欧芹素乙拮抗TNF促进牛脑微血管内皮细胞与单核细胞粘附作用
作者：储智勇 龚纯贵 芮耀诚
单位：
关键词：肿瘤坏死因子；内皮细胞；单核细胞；细胞粘连；欧芹素乙
第二军医大学学报980217
摘要 目的：研究肿瘤坏死因子(TNF)对体外培养的牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)与单核细胞(MNCs)粘附的影响及欧芹素乙(IMP)的拮抗作用。方法：通过测定MNCs中髓过氧化物酶活性的方法，对粘附于BCMEC单层上的MNCs进行定量。结果：TNF在5～250 U/ml时呈剂量依赖性地诱导BCMEC与MNCs的粘附，TNF浓度为100 U/ml时促粘附达最大值(61.0%)。TNF与内皮细胞共育1 h，即可明显促进粘附作用(55.7%)，2 h时达最大刺激效应(62.8%)。IMP在浓度为0.1～10.0 μmol/L时，呈剂量依赖性地拮抗TNF诱导的粘附作用，在10.0 μmol/L时抑制率达90.3%。结论：IMP具有抑制由TNF诱导的BCMEC与MNCs粘附的作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 543.5
Inhibitory effects of imperatorin on TNF induced adhesion reaction of BCMEC with monocytes
Chu Zhiyong, Gong Chungui, Rui Yaocheng (Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study inhibitory effect of imperatorin(IMP) on tumor necrosis factor (TNF) induced adhesion reaction of cultured bovine cerebromicrovascular endothelial cell (BCMEC) with monocytes in vitro.Methods:The assay was based on the measurement of the myeloperoxidase activity in monocytes that had adhered to BCMEC layers.Results:At concentrations from 5 to 250 U/ml,TNF was shown to induce adhesion reaction of cultured BCMEC with monocytes in a dose-dependent manner.The effect of TNF reached maximum (61.0%) at 100 U/ml.After 1 h incubation of BCMEC,addition of TNF significantly stimulated the adhesion reaction of BCMEC with monocytes(55.7%).After 2 h incubation the effect reached maximum(62.8%),then the effect slightly decreased.At concentrations from 0.1 to 10.0 μmol/L,IMP was found to antagonize induced adhesion reaction.Its maximal rate of inhibition was 90.3% at 10.0 μmol/L.Conclusion:IMP may decrease the TNF induced adhesion reaction of BCMEC with monocytes.
, 百拇医药
Key words tumor necrosis factor; endothelial cells; monocytes; cell adhesion; imperatorin
动脉内皮损伤、中膜平滑肌细胞移行至内膜并大量增殖，以及血小板和单核细胞与血管内皮细胞粘附及浸润在动脉粥样硬化形成早期起着关键性作用[1,2]。欧芹素乙(imperatorin,IMP)为中药欧前胡和白芷根部的有效成分，具有抗炎作用，还可抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集[3]及肿瘤坏死因子(TNF)诱导的牛脑微血管平滑肌细胞增殖[4]，但IMP对TNF诱导的牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)与单核细胞的粘附的影响尚未见报道。本研究用体外培养的BCMEC，观察TNF对内皮细胞与单核细胞粘附的影响及IMP的拮抗作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 IMP由本院植物化学教研室提供；TNF由日本Dainippon制药公司Sohmura博士赠送；MEM培养基为美国Gibco公司产品；胶原酶Ⅱ型为美国Sigma公司产品；溴化十六碳烷基三甲铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HTAB)为上海化学试剂站分装厂进口分装；邻-联茴香胺盐酸盐(o-dianisidine dihydrochloride,DD)为北京化工厂产品。
, 百拇医药
1.2 BCMEC 细胞培养按孙笃新等[5]方法进行。细胞长成致密单层后，倒置相差显微镜下可见细胞呈卵石样外观，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性，表明为脑血管内皮细胞。
1.3 牛血单核细胞的分离 新鲜小牛全血参照Bath等[6]建立的方法分离，得到混有一定量淋巴细胞的单核细胞，用Hanks液调整细胞数为5×106个/ml，备用。
1.4 测定TNF对内皮细胞与单核细胞粘附的影响 生长致密的3～5代BCMEC经消化制成细胞悬液，以1.5×104个/孔接种于96孔培养板，置37℃，5% CO2孵箱中孵育48 h，长成致密单层。加入不同剂量TNF(5,50,100及250 U/ml)，继续孵育不同时间(1,2,4及6 h)后取出。加入单核细胞悬液前，用预热的Hanks液小心冲洗内皮细胞4次，然后每孔加入单核细胞悬液100 μl(5×105个/孔)，置37℃，5% CO2孵箱中孵育30 min。小心吸出未结合的单核细胞，并用预热的含0.1% BSA的磷酸盐缓冲液轻轻荡洗，用Bath等[6]建立的测定髓过氧化物酶(MPO)活性的方法对结合的单核细胞进行定量测定。
, http://www.100md.com
1.5 MPO活性的测定 改良Bath等[6]测定MPO活性的方法。每孔加入1% HTAB溶液50 μl，置37℃，5% CO2孵箱中孵育45 min。取出，每孔加入预热至37℃的DD+H2O2反应液250 μl，置孵箱中孵育20 min，酶联仪测定450 nm处光密度。内皮细胞、淋巴细胞不含MPO，因此所测出的MPO活性将反映粘附的单核细胞。粘附细胞MPO活性用实测的MPO活性与每孔加入单核细胞MPO总活性的百分比来表示。
1.6 测定IMP对粘附作用的影响 在加入TNF刺激之前，加入不同浓度的IMP与内皮细胞单层共育一段时间，其他操作同上，测定MPO活性，计算药物抑制率。
抑制率(%)=(TNF粘附率-药物粘附率/TNF粘附率-基础粘附率)×100%
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1 TNF刺激内皮细胞与单核细胞粘附的时效曲线 研究结果显示，TNF 100 U/ml刺激1 h即可明显诱导内皮细胞与单核细胞粘附，粘附率为(55.7±2.5)%， 2 h的粘附率达高峰(62.8±1.4)%。4， 6 h的粘附率则分别为(61.5±3.5)%以及(61.1±4.0)%，与2 h相比略有下降，但差别不明显。为便于实验，选择4 h作为TNF刺激时间(表1)。
2.2 TNF刺激粘附的量效曲线 TNF刺激内皮细胞单层4 h后，加入单核细胞。结果表明，TNF浓度为0，5, 50, 100, 250 U/ml时，内皮细胞与单核
表1 TNF刺激粘附的时效曲线
Tab 1 Time-dependent effect of TNF induced mono-
cytes adhesion to endothelial cells in vitro(n=3,
±s) Time
, http://www.100md.com
(t/h)
TNF
(λB/U*ml-1)
Adherence rate
(%)
0
0
46.2±1.8
1
100
55.7±2.5**
2
, 百拇医药
100
62.8±1.4**
4
100
61.5±3.5**
6
100
61.1±4.0**
**P<0.01 vs 0 h
细胞的粘附率分别为(43.2±2.1)%,(52±3.7)%(P<0.05)， (58.2±2.5)% (P<0.01)，(61.0±2.1)%(P<0.001)，(59.0±2.0)%(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 IMP对TNF诱导内皮细胞与单核细胞粘附的影响 内皮细胞单层先与不同浓度的IMP共育4 h后，再用浓度为100 U/ml的TNF刺激4 h，加入单核细胞悬液，测定MPO活性。结果显示，IMP浓度为0.1～10.0 μmol/L时呈剂量依赖性地显著抑制TNF诱导的内皮细胞与单核细胞粘附，当IMP浓度为0.1, 1.0及10.0 μmol/L时，抑制率分别为30.9%,57.8%及90.3%(表2)。
表2 IMP对TNF诱导内皮细胞与单核细胞粘附的影响
Tab 2 Dose-dependent effect of IMP on TNF induced
monocytes adhesion to endothelial cells in vitro(n=3,±s) IMP
, 百拇医药
(CB/μmol*L-1)
TNF
(λB/U*ml-1)
Adherence
rate(%)
Inhibition
rate(%)
0
0
41.2±5.2
0
, 百拇医药
100
54.5±1.3**
0.1
100
50.4±2.2△
30.9
1.0
100
46.8±3.1△
57.8
10.0
100
, 百拇医药
42.5±4.6△△
90.3
**P<0.01 vs 0 U/ml TNF; △P<0.05,△△P<0.01 vs 100 U/ml TNF
3 讨 论
单核细胞与内皮细胞的粘附在动脉粥样硬化、脑卒中等形成过程中起重要作用。在喂养高胆固醇的动物模型上，几周内可观察到单核细胞粘附到血管内皮上，接着单核细胞浸润到血管内膜并摄取胆固醇，转化为富含脂质的巨噬细胞，形成脂质条纹，这是最早形成的动脉粥样硬化斑块[7]。Mori等[8]研究表明，白细胞粘附于血管内皮可导致脑缺血再灌流后无再流，造成脑组织坏死，用CD18单克隆抗体阻断白细胞粘附于管壁内皮，使微血管流通，可防止脑组织坏死，因此研究单核细胞与内皮细胞的粘附具有重要意义。测定单核细胞的方法有几种，如人工计数选择性染色的细胞、测定细胞的DNA含量等，但这些方法不能对粘附到内皮细胞上的单核细胞进行定量测定。Bath等[6]建立的测定单核细胞MPO活性的方法，能够测定粘附在内皮细胞单层上的单核细胞，而不受混杂淋巴细胞及内皮细胞单层的影响，重现性较好。
, 百拇医药
TNF是一类具有广泛生物活性的炎性介质，在免疫、肿瘤等疾病的病理过程中具有重要作用。近年来发现TNF可促进平滑肌细胞增殖[4]；同时也可直接损伤内皮细胞[9]，提示TNF在动脉粥样硬化及其他心血管疾病中起一定作用。本研究表明，TNF对培养的BCMEC与单核细胞的粘附具有明显促粘附作用，提示TNF在脑动脉粥样硬化、脑卒中等心脑血管疾病中可能有重要作用。因而，寻找拮抗TNF作用的药物，在心脑血管疾病的防治中有应用前景。
IMP是从植物中提取的有效成分，以往的研究表明，IMP能抑制TNF诱导的血管平滑肌细胞增殖，本研究又证实IMP可抑制TNF诱导的血管内皮细胞与单核细胞的粘附，进一步表明IMP可通过不同途径影响心脑血管疾病的致病因素，提示IMP在心脑血管疾病的防治中可能有重要意义。
参 考 文 献
1 Johan F ,Ruihua W,Anders H, et al. Mononuclear leukocytes exposed to oxidized low density lipoprotein secrete a factor that stimulates endothelial cells to express adhesion molecules. Atherosclerosis,1993,103(2):213
, http://www.100md.com
2 Uichi I, Michiyo I, Yoshitane S, et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 on rat vascular smooth muscle cells by pro-inflammatory cytokine.Atherosclerosis, 1993,104(1):61
3 曾国钱，林 峰，王雪松，等.欧芹素乙和异欧芹素乙对兔血小板聚集及兔血小板内血栓素B2、环腺苷酸水平的影响.第二军医大学学报,1993,14(4):369
4 嵇 扬，曾国钱，孙笃新.药物对TNF诱导的牛脑微血管平滑肌细胞增殖的拮抗作用.药学学报，1994,29(2):86
5 孙笃新，曾国钱，沈有安，等.牛脑微血管内皮细胞的体外培养及形态学观察.第二军医大学学报,1992,13(2):178
, http://www.100md.com
6 Bath PMW, Booth RFG, Hassall DG.Monocyte-lymphocyte discrimination in a new microtitre-based adhesion assay. Immunol Methods,1989,118(1):59
7 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis——an update. N Engl J Med,1986,314(8):488
8 Mori E, Zoopo GJD,Chambers JD，et al. Inhibition of polymorphonuclear leukocyte adherence suppresses no-reflow after focal cerebral ischemia in baboons. Stroke,1992,23(5):712
9 余祥彬，刘锡均，钱定华，等.肿瘤坏死因子对牛肺动脉内皮细胞的损伤及蛋白激酶C抑制剂的抑制作用.药学学报,1996,31(3):176
(1997-07-03收稿，1997-11-14修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：肿瘤坏死因子；内皮细胞；单核细胞；细胞粘连；欧芹素乙
第二军医大学学报980217
摘要 目的：研究肿瘤坏死因子(TNF)对体外培养的牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)与单核细胞(MNCs)粘附的影响及欧芹素乙(IMP)的拮抗作用。方法：通过测定MNCs中髓过氧化物酶活性的方法，对粘附于BCMEC单层上的MNCs进行定量。结果：TNF在5～250 U/ml时呈剂量依赖性地诱导BCMEC与MNCs的粘附，TNF浓度为100 U/ml时促粘附达最大值(61.0%)。TNF与内皮细胞共育1 h，即可明显促进粘附作用(55.7%)，2 h时达最大刺激效应(62.8%)。IMP在浓度为0.1～10.0 μmol/L时，呈剂量依赖性地拮抗TNF诱导的粘附作用，在10.0 μmol/L时抑制率达90.3%。结论：IMP具有抑制由TNF诱导的BCMEC与MNCs粘附的作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 543.5
Inhibitory effects of imperatorin on TNF induced adhesion reaction of BCMEC with monocytes
Chu Zhiyong, Gong Chungui, Rui Yaocheng (Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study inhibitory effect of imperatorin(IMP) on tumor necrosis factor (TNF) induced adhesion reaction of cultured bovine cerebromicrovascular endothelial cell (BCMEC) with monocytes in vitro.Methods:The assay was based on the measurement of the myeloperoxidase activity in monocytes that had adhered to BCMEC layers.Results:At concentrations from 5 to 250 U/ml,TNF was shown to induce adhesion reaction of cultured BCMEC with monocytes in a dose-dependent manner.The effect of TNF reached maximum (61.0%) at 100 U/ml.After 1 h incubation of BCMEC,addition of TNF significantly stimulated the adhesion reaction of BCMEC with monocytes(55.7%).After 2 h incubation the effect reached maximum(62.8%),then the effect slightly decreased.At concentrations from 0.1 to 10.0 μmol/L,IMP was found to antagonize induced adhesion reaction.Its maximal rate of inhibition was 90.3% at 10.0 μmol/L.Conclusion:IMP may decrease the TNF induced adhesion reaction of BCMEC with monocytes.
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Key words tumor necrosis factor; endothelial cells; monocytes; cell adhesion; imperatorin
动脉内皮损伤、中膜平滑肌细胞移行至内膜并大量增殖，以及血小板和单核细胞与血管内皮细胞粘附及浸润在动脉粥样硬化形成早期起着关键性作用[1,2]。欧芹素乙(imperatorin,IMP)为中药欧前胡和白芷根部的有效成分，具有抗炎作用，还可抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集[3]及肿瘤坏死因子(TNF)诱导的牛脑微血管平滑肌细胞增殖[4]，但IMP对TNF诱导的牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)与单核细胞的粘附的影响尚未见报道。本研究用体外培养的BCMEC，观察TNF对内皮细胞与单核细胞粘附的影响及IMP的拮抗作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 IMP由本院植物化学教研室提供；TNF由日本Dainippon制药公司Sohmura博士赠送；MEM培养基为美国Gibco公司产品；胶原酶Ⅱ型为美国Sigma公司产品；溴化十六碳烷基三甲铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HTAB)为上海化学试剂站分装厂进口分装；邻-联茴香胺盐酸盐(o-dianisidine dihydrochloride,DD)为北京化工厂产品。
, 百拇医药
1.2 BCMEC 细胞培养按孙笃新等[5]方法进行。细胞长成致密单层后，倒置相差显微镜下可见细胞呈卵石样外观，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性，表明为脑血管内皮细胞。
1.3 牛血单核细胞的分离 新鲜小牛全血参照Bath等[6]建立的方法分离，得到混有一定量淋巴细胞的单核细胞，用Hanks液调整细胞数为5×106个/ml，备用。
1.4 测定TNF对内皮细胞与单核细胞粘附的影响 生长致密的3～5代BCMEC经消化制成细胞悬液，以1.5×104个/孔接种于96孔培养板，置37℃，5% CO2孵箱中孵育48 h，长成致密单层。加入不同剂量TNF(5,50,100及250 U/ml)，继续孵育不同时间(1,2,4及6 h)后取出。加入单核细胞悬液前，用预热的Hanks液小心冲洗内皮细胞4次，然后每孔加入单核细胞悬液100 μl(5×105个/孔)，置37℃，5% CO2孵箱中孵育30 min。小心吸出未结合的单核细胞，并用预热的含0.1% BSA的磷酸盐缓冲液轻轻荡洗，用Bath等[6]建立的测定髓过氧化物酶(MPO)活性的方法对结合的单核细胞进行定量测定。
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1.5 MPO活性的测定 改良Bath等[6]测定MPO活性的方法。每孔加入1% HTAB溶液50 μl，置37℃，5% CO2孵箱中孵育45 min。取出，每孔加入预热至37℃的DD+H2O2反应液250 μl，置孵箱中孵育20 min，酶联仪测定450 nm处光密度。内皮细胞、淋巴细胞不含MPO，因此所测出的MPO活性将反映粘附的单核细胞。粘附细胞MPO活性用实测的MPO活性与每孔加入单核细胞MPO总活性的百分比来表示。
1.6 测定IMP对粘附作用的影响 在加入TNF刺激之前，加入不同浓度的IMP与内皮细胞单层共育一段时间，其他操作同上，测定MPO活性，计算药物抑制率。
抑制率(%)=(TNF粘附率-药物粘附率/TNF粘附率-基础粘附率)×100%
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1 TNF刺激内皮细胞与单核细胞粘附的时效曲线 研究结果显示，TNF 100 U/ml刺激1 h即可明显诱导内皮细胞与单核细胞粘附，粘附率为(55.7±2.5)%， 2 h的粘附率达高峰(62.8±1.4)%。4， 6 h的粘附率则分别为(61.5±3.5)%以及(61.1±4.0)%，与2 h相比略有下降，但差别不明显。为便于实验，选择4 h作为TNF刺激时间(表1)。
2.2 TNF刺激粘附的量效曲线 TNF刺激内皮细胞单层4 h后，加入单核细胞。结果表明，TNF浓度为0，5, 50, 100, 250 U/ml时，内皮细胞与单核
表1 TNF刺激粘附的时效曲线
Tab 1 Time-dependent effect of TNF induced mono-
cytes adhesion to endothelial cells in vitro(n=3,
±s) Time, http://www.100md.com
(t/h)
TNF
(λB/U*ml-1)
Adherence rate
(%)
0
0
46.2±1.8
1
100
55.7±2.5**
2
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100
62.8±1.4**
4
100
61.5±3.5**
6
100
61.1±4.0**
**P<0.01 vs 0 h
细胞的粘附率分别为(43.2±2.1)%,(52±3.7)%(P<0.05)， (58.2±2.5)% (P<0.01)，(61.0±2.1)%(P<0.001)，(59.0±2.0)%(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 IMP对TNF诱导内皮细胞与单核细胞粘附的影响 内皮细胞单层先与不同浓度的IMP共育4 h后，再用浓度为100 U/ml的TNF刺激4 h，加入单核细胞悬液，测定MPO活性。结果显示，IMP浓度为0.1～10.0 μmol/L时呈剂量依赖性地显著抑制TNF诱导的内皮细胞与单核细胞粘附，当IMP浓度为0.1, 1.0及10.0 μmol/L时，抑制率分别为30.9%,57.8%及90.3%(表2)。
表2 IMP对TNF诱导内皮细胞与单核细胞粘附的影响
Tab 2 Dose-dependent effect of IMP on TNF induced
monocytes adhesion to endothelial cells in vitro(n=3,
±s) IMP, 百拇医药
(CB/μmol*L-1)
TNF
(λB/U*ml-1)
Adherence
rate(%)
Inhibition
rate(%)
0
0
41.2±5.2
0
, 百拇医药
100
54.5±1.3**
0.1
100
50.4±2.2△
30.9
1.0
100
46.8±3.1△
57.8
10.0
100
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42.5±4.6△△
90.3
**P<0.01 vs 0 U/ml TNF; △P<0.05,△△P<0.01 vs 100 U/ml TNF
3 讨 论
单核细胞与内皮细胞的粘附在动脉粥样硬化、脑卒中等形成过程中起重要作用。在喂养高胆固醇的动物模型上，几周内可观察到单核细胞粘附到血管内皮上，接着单核细胞浸润到血管内膜并摄取胆固醇，转化为富含脂质的巨噬细胞，形成脂质条纹，这是最早形成的动脉粥样硬化斑块[7]。Mori等[8]研究表明，白细胞粘附于血管内皮可导致脑缺血再灌流后无再流，造成脑组织坏死，用CD18单克隆抗体阻断白细胞粘附于管壁内皮，使微血管流通，可防止脑组织坏死，因此研究单核细胞与内皮细胞的粘附具有重要意义。测定单核细胞的方法有几种，如人工计数选择性染色的细胞、测定细胞的DNA含量等，但这些方法不能对粘附到内皮细胞上的单核细胞进行定量测定。Bath等[6]建立的测定单核细胞MPO活性的方法，能够测定粘附在内皮细胞单层上的单核细胞，而不受混杂淋巴细胞及内皮细胞单层的影响，重现性较好。
, 百拇医药
TNF是一类具有广泛生物活性的炎性介质，在免疫、肿瘤等疾病的病理过程中具有重要作用。近年来发现TNF可促进平滑肌细胞增殖[4]；同时也可直接损伤内皮细胞[9]，提示TNF在动脉粥样硬化及其他心血管疾病中起一定作用。本研究表明，TNF对培养的BCMEC与单核细胞的粘附具有明显促粘附作用，提示TNF在脑动脉粥样硬化、脑卒中等心脑血管疾病中可能有重要作用。因而，寻找拮抗TNF作用的药物，在心脑血管疾病的防治中有应用前景。
IMP是从植物中提取的有效成分，以往的研究表明，IMP能抑制TNF诱导的血管平滑肌细胞增殖，本研究又证实IMP可抑制TNF诱导的血管内皮细胞与单核细胞的粘附，进一步表明IMP可通过不同途径影响心脑血管疾病的致病因素，提示IMP在心脑血管疾病的防治中可能有重要意义。
参 考 文 献
1 Johan F ,Ruihua W,Anders H, et al. Mononuclear leukocytes exposed to oxidized low density lipoprotein secrete a factor that stimulates endothelial cells to express adhesion molecules. Atherosclerosis,1993,103(2):213
, http://www.100md.com
2 Uichi I, Michiyo I, Yoshitane S, et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 on rat vascular smooth muscle cells by pro-inflammatory cytokine.Atherosclerosis, 1993,104(1):61
3 曾国钱，林 峰，王雪松，等.欧芹素乙和异欧芹素乙对兔血小板聚集及兔血小板内血栓素B2、环腺苷酸水平的影响.第二军医大学学报,1993,14(4):369
4 嵇 扬，曾国钱，孙笃新.药物对TNF诱导的牛脑微血管平滑肌细胞增殖的拮抗作用.药学学报，1994,29(2):86
5 孙笃新，曾国钱，沈有安，等.牛脑微血管内皮细胞的体外培养及形态学观察.第二军医大学学报,1992,13(2):178
, http://www.100md.com
6 Bath PMW, Booth RFG, Hassall DG.Monocyte-lymphocyte discrimination in a new microtitre-based adhesion assay. Immunol Methods,1989,118(1):59
7 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis——an update. N Engl J Med,1986,314(8):488
8 Mori E, Zoopo GJD,Chambers JD，et al. Inhibition of polymorphonuclear leukocyte adherence suppresses no-reflow after focal cerebral ischemia in baboons. Stroke,1992,23(5):712
9 余祥彬，刘锡均，钱定华，等.肿瘤坏死因子对牛肺动脉内皮细胞的损伤及蛋白激酶C抑制剂的抑制作用.药学学报,1996,31(3):176
(1997-07-03收稿，1997-11-14修回), http://www.100md.com