对资料t检验、方差分析。2 结 果
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2.1 体质量、肾质量及其比率 8周后C组体质量较DM组明显增加(P<0.05)。DM组与各治疗组之间相差不显著(表1)。各组大鼠的肾质量无明显差别。DM组及3个治疗组R/B均明显高于C组(P<0.01)，但前4个组之间无明显差别(表2)。
表1 治疗前后各组体质量的变化
Tab 1 Change of body mass before and after treatment(n=6,
±s,m/g)Group
0 week
8 week
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Control
230.2±10.0
347.8±25.4
DM
230.3±26.5
281.3±50.1*
LH
230.5±33.9
298.3±46.1*
MH
241.3±31.5
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302.2±60.7*
HH
219.2±13.6
292.5±46.3*
*P<0.05 vs control group
表2 治疗后PT、肾质量及R/B，GBM厚度的变化
Tab 2 PT, kidney mass, kidney mass/body mass ratio and thickness of GBM after treatment(n=6,
±s), http://www.100md.com
Group
PT(t/s)
Kidney mass(m/g)
R/B(×10-3)
Thickness of GBM (l/nm)
Control
14.65± 2.12
1.124±0.049
3.23±0.21
293.33±19.06□□
DM
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15.14± 1.08
1.201±0.147
4.27±0.27△△
670.13±74.00
LH
14.23± 0.76
1.151±0.124
3.86±0.25△△
301.86±27.25□□
MH
48.40± 4.27*
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1.132±0.082
3.81±0.19△△
307.46±19.72□□
HH
53.25±22.63*
1.147±0.079
3.92±0.24△△
298.93±24.75□□
*P<0.05 vs C，DM and LH groups; △△P<0.01 vs C group; □□P<0.01 vs DM group2.2 PT MH组和HH组的PT较C，DM及LH组的明显延长(P<0.05)，DM，LH与C组之间，MH与HH组之间PT无明显差异。实验过程中HH组第2周起出现5只次，MH组第5周起出现3只次注射部位皮下瘀斑，直径为1.5～3.0 cm，改变注射部位后1周左右瘀斑消失，未发现血尿、黑便；C，DM和LH组未发现凝血异常表现(表2)。
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2.3 肾脏形态学检查 (1)光镜下DM组肾小球体积增大，部分肾小球系膜区PAS阳性物质较C组增多，肾小球嗜银染色增深，肾小管无明显改变。各治疗组上述病变明显减轻，各治疗组间未见明显差异。(2)免疫组织化学检查发现，DM组GBM及系膜区Ⅳ型胶原染色较C组明显增强，各肝素治疗组均有明显改善，组间未见明显差异(图1)。(3)电镜检查DM组GBM弥漫性增厚，上皮细胞足突部分融合，与C组及各肝素治疗组均有显著差异(P<0.01)(图2)，各治疗组与C组之间无明显差异(表2)。系膜基质未见明显变化。
图1 肾小球Ⅳ型胶原免疫组织化学染色(×160)
Fig 1 Immunohistochemical stain of collagen
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Ⅳ in glomerulus (×160)
A：DM； B：DM+LH
图2 电镜下GBM厚度(×18 000)
Fig 2 Electron micrograghs of thickness of
glomerular basement membrane(×18 000)
A：DM； B：DM+LH
3 讨 论
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在肾脏中肝素以硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的形式存在，是肾脏蛋白多糖的主要成分[1，3]。研究表明DM可引起ECM成分中其他蛋白质成分的合成增加，但HSPG的合成却相对或绝对减少，或硫酸化程度降低[3]，提示肝素含量及分子结构正常对维持DM肾脏结构和功能的正常具有非常重要的意义。本实验中未用胰岛素及其他降血糖药物，各治疗组在肝素治疗前后血糖无明显变化，表明皮下注射肝素不能改善DM高糖血症，但能有效地防止DM大鼠的GBM增厚，提示实验中肾脏形态学异常的改善依赖于肝素的作用。
本实验选择了3个肝素治疗剂量，给大鼠皮下注射100 U/(kg*d)的肝素，此剂量明显低于人常规抗凝剂量[4]，未观察到PT延长和皮下出血，3个治疗组对肾脏形态学异常的作用亦无明显差别，提示肝素的肾脏保护作用不依赖于其抗凝作用。有报道肝素能抑制包括系膜细胞在内的多种细胞及其他ECM成分的增生，其机制可能是作用于细胞有丝分裂的多个时期[5]，或通过调节生长因子(成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子和转化生长因子β等)的活性[6]而达到的。另外已证实，许多ECM成分，如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和Ⅳ型胶原上均有硫酸肝素(HS)受体，能与HS特异结合，并受到HSPG变化的影响[7]。DM时HSPG的减少可导致胶原和其他GBM或系膜基质成分的代偿性升高。体外实验证实，外源性肝素能促进内源性HSPG的合成及其硫酸化，减轻DM引起的HSPG数量和结构上的异常[7]。本实验在肾脏形态学研究中观察到外源性肝素能明显改善DM大鼠的GBM增厚，抑制GBM和系膜区Ⅳ型胶原增生，防止系膜区的扩张，提示肝素通过抗细胞增生和其他ECM成分的增生，能延缓肾小球硬化的发生和发展。对防止DM大鼠DN的发生和发展有一定意义，并且此作用可能与其电负性和抗增生作用有关；同时也支持了氨基葡聚糖的代谢异常是DN发生机制之一的假说。
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参 考 文 献
1 邹大进，周炳胜. 预防糖尿病慢性并发症的理论与实践. 上海预防医学，1994，6(11)：1
2 张雪涛，邹大进. 肝素与糖尿病肾病.上海医院药学，1997，8(2)：20
3 Goode NP, Shires M, Crellin DM, et al. Alteration of glomerular basement membrane charge and structure in diabetic nephropathy. Diabetologia, 1995, 38(12):1455
4 Myrup B, Hansen PM, Jensen T, et al. Effect of low dose heparin on urinary albumin excretion in insulin-dependent diabetes mellitus. Lancet, 1995,345(8947):421
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5 Yokoyama H, Myrup B, Oturai P, et al. Heparin, a possible therapy for diabetic complications: the effect on mesangial and myomedial cells in vivo and in vitro, especially in relation to extracellular matrix. J Diabetes Complications，1995,9(2):97
6 Oturai PS, Rasch R, Hasselager E, et al. Effects of heparin and aminoguanidine on glomerular basement membrane thickening in diabetic rats. APMIS,1996,104(4):259
7 Ziyadeh FN. The extracellular matrix in diabetic nephropathy. Am J Kidney Dis, 1993, 22(5): 736
(1997-08-12收稿，1997-12-30修回), http://www.100md.com